KR20010040448A

KR20010040448A - 티오레독신 또는 티오레독신 환원효소의 유전자와상보적인 올리고뉴클레오 타이드 서열 및 이들을 사용하는세포성장 조절 방법

Info

Publication number: KR20010040448A
Application number: KR1020007008279A
Authority: KR
Inventors: 라이트짐에이.; 영아이핑에이치; 리윤에스.
Original assignee: 진센스 테크놀로지즈 인코포레이티드
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2001-05-15
Also published as: BR9907990A; CA2319710A1; CN1302107C; EP1049772A1; IL137177A0; AU2261299A; WO1999038963A1; AU760396B2; JP2002501743A; US6566514B1; CN1294630A

Abstract

본 발명은 포유류 내에서 종양세포의 성장을 조절하는 티오레독신 및 티오레독신 환원효소의 유전자와 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 사용하여 포유류의 종양세포의 성장을 억제하는 방법 및 약리학적으로 수용 가능한 부형제와 본 발명의 화합물을 유효량으로 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.

Description

티오레독신 또는 티오레독신 환원효소의 유전자와 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 및 이들을 사용하는 세포성장 조절 방법 {OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES COMPLEMENTARY TO THIOREDOXIN OR THIOREDOXIN REDUCTASE GENES AND METHODS OF USING SAME TO MODULATE CELL GROWTH}

〈110〉 GENESENSE TECHNOLOGIES, INC.

〈120〉 OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES COMPLEMENTARY TO THIOREDOXIN AND THIRED

OXIN REDUCTASE GENES AND METHODS OF USING SAME TO MODULATE CELL G

ROWTH

〈130〉 IPP000268CA

〈150〉 US 60/073,196

〈151〉 1998-01-30

〈160〉 74

〈170〉 KOPATIN 1.5

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Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys

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Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys

35 40 45

Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp

50 55 60

Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe

65 70 75 80

Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys

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본 명세서에서는 하기 참고 문헌, 특허 출원, 및 특허를 윗첨자로 표기하여 인용하였다:

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상기 참고 문헌, 특허 출원, 및 특허는 각각 독립적으로 본 발명에 참고로 인용되었다.

티오레독신은 본래 DNA 합성에 필수적인 리보뉴클레오타이드 환원효소에 대한 환원 보조인자로서 동정된 보편적인 작은 산화환원 단백질이다¹. 티오레독신 및 티오레독신 환원효소는 티오레독신 시스템을 포함한다. 티오레독신은 다른 단백질을 환원시켜 그들의 기능에 영향을 주는 단백질이며, 티오레독신 환원효소는 이러한 티오레독신을 환원시키기 위하여 양자 도너로서 NADPH를 사용하는 플라보효소를 함유하는 셀레노시스테인(selenocysteine)이다.

최근에는, 기타 다양한 생화학적 경로를 통해 포유류의 티오레독신을 설명하고 있다. 예를 들면, 티오레독신은 DNA의 결합 특성을 변화시키는 디티올 디설파이드의 교환을 통해 전사인자의 산화환원 특성을 조절한다. NF-κB³, BZLFI⁴, 및 TFⅢC⁵와 같은 전사인자는 직접적으로 전사를 조절하는 반면, AP-1 활성화는 티오레독신에 의하여 추가 환원되는 핵의 산화환원 인자 Ref-1을 통해 간접적으로 조절한다⁶. 또한, 티오레독신은 디설파이드-함유 단백질의 리폴딩(refolding) 촉진, 글루코코르티코이드 또는 백혈소간-2-리셉터 활성화, 마크로파지내 인간의 면역결핍성 바이러스의 발현 억제, H₂O₂환원, 자유라디칼 제거, 산화성 공격에 대한 세포의 보호, 및 초기 임신 인자(early pregnancy factor)로서의 기능을 하는 것으로 밝혀졌다.

클로닝된 인간의 티오레독신은 HTLV-1 변형 T-세포에 의하여 방출되는 성인의 T-세포 백혈병-유도 인자로 불리는 성장인자와 유사하다는 사실이 밝혀졌다⁷. 이들은 분비 경로를 이용한다. 세포외적으로 발현되는 티오레독신은 정상 섬유아 세포, 임파 세포, 및 인간의 다양한 충실성 종양(solid cancer) 세포주의 증식을 촉진한다^{8 ＆ 9}. 산화환원-불활성 형태는 성장 촉진을 위해서는 티오레독신의 산화환원 활성이 필요하다⁹는 사실을 확인하는데 사용되었다. 티오레독신은 세포를 다른 성장인자에 대하여 민감하게 만듦으로써 간접적으로 성장 촉진을 유도하는 것으로 보고되었으며¹⁰, 그후 티오레독신이 폐, 결장, 자궁경부, 및 간세포 암종과 같은 몇몇 1차 종양에서 과대-발현한다는 사실이 보고되었다^11-14. 또한, 정상타입의 티오레독신 cDNA가 트랜스펙션된 인간 유방암 세포에서는 종양의 성장이 증대되었으며¹⁵, 생체내 자발적인 세포자멸사가 감소되었고¹⁶, 다양한 항암 치료제에 의하여 유도되는 세포자멸사에 대한 감수성이 감소된다는 사실이 확인되었다¹⁶. 반면, 네거티브-우세 산화환원-불활성 돌연변이 티오레독신이 트랜스펙션된 세포의 경우에는 실험관내 정착-비의존성 성장이 감소되고, 생체내 종양의 성장이 억제되는 것으로 나타났다¹⁵.

티오레독신 환원효소는 다양한 인간 종양에 의하여 과대-발현되는 것으로 밝혔다¹². 항종양 퀴논^{17 ＆ 18}, 니트로소우레아¹⁹, 및 13-시스-레티노산²⁰은 티오레독신 시스템의 활성을 감소시킴으로써 성장억제 활성을 제공하여 세포의 티오레독신 환원효소를 억제하는 것으로 밝혀졌다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 mRNA와의 서열-특이적 혼성화를 통해 표적-특이적 방식으로 유전자의 발현을 억제하는데 사용되어 왔다². 안티센스 올리고뉴클레오타이드-매개 종양유전자의 억제는 이러한 화합물이 종양 생성을 제어하는 메커니즘을 동정하는데 유용할 수 있으며²¹, 암 치료를 위한 새로운 치료제²²로서의 가능성을 보여주었다. 따라서, 감수성이 크고 독성이 작은 티오레독신 또는 티오레독신 환원효소의 발현을 억제하는 티오레독신 및 티오레독신 환원효소와 관련된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 동정하는 것이 바람직하다.

본 발명은 포유류 내에서 종양세포의 성장을 조절하는 티오레독신 또는 티오레독신 환원효소의 유전자와 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 사용하여 포유류의 종양 세포의 성장을 억제하는 방법 및 약리학적으로 수용 가능한 부형제 및 본 발명의 화합물을 유효량으로 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.

도 1a는 다음과 같은 다양한 세포주의 티오레독신 mRNA에 대한 노던 블롯의 자동 방사선 사진: 정상적인 인간 태아의 폐 세포주(WI-38), 섬유육종(HT-1080), 폐 암종(A549), 난소 선암(SK-OV-3), 간세포 암종(Hep G2), 흑색종(C8161), 유방 선암(MDA-MB-231), 전이성 췌장 선암(AsPC-1), 결장 선암(HT-29), 자궁경부 암종(HeLa S3).

도 1b는 다양한 세포주에서 발현되는 티오레독신 단백질의 웨스턴 블롯의 사진으로서, 하위 패널은 각 레인에 로딩된 전체 단백질.

도 2는 티오레독신의 cDNA 서열[SEQ ID NO: 67 및 68]로서, 26종류의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 어닐링되는(annealed) 혼성화 자리가 표시됨.

도 3a 내지 도 3f는 티오레독신 cDNA와 상보적인 26종류의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리한 후, 다음과 같은 다양한 인간 암 세포주의 콜로니 형성 능력에 대한 억제율(%)을 도시한 그래프: 인간 결장암 HT-29(도 3a), 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231(도 3b), 인간 간암 세포주 HepG2(도 3c), 인간 흑색종 세포주 A2058(도 3d), 인간 난소암 세포주 SK-OV-3(도 3e), 및 인간 폐암 세포주 A549(도 3f).

도 4a는 티오레독신 mRNA와 상보적인 6종류의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 처리된 후, 인간 간암 세포주 HepG2 내에서의 티오레독신 mRNA의 감소 수준을 비처리 세포주 내에서의 mRNA의 수준에 대한 분율(%)로 도시한 그래프.

도 4b는 티오레독신 mRNA와 상보적인 6종류의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 처리된 후, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 내에서의 티오레독신 mRNA의 감소 수준을 비처리 세포주 내에서의 mRNA 수준에 대한 분율(%)로 도시한 그래프.

도 5a는 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 처리된 후, 인간 결장암 세포주 HT-29에서 발현된 티오레독신 단백질의 수준을 보여주는 웨스턴 블롯의 사진.

도 5b는 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 처리된 후, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231에서 발현된 티오레독신 단백질의 수준을 보여주는 웨스턴 블롯 사진.

도 5c는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 2601[SEQ ID NO: 1]가 처리된 후, 인간 결장암 세포주 HT-29, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231, 및 인간 간암 세포주 HepG2에서 발현된 티오레독신 단백질의 수준을 보여주는 웨스턴 블롯의 사진으로서, 하위 패널은 단백질이 패널 전반에 걸쳐 일정하게 로딩되었음을 보여주고 있음.

도 6a는 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 격일로 매일 정맥내 주입한 후, 시간에 따른 누드 마우스내 종양의 크기 도표.

도 6b는 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 격일로 매일 정맥내 주입한 후 대략 10일 된 누드 마우스로부터 분리한 종양의 중량 도표.

도 6c는 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 격일로 매일 정맥내 주입한 후 대략 10일 된 누드 마우스로부터 절제한 인간 결장암 HT-29 종양 내에서의 티오레독신 단백질의 발현 수준을 보여주는 웨스턴 블롯의 사진으로서, 인도 잉크로 염색된 브롯의 부분은 단백질 로딩을 보여줌.

도 7은 정해진 종양 세포주 내에서의 티오레독신 환원효소 mRNA의 발현 수준을 보여주는 노던 블롯의 자동 방사선 사진.

도 8a 내지 도 8d는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적인 40종류의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 처리된 후, 다음과 같은 다양한 암 세포주의 콜로니 형성 능력에 대한 억제율(%)을 도시한 그래프: 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231(도 8a), 인간 흑색종 세포주 A2058(도 8b), 및 인간 췌장암 세포주 SU.86.86(도 8d).

도 9a 및 도 9b는 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 처리된 후, 인간 결장암 세포주 HT-29(도 9a) 및 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231(도 9b) 내에서의 티오레독신 환원효소 mRNA의 발현 수준을 비처리 세포주 내에서의 mRNA 수준에 대한 분율(%)로 도시한 그래프.

도 10은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 3014 및 3037[SEQ ID NO: 40 및 63]이 처리된 후, 인간 췌장암 세포주 AsPC-1 내에서의 티오레독신 환원효소 mRNA의 발현 수준을 도시한 그래프.

도 11a는 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 격일로 매일 정맥내 주입한 후, 시간에 따른 누드 마우스내의 인간 종양의 크기 도표.

도 11b는 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 격일로 매일 정맥내 주입한 후 대략 10일 된 누드 마우스로부터 분리한 종양의 중량 도표.

도 12는 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 격일로 매일 정맥내 주입한 후 대략 10일 된 누드 마우스로부터 절제한 인간 결장암 HT-29 정양 내에서의 티오레독신 환원효소의 단백질 발현 수준을 보여주는 웨스턴 블롯의 사진.

본 발명은 포유류의 종양세포에서 티오레독신 및 티오레독신 환원효소의 유전자 발현을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 포유류 내에서 종양세포의 성장 및 전이를 억제하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 조성물의 관점에서 본 발명은 포유류의 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 뉴클리아제 내성일 수 있으며, 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 가질 수 있다. 또한, 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적이지 않은 추가의 뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다.

조성물의 다른 관점에서, 본 발명은 서열 2601-2626[SEQ ID NO: 1-26]으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 약 17개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.

조성물의 다른 관점에서, 본 발명은 서열 3001-3040[SEQ ID NO: 27-66]으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 약 17개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.

조성물의 또 다른 관점에서, 본 발명은 약리학적으로 수용 가능한 부형제 및 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제 조성물에 관한 것으로서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 포유류의 티오레독신 유전자 또는 티오레독신 환원효소의 유전자와 상보적인 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

조성물의 또 다른 관점에서, 본 발명은 약리학적으로 수용 가능한 부형제 및 약 17개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제 조성물에 관한 것으로서, 이때 상기 올리고뉴클레오타이드는 표 1에 설정된 서열 2601-2626[SEQ ID NO: 1-26]으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.

또 다른 조성물의 관점에서, 본 발명은 약리학적으로 수용 가능한 부형제 및 약 20개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제 조성물에 관한 것으로서, 이때 상기 올리고뉴클레오타이드는 표 2에 설정된 서열 3001-3040[SEQ ID NO: 27-66]으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.

방법적인 면에서, 본 발명은 종양의 성장이 억제되는 조건하에서 종양을 가지고 있는 포유류에 포유류의 티오레독신 유전자와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 포유류의 종양의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 화학치료제와 함께 투여될 수 있다.

방법에 관한 다른 관점에서, 본 발명은 종양의 성장이 억제되는 조건하에서 종양을 가지고 있는 포유류에 포유류의 티오레독신 환원효소의 유전자와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 포유류의 종양의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 화학치료제와 함께 투여될 수 있다.

방법에 관한 다른 관점에서, 본 발명은 종양의 전이가 억제되는 조건하에서 전이성 종양을 가지고 있는 포유류에 포유류의 티오레독신 유전자와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 포유류의 종양전이를 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 화학치료제와 함께 투여될 수 있다.

방법에 관한 또 다른 관점에서, 본 발명은 종양의 전이가 억제되는 조건하에서 전이성 종양을 가지고 있는 포유류에 포유류의 티오레독신 환원효소의 유전자와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 포유류의 종양전이를 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 화학치료제와 함께 투여될 수 있다.

정 의

본 명세서에 사용되는 용어들은 하기의 의미를 갖는다:

본 명세서에 사용되는 "안티센스 올리고뉴크레오타이드"란 원하는 mRNA와 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 mRNA의 번역되지 않는 5'-부분과 상보적일 수 있으리라 여겨진다.

"올리고뉴클레오타이드"란 천연 염기, 당, 및 당(골격)간 결합으로 이루어지는 뉴클레오타이드의 올리고머 또는 폴리머, 또는 뉴클레오사이드의 모노머를 의미하는 것으로서, 기능이 유사한 인공 모노머 또는 이들의 부분을 포함하는 변형 또는 치환된 올리고머도 포함된다. 변형 또는 치환된 올리고머는 세포유입을 증강시키고 뉴클리아제의 존재 하에서 안정성이 크기 때문에 천연 형태보다 바람직할 수 있다. 또한, 화학적으로 상이한 둘 이상의 부분을 함유하는 키메라 올리고뉴클레오타이드도 본 발명의 "올리고뉴클레오타이드"의 의미에 포함된다. 예를 들면, 키메라 올리고뉴클레오타이드는 유용한 특성(예를 들면, 높은 뉴클리아제 내성 및 세포유입)을 부여하는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 부분을 함유할 수 있으며, 본 발명에 따르는 둘 이상의 올리고뉴클레오타이드를 결합시켜 키메라 오리고뉴클레오타이드를 만들 수도 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보핵산 또는 데옥시리보핵산일 수 있으며 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 및 우라실을 포함하는 천연 또는 합성 염기 모노머일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같은 변형 염기를 함유할 수도 있다: 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 기타 알킬 아데닌, 5-할로 우라실, 5-할로 사이토신, 6-아자 우라실, 6-아자 사이토신, 및 6-아자 티민, 슈도 우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티올알킬 아데닌, 8-히드록시 아데닌 및 기타 8-치환 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티올알킬 구아닌, 8-히드록시 구아닌 및 기타 8-치환 구아닌, 기타 아자 및 데아자 우라실, 티미딘, 사이토신 또는 구아닌, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 사이토신. 또한, 메틸기, 에틸기, 프로필기와 같은 그 밖의 화학기를 당, 염기, 또는 골격 성분을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 다양한 부분에 부착시키는 변형도 가능하다.

또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트 골격, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬의 당간 결합내 또는 단쇄 이종원자 또는 단쇄 이종원자고리의 당간 결합내에 변형된 인 산소 이종원자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 및 모르폴리노(morpholino) 올리고머를 함유할 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 4개 내지 6개의 3'-말단 뉴클레오타이드 사이에 연결된 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 다른 실시예에서, 포스포로티오에이트 결합은 모든 뉴클레오타이드를 연결시킨다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당 유사체(mimetics)를 포함할 수도 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오타이드의 구조가 근본적으로 변형된 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드의 예로는 DNA(또는 RNA) 내의 데옥시리보스(또는 리보스) 포스페이트 골격이 펩타이드에서 발견되는 것과 유사한 폴리아미드 골격으로 교체된 펩타이드 핵산(PNA)이 있다(Nielsen et al.²⁹; Good and Nielsen³⁰; Buchardt, deceased, et al.³¹, U.S. Patent No. 5,766,855; Buchardt, deceased, et al.³², U.S. Patent No. 5,719,262). PNA 유사체는 효소에 의한 분해에 대하여 내성을 가지며 생체내 또는 실험관내에서 긴 수명을 가지는 것으로 밝혀졌다. 또한, PNA 가닥은 DNA 가닥에 대한 전하 반발력이 작기 때문에 상보적인 DNA 서열에 대하여 천연 핵산 분자보다 강하게 결합한다.

또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 폴리머 골격, 환형 골격, 또는 비환형 골격의 기타 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오타이드는 모르폴리노 골격구조를 포함할 수 있다(U.S. Patent No. 5,034,506³³).

본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 DNA 및 RNA 뉴클리아제에 의한 분해에 민감하지 않도록 변형시키거나, 자체에 DNA 및 RNA 뉴클리아제로부터 올리고뉴클레오타이드를 보호하는 운반체를 포함시키면 "뉴클레아제 내성"이 된다. 뉴클리아제 내성 올리고뉴클레오타이드의 예로는 메틸 포스페이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 및 모르폴리노 올리고머가 있다. 뉴클리아제 내성을 부여하는 적당한 운반체의 예로는 리포좀이 있다.

또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 특성을 개선시키는 기 또는 올리고뉴클레오타이드는 또한 올리고뉴클레오타이드의 약역학 특성을 개선시키는 기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 형광 염료 또는 방사능 표지와 같은 리포터 그룹 또는 표지를 함유하지 않는 것이 바람직하다. 이중쇄 형태, 헤어핀 형태, 및 호모올리고머/서열 반복의 가능성은 작고, 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA 서열 각각에 대한 결합 가능성이 큰 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소 mRNA와 상보적인 서열로부터 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 특성은 컴퓨터 모델링 프로그램 OLIGO Primer Analysis Software, Version 5.0(National Biosciences, Inc., Plymouth, MN)을 사용하여 측정할 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 다섯 가지의 파라미터를 정량 분석한다.

또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 둘 이상의 포유류 사이에서 티오레독신 또는 티오레독신 환원효소의 유전자 보존 수준이 높은 서열을 기준으로 선택할 수도 있다. 이러한 특성은 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 데이터베이스를 사용하는 University of Wisconsin Computer group(GCG) 소프트웨어(Devereux J. et al.³⁵)의 BLASTN 프로그램(Altschul, et al.³⁴)을 사용하여 측정할 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 치환, 삽입, 및 결실과 같은 돌연변이를 포함할 수 있으나, 그 함량이 10% 이하인 것이 바람직하다.

일반적으로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 약 3개, 바람직하게는 약 3개 내지 100개, 더욱 바람직하게는 약 3개 내지 50개, 가장 바람직하게는 약 17개 내지 35개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하기 표 1 및 표 2에 설정된 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

〈 표 1 〉

인간 티오레독신 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는

안티센스 올리고뉴클레오타이드

〈 표 2 〉

인간 티오레독신 환원효소의 mRNA 서열과 상보적인

안티센스 올리고뉴클레오타이드

표 1 및 표 2에서 "Tm"은 열역학적으로 가장 근사한 값으로 측정한 올리고뉴클레오타이드 이중쇄의 녹는점이다. 이 온도에서 핵산 분자의 50%는 이중쇄 상태로 남아 있게되고 나머지 50%는 변성된다. "ΔG"는 올리고뉴클레오타이드의 자유에너지로서, 이는 올리고뉴클레오타이드 이중쇄의 안정성에 대한 측정값이다.

"알킬"이란 1개 내지 20개의 탄소원자, 바람직하게는 1개 내지 6개의 탄소원자를 가지는 1가 알킬기를 의미한다. 이러한 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, iso-부틸, n-헥실 등이 있다.

"아릴"이란 6개 내지 14개의 탄소원자로 이루어지는 단일 고리(예를 들면, 페닐) 또는 다중 응축(융합) 고리(예를 들면, 나프틸 또는 안드릴)를 가지는 불포화 방향족 탄소고리 그룹을 의미한다.

"시클로알킬"이란 3개 내지 20개의 탄소원자로 이루어지는 단일 고리 또는 다중 응축 고리를 가지는 환형 알킬기를 의미한다. 이러한 시클로알킬기의 예로는 단일 고리구조의 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 및 시클로옥틸 등과 다중 고리구조의 아다만태닐(adamantanyl) 등이 있다.

"할로" 또는 "할로겐"이란 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도를 의미하며, 플루오로 또는 클로로가 바람직하다.

"티올"이란 -SH기를 의미한다.

하나 이상의 치환기를 함유하는 상기 그룹들과 같이, 이러한 그룹들은 입체적으로 구현될 수 없거나 손쉽게 합성될 수 없는 치환 또는 기환 패턴을 함유하지 않는다는 점을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 화합물은 이러한 화합물을 치환시켜 만든 모든 입체화학적 이성질체를 포함한다.

"약리학적으로 수용 가능한 염"이란 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 생물학적 효능 및 특성을 가지며, 바람직하지 못한 생물학적 특성 또는 기타의 특성을 갖지 않는 염을 의미한다. 많은 경우, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 아미노기 및/또는 카르복시기 또는 이들과 유사한 기의 존재에 의하여 산성 및/또는 염기성 염을 형성할 수 있다.

약리학적으로 수용 가능한 염기 첨가 염은 무기염기 및 유기염기로부터 제조될 수 있다. 무기염기로부터 유래되는 염의 예로는 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 및 마그네슘 염이 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 유기염기로부터 유래되는 염으로는 다음과 같은 것들이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다: 아민 상의 적어도 2개의 치환기가 서로 상이하고 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐시클로알킬, 치환 시클로알킬, 시클로아케닐, 치환 시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알킬 아민, 디알킬 아민, 트리알킬 아민, 치환 알킬 아민, 디(치환 알킬) 아민, 트리(치환 알킬) 아민, 알케닐 아민, 디알케닐 아민, 트리알케닐 아민, 치환 알케닐 아민, 디(치환 알케닐) 아민, 트리(치환 알케닐) 아민, 시클로알킬 아민, 디(시클로알킬) 아민, 트리(시클로알킬) 아민, 치환 시클로알킬 아민, 디치환 시클로알킬 아민, 트리치환 시클로알킬 아민, 시클로알케닐 아민, 디(시클로알케닐) 아민, 트리(시클로알케닐) 아민, 치환 시클로알케닐 아민, 디치환 시클로알케닐 아민, 트리치환 시클로알케닐 아민, 아릴 아민, 디아릴 아민, 트리아릴 아민, 헤테로아릴 아민, 디헤테로아릴 아민, 트리헤테로아릴 아민, 헤테로사이클 아민, 디헤테로사이클 아민, 트리헤테로사이클 아민, 혼합 디아민 및 트리아민의 1차, 2차, 및 3차 아민 염. 또한, 2개 또는 3개의 치환기가 아미노 질소와 함께 헤테로사이클 또는 헤테로아릴 아민도 포함된다.

적합한 아민의 예로는 다음과 같은 것들이 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다: 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리(이소-프로필)아민, 트리(N-프로필)아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트리메타민, 라이신 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로페인, 히드라바민, 콜히친, 베테인(betaine), 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 트레오브롬, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, 모르폴린, N-에틸피페리딘 등. 또한, 카르복사미드, 저급 알킬 카르복사미드, 디알킬 카르복사미드 등을 포함하는 카르복시산 아미드와 같은 기타 카르복시산 유도체들도 본 발명에 유용할 수 있다.

약리학적으로 수용 가능한 산 첨가 염은 무기산 및 유기산으로부터 제조할 수 있다. 무기산으로부터 유래되는 염의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등이 있으며, 유기산으로부터 유래되는 염의 예로는 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, ρ-톨루엔-술폰산, 살리실산 등이 있다.

"티오레독신 유전자"란 리보뉴클레오타이드 환원효소 또는 메티오닌 술폭사이드 환원효소를 위한 수소 도너로 작용할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 티오레독신 유전자는 NF-κB, BZLFI, TFⅢC, 및 AP-1과 같은 전사 인자의 산화환원 특성을 조절할 수 있고 그들의 DNA 결합 특성을 변화시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 것이 바람직하다. 이러한 단백질이 가질 수 있는 다른 기능으로는 디설파이드-함유 단백질의 리폴딩 촉진, 글루코코르티코이드 또는 백혈소간-2 리셉터 활성화, 마크로파지 내에서의 면역결핍성 바이러스 발현 억제, 세포내 H₂O₂환원, 자유 라디칼 제거, 및 산화성 공격에 대한 세포보호의 기능, 및 초기 임신 인자의 필수 성분으로 작용이 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 티오레독신 유전자는 정상 섬유아 세포, 임파 세포, 및 다양한 인간 충실성 종양 세포주의 증식을 촉진할 수 있으며, 인간 종양이 과대발현되는 경우에 종양의 성장을 촉진하고 세포자멸사를 감소시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 것이 바람직하다.

"티오레독신 환원효소 유전자"란 티오레독신의 NADPH-의존성 환원을 촉매할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다.

"상보적"라는 용어는 안티센스 올리고뉴크레오타이드 서열이 표적 서열, 즉 티오레독신 유전자(또는 mRNA) 또는 티오레독신 환원효소 유전자(또는 mRNA)와 결합할 수 있음의 의미한다. 안티센스 올리고뉴크레오타이드 서열은 표적 서열에 대하여 몇몇 염기의 갭 또는 부정합(mismatch)만이 허락되는 적어도 약 75%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 동일성을 가진다. 동일성은 예를 들면 University of Wisconsin Computer group(GCG) 소프트웨어의 BLASTN 프로그램을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기에 기재된 OLIGO 프로그램에 의하여 측정하는 경우, 적어도 45℃의 녹는점, 바람직하게는 적어도 약 50℃의 녹는점, 가장 바람직하게는 적어도 약 55℃의 녹는점을 가지는 티오레독신 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 혼성화 한다.

"성장 억제"란 적어도 한가지 유형의 종양세포의 성장이 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%의 감소되는 것을 의미한다. 종양세포의 성장 감소는 누드 마우스내 종양의 크기 또는 실험관내 콜로니 형성에 대한 종양세포의 무능력을 측정하여 결정할 수 있다.

"포유동물" 또는 "포유류"란 사람, 양, 소, 말, 돼지, 개, 고양이, 생쥐 등을 포함하는 포유류를 의미한다.

"종양의 가능성이 있는 포유류"란 증식성 질환 또는 종양을 가지고 있을 수 있는 포유류, 또는 증식성 질환 또는 종양을 진단받은 포유류, 또는 증식성 질환 또는 종양을 진단 받았던 포유류를 의미한다. 종양은 외과수술로 제거되며, 이 경우에도 약간의 잔류 종양세포가 포유류내에 잠복하고 있을 수 있다.

안티센스 올리고뉴크레오타이드 제조

본 발명의 안티센스 올리고뉴크레오타이드는 종래의 방법 또는 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴크레오타이드는 고체상 합성, 특히 Applied Biosystems Canada Inc.(Canada Mississauga)의 장치와 같은 시판용 장치를 사용하여 제조할 수 있으며, 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 천연 티오레독신 또는 티오레독신 환원효소의 유전자를 효소적으로 분해시켜 제조할 수도 있다.

안티센스 올리고뉴크레오타이드의 분리 및 정제

원하는 경우에는 여과, 추출, 결정화, 칼럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 후(厚)층 크로마토그래피, 저압 또는 고압 액체 크로마토그래피, 또는 이들을 조합한 방법과 같은 적당한 분리법 또는 정제법을 사용하여 본 명세서에 기재된 안티센스 올리고뉴크레오타이드를 효과적으로 분리 및 정제할 수 있다. 물론, 이 밖의 다른 분리법 및 정제법이 사용될 수도 있다.

안티센스 올리고뉴크레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터는 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드 서열을 함유하도록 제작할 수 있다.

당업자는 안티센스 올리고뉴크레오타이드가 바람직하게 전사되는데 필요한 모든 발현요소를 함유하는 벡터를 제작할 수 있다. 따라서, 본 발명은 안티센스 올리고뉴크레오타이드를 코딩하는 서열에 효과적으로 결합된 전사조절 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 적당한 전사 및 번역요소는 박테리아, 균류, 바이러스, 포유류, 또는 곤충의 유전자와 같은 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 적합한 요소의 선택은 선택되는 숙주세포에 따라 좌우된다.

리포터 유전자를 벡터에 포함시킬 수 있다. 적당한 리포터 유전자는 β-갈락토시다제(예를 들면, lacZ), 클로람페니콜, 아세틸-트랜스퍼라제, 개똥벌레 루시퍼라제, 또는 면역글로불린 또는 이들의 부위를 포함한다. 안티센스 올리고뉴크레오타이드의 전사는 리포터 유전자의 발현을 모니터링하여 관찰할 수 있다.

벡터는 당 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 하나를 사용하여 세포 또는 조직에 주입할 수 있다. 이러한 방법들은 Sambrook et al.²⁴; Ausubel et al.²⁵; Chang et al.³⁶; Vega et al.³⁷; 및 Vectors; A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses³⁸에 기재되어 있으며, 예를 들면 재조합 바이러스 벡터의 안정된 또는 과도적 트랜스펙션, 리포펙션, 일렉트로포레이션, 및 감염이 있다.

감염에 의한 핵산 주입은 여러 가지 이점을 제공하는데, 조직의 유형에 대하여 높은 효능 및 특이성이 얻어질 수 있다. 통상적으로, 바이러스는 특정한 유형의 세포에 특이적으로 감염되어 증식한다. 따라서, 생체내 특정한 유형의 세포 또는 조직 또는 세포의 혼합 배지 내에 벡터를 주입하는데는 바이러스의 특이성이 사용될 수 있다. 또한, 바이러스 벡터를 특정한 리셉터 또는 리간드를 가지도록 변형시킴으로써 리셉터 매개 작용을 통한 표적 특이성을 변화시킬 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 불용화될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드를 적당한 담체에 결합시킬 수 있다. 적당한 담체의 예로는 다음과 같은 것들이 있다: 아가로스, 셀루로스, 덱스트란, 세파덱스, 세파로스, 카르복시메틸 셀루로오스 폴리스티렌, 여과지, 이온-교환수지, 플라스틱 필름, 프라스틱 튜브, 유리 비드, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 코폴리머, 아미노산 코폴리머, 에틸렌-말레산 코폴리머, 나일론, 실크 등. 담체의 형태는 튜브, 테스트 플레이트, 비드 디스크, 구형 등일 수 있다.

불용화 올리고뉴클레오타이드는 공지된 화학적 방법 또는 물리적 방법, 예를 들면 시아노겐 브로마이드 커플링법을 사용하여 적당한 불용성 담체와 물질을 반응시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 mRNA를 절단하는 리보자임일 수 있다. 리보자임은 본 발명의 올리고뉴크레오타이드 서열과 상동한 서열 및 mRNA 절단에 필요한 촉매중심을 가지는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상동 리보자임 서열은 티오레독신 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA를 파괴하는 것을 선택할 수 있다. 본 발명에 사용되는 리보자임의 유형은 당 기술분야에 공지된 것으로부터 선택할 수 있다. 몇몇 리보자임은 담배의 링스폿(ringspot) 바이러스의 위성 RNA(sTRSV)의 네거티브 가닥으로부터 유래되는 헤어핀 리보자임, 인트론 Ⅰ그룹, RNase P, 간염 델타 바이러스 리보자임, 및 해머해드 리보자임을 포함하는 구조적 무리로 동정되었다(Sullivan 1994, U.S. Patent No. 5,225,347³⁹). 해머해드 및 헤어핀 리보자임 모티브는 유전자 치료를 위한 mRNA의 트랜스 절단에 가장 보편적으로 사용된다(Sullivan 1994). 본 발명의 용도로는 헤어핀 리보자임이 바람직하다. 일반적으로, 리보자임는 30개 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이에 해당하는 길이를 갖는다.

약 제

안티센스 올리고뉴클레오타이드가 약학적으로 사용되는 경우에는 일반적으로 약제 조성물의 형태로 투여한다. 이러한 화합물은 경구, 직장, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 및 비강내 경로를 포함하는 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 주사용 및 경구용 조성물로 효과적이다. 이러한 조성물은 제약분야에 공지된 방법에 의하여 제조되며 적어도 하나의 활성 화합물을 포함한다. 약제 조성물은 예를 들면 정맥내 투여된다. 약제 조성물은 치료되는 종양에 직접 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서 약리학적으로 수용 가능한 담체 또는 부형제에 결합된 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약제 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물 제조에서, 활성 성분은 일반적으로 부형제와 혼합되거나 부형제로 희석시켜 캡슐, 사시에낭(sachet), 페이퍼, 또는 기타 용기형태의 담체내에 봉합된다. 부형제는 희석제로서 제공되며, 활성 성분을 위한 운반체, 담체 또는 매질로 작용하며, 고체, 반고체, 또는 액체 물질일 수 있다. 따라서, 약제 조성물은 정제, 환약, 분말, 구중정, 사시에낭, 카시에낭(cachet), 엘리시르, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸(고체 또는 액체 매질), 예를 들면 10 중량% 이하의 활성 화합물을 함유하는 연고, 연질 및 경질 젤라틴, 좌약, 살균 주사액, 및 살균포장 분말 형태일 수 있다.

제제의 제조 시에, 활성 화합물은 다른 성분과 혼합하기 전에 분쇄하여 적당한 크기의 입자로 만들어야 하는 경우도 있다. 활성 화합물이 대체로 불용성인 경우에는 보통 200 메쉬 이하의 입자 크기로 분쇄한다. 활성 화합물이 대체로 수용성인 경우에는 제제 내에서 대체로 균일한 분포를 가지도록 예를 들면 약 40 메쉬의 크기로 분쇄하는 것이 일반적이다.

적합한 부형제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 트래거컨트, 겔라틴, 칼슘 실리케이트, 미소결정 셀룰로오스, 폴리비닐필로리덴, 셀루로오스, 살균수, 시럽, 및 메틸 셀루로오스가 있다. 제제는 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일과 같은 윤활제; 습윤제; 에멀젼화제 및 현탁제; 메틸- 및 프로필히드록시-벤조에이트와 같은 보존제; 감미제; 및 향신제와 같은 성분을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 공지된 방법에 의하여 환자에게 투여된 후, 활성 성분이 신속 또는 지속적으로 방출되거나 방출이 지연되도록 조제될 수 있다.

상기 조성물은 단위 용량 형태로 조제하는 것이 바람직하며, 각 단위 용량당 약 3 mg 내지 3 g, 일반적으로는 약 10 mg 내지 1.5 g의 활성성분을 함유하는 것이 바람직하다. "단위 용량 형태"란 사람 또는 기타 포유류의 단위 투여량으로 적당한 물리적으로 분리된 단위를 의미하는 것으로서, 각 단위당 적합한 약제 부형제와 혼합된 바람직한 치료효과를 발휘하는 유효량의 활성성분이 함유된다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 투여량 범위에 걸쳐 효과적이며, 일반적으로는 약리학적 유효량으로 투여된다. 유효량이란 투여 시에 증상을 완화시키는 함량으로서, 종양세포의 성장을 억제할 수 있는 함량이 바람직하다. 유효량은 체중의 단위 kg당 약 0.1 mg 내지 20 mg이 바람직하다. 그러나, 실제 투여되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 함량은 치료 조건, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물, 연령, 체중, 환자 개개인의 반응, 및 병의 경중을 포함하는 관련 상황을 고려하여 의사에 의해서 결정될 것이다. 치료 과정은 수일에서 수개월 또는 병이 완화될 때까지 지속될 수 있다.

정제와 같은 고형 조성물을 제조하는 경우에는 주요 활성 성분/안티센스 올리고뉴클레오타이드를 약제 부형제와 혼합하여 본 발명의 화합물의 균질 혼합물을 함유하는 고형 예비조제 조성물을 제조한다. 이러한 예비조제 조성물이 균질하다는 것은 활성성분이 조성물 전반에 걸쳐 균일하게 분산되어 조성물이 정제, 환약, 및 캡슐과 같이 유효량의 단위 용량의 형태로 쉽게 분할될 수 있음을 의미하는 것이다.

본 발명의 정제는 코팅되거나 다른 방법으로 혼합되어 약효의 지속 효과를 제공하는 용량의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 정제 또는 환약은 내부 성분 및 외부 성분을 포함할 수 있으며, 이때 외부 성분은 내부 성분을 둘러싸는 형태가 된다. 장층(entric layer)을 사용해 두 성분을 분리하면, 위장에서 분해되는 것을 방지하고 내부 성분이 손상되지 않은 상태로 십이지장으로 들어가게 하거나 방출을 지연시킬 수 있다. 이러한 장층 또는 코팅용으로는 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 이러한 물질의 예로는 다양한 폴리머 산 및 폴리머 산과 셀락, 세틸 알콜, 및 셀룰로오스 아세테이트의 혼합물이 있다.

본 발명의 경구 투여 또는 주사용 조성물에 혼합될 수 있는 액체 형태로는 엘리시르 및 유사한 약제 운반체 외에도 수용액, 적당하게 향미된 시럽, 수계 또는 오일 현탁액, 및 옥수수유, 목화유, 참기름, 코코넛유, 또는 땅콩유와 같은 식용 오일을 함유하는 향신 에멀젼이 있다.

흡입 또는 취입용 조성물은 약리학적으로 수용 가능한 형태의 용액 및 현탁액, 수계용매 또는 유기용매, 또는 이들의 혼합물, 및 분말을 포함한다. 액상 또는 고형 조성물은 상기에 기재된 약리학적으로 수용 가능한 적당한 부형제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 국부적인 작용 또는 전신 작용을 위하여 경구 또는 비강내 흡입경로를 통해 투여되는 것이 바람직하다. 약리학적으로 수용 가능한 용매 형태의 조성물은 불활성 기체를 사용하여 분무할 수 있다. 분무 용액은 분무기로부터 직접 흡입될 수 있고, 분무 장치를 안면 마스크 텐트 또는 간헐적으로 포지티브 압력을 주입하는 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액, 또는 분말 조성물은 알맞은 방식으로 제제를 운반하는 장치로부터 경구 또는 비강내 경로를 통해 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 사용되는 바람직한 제제는 경피투여 장치("패치")를 사용한다. 이러한 경피 패치를 사용하면 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 소정의 함량으로 연속 또는 불연속 주입할 수 있다. 약제의 운반을 위한 경피 패치의 제조 방법 및 용도는 당 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 본 명세서에 참고로 인용된 미국특허 제5,023,252⁴⁰호를 참조할 수 있다. 이러한 패치는 연속적 또는 맥동성으로 제작될 수 있으며 약제 요구량에 따라 제작될 수 있다.

또 다른 바람직한 전달 방법으로는 피부층을 관통하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 "숏건(shotgun)" 전달법이 있다. "무처리(naked)" 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 전달법은 당 기술분야에 널리 공지된 것으로서, 본 명세서에 참고로 인용된 Felgnet 등의 미국특허 제5,580,859호⁴¹를 참조할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 "숏건" 전달하기 전에 지질 담체 내에 패킹할 수도 있다.

하기 제형 실시예는 본 발명의 대표적인 약제 조성물을 설명하기 위한 것이다.

제형 실시예 1

다음의 성분을 함유하는 경질 젤라틴 캡슐을 제조하였다:

성 분 함 량(mg/캡??)

활성성분 30.0

전분 305.0

마그네슘 스테아레이트 5.0

상기 활성성분을 혼합하여 340 mg의 경질 젤라틴 캡슐로 충전하였다.

제형 실시예 2

다음의 성분을 사용하여 정제를 제조하였다:

성 분 함 량(mg/정제)

활성성분 25.0

미세결정 셀룰로오스 200.0

콜로이드질 이산화규소 10.0

전분 5.0

상기 성분들을 혼합하여 각각 240 mg 중량의 정제를 제조하였다.

제형 실시예 3

다음의 성분을 함유하는 건조 분말 흡입제를 제조하였다:

성 분 중 량 %

활성성분 5

락토스 95

상기 활성성분을 락토스와 혼합하고, 그 혼합물을 건조 분말 흡입기에 첨가하였다.

제형 실시예 4

각각 30 mg의 활성성분을 함유하는 다음과 같은 정제를 제조하였다:

성 분 함 량(mg/정제)

활성성분 30.0

전분 45.0

미세결정 셀룰로오스 35.0

폴리비닐피롤리돈

(10% 살균 수용액) 4.0

소듐 카르복시메틸 전분 4.5

마그네슘 스테아레이트 0.5

탈크 1.0

전 체 120 mg

활성성분, 전분, 및 셀루로오스를 No. 20 메쉬 U.S. 시브를 통과시켜 고르게 혼합하였다. 얻어진 분말에 폴리비닐피롤리돈을 혼합한 뒤, 16 메쉬 U.S. 시브를 통과시켰다. 이렇게 제조된 입자를 50 내지 60℃에서 건조시킨 다음, 16 메쉬 U.S. 시브를 통과시켰다. 소듐 카르복시메틸 전분, 마그네슘 스테아레이트, 및 탈크를 No. 30 메쉬 U.S. 시브를 통과시킨 다음, 상기 입자에 첨가하여 혼합한 뒤, 정제기상에서 압착하여 각각 120 mg 중량의 정제를 제조하였다.

제형 실시예 5

각각 40 mg의 약제를 함유하는 다음과 같은 캡슐을 제조하였다:

성 분 함 량(mg/캡슐)

활성성분 40.0 mg

전분 109.0 mg

마그네슘 스테아레이트 1.0 mg

전 체 150.0 mg

활성성분, 전분, 및 마그네슘 스테아레아트를 혼합하고 No. 20 메쉬 U.S. 시브를 통과시킨 다음, 150 mg 중량의 경질 젤라틴 캡슐로 충전하였다.

제형 실시예 6

각각 25 mg의 활성성분을 함유하는 다음과 같은 좌약을 제조하였다:

성 분 함 량

활성성분 25 mg

포화 지방산 그리세라이드 포함 2,000 mg

활성성분을 No. 20 메쉬 U.S. 시브로 통과시킨 다음, 필요한 최소량의 열을 사용하여 미리 용융시킨 포화 지방산 글리세라이드와 현탁시켰다. 얻어진 혼합물을 2.0 g 용량의 좌약 주형에 넣고 냉각하였다.

제형 실시예 7

5.0 ㎖의 용량당 각각 50 mg의 약제를 함유하는 다음과 같은 현탁액을 제조하였다:

성 분 함 량

활성성분 50.0 mg

크산틴 고무 4.0 mg

소듐 카르복시메틸 셀루로오스(11%)

미세결정 셀룰로오스(89%) 50.0 mg

수크로스 1.75 mg

소듐 벤조에이트 10.0 mg

향료 및 염료 q.v.

정제수 5.0 ㎖

활성 성분, 수크로스, 및 크산틴 고무를 혼합하여 No. 10 메쉬 U.S. 시브를 통과시킨 다음, 미리 만들어둔 미세결정 셀루로오스 및 소듐 카르복시메틸 셀루로오스 수용액과 혼합하였다. 소듐 벤조에이트, 향료, 및 염료를 약간의 물로 희석시키고 교반하면서 첨가하였다. 그런 다음, 충분한 량의 물을 첨가하여 원하는 부피로 만들었다.

제형 실시예 8

성 분 함 량(mg/캡슐)

활성성분 15.0 mg

전분 407.0 mg

마그네슘 스테아레아트 3.0 mg

전체 425.0 mg

활성 성분, 전분, 및 마그네슘 스테아레이트를 혼합하여, No. 20 메쉬 U.S. 시브를 통과시킨 다음, 425.0 mg의 경질 젤라틴 캡슐로 충전하였다.

제형 실시예 9

다음과 같이 제형을 제조하였다:

성 분 함 량

활성성분 5.0 mg

옥수수유 1.0 mg

제형 실시예 10

다음과 같이 국부용도의 제형을 제조하였다:

성 분 함 량

활성성분 1 - 10 g

에멀젼화 왁스 30 g

액상 파라핀 20 mg

백색 연질 파라핀 포함 100 g

백색의 연질 파라핀을 가열하여 용융시켰다. 액상 파라핀 및 에멀젼화 왁스를 혼합하고 교반하여 용해시켰다. 활성성분을 첨가하고 분산될 때까지 교반을 계속하였다. 그런 다음, 혼합물을 냉각시켜 고체상태로 만들었다.

본 발명의 용도로 적당한 다른 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences²³에서 찾아볼 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제 조성물은 적당한 용기로 패킹된 필요 물질을 제공하는 편리한 키트로 패킹될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드 및 리보자임은 종양세포의 성장을 조절한다. 따라서, 본 발명은 종양 또는 종양세포를 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는 포유류내 종양세포의 성장을 방해 또는 억제하는 방법을 제공한다.

"접촉"이란 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 등을 세포 현탁액 또는 조직 샘플에 첨가하거나 올리고뉴크레오타이드를 직접적 또는 간접적으로 동물의 세포 또는 조직에 투여하는 것을 의미한다.

상기 방법은 다음과 같은 증식성 질환에 사용될 수 있다: 백혈병, 림프종(Hondgkins and non-Hondgkins), 육종, 흑색종, 선종, 고형 조직의 암종, 저산소성 종양, 경구, 인후, 후두, 및 허파의 낙설성(squamous) 세포 암종, 자궁경부암 및 방광암과 같은 비뇨기 암, 조혈성 암, 결장암, 유방암, 췌장암, 신장암, 뇌암, 피부암, 간암, 머리 및 목 부분의 암, 및 신경계 암뿐 아니라 유두종과 같은 양성 장애. 기타 증식성 질환으로는 건선, 관절경화증, 혈관형성 및 바이러스 감염이 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 약제 내성 종양의 치료에도 사용될 수 있다. 약제 내성 종양의 예로는 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 메토트렉세이트 또는 히드록시우레아와 같은 화학치료제에 대하여 내성을 가지는 종양 및 콜히친, 빈블라스틴, 및 독소루비신과 같은 다양한 항암제에 대한 내성을 부여하는 것으로 알려진 P-글리코단백질이 높은 수준으로 발현되는 종양; 또는 Dreely⁴³등에 의하여 보고된 다중-약재 내성 단백질을 발현시키는 종양이 있다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 공지된 항암 화합물 또는 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 화학치료제는 종양의 성장을 억제할 수 있는 화합물들이다. 이러한 제제로는 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 메토트렉세이트, 및 히드록시우레아가 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 화학치료제의 함량은 종양의 성장을 억제하기에 충분한 함량, 즉 유효량 또는 유효량 이하로 할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 MDA-MB-231 유방 선암종, HT-29 결장 선암종, A549 폐암종, 및 A2058 흑색종 암 세포와 같은 전이성 종양의 성장을 저하시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 실시예에서는 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRAN와 상보적인 올리고뉴클레오타이드 또는 표 1 및 표 2에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 포유류의 전이성 종양의 성장을 감소시키는 방법을 제공한다.

상기 올리고뉴클레오타이드는 경구 또는 비-바이러스 벡터를 사용하여 투여할 수 있다. 서열은 본 발명의 올리고뉴클레어타이드가 세포내에서 발현되는 카세트 또는 구조체와 결합될 수 있다. 상기 구조체는 올리고뉴클레오타이드를 세포내에서 전사시킬 수 있는 적당한 전사조절 부분을 함유한다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 코딩할 수 있는 서열에 유효하게 결합된 전사조절 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 벡터로 형질변환된 적당한 진핵세포 또는 원핵세포로부터 선택되는 숙주세포를 제공한다.

적합한 벡터는 공지된 것으로서, 상기 서열을 바람직하게 전사시키는데 필요한 모든 종류의 발현요소를 함유하는 것이 바람직하다. 이러한 유용한 벡터의 예로는 파지미드(phagemide)가 있으며, 이는 플라스미드 또는 박테리오파지 벡터에 사용될 수 있다. 벡터의 예로는 박테리오파지와 같은 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스, DNA 바이러스, 리포좀, 및 기타 재조합 벡터가 있다. 상기 벡터는 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에 사용되는 요소를 함유할 수도 있다. 당업자는 숙주 시스템이 특정한 벡터와 상용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

상기 벡터는 재조합 바이러스 벡터의 안정된 또는 순간적 트랜스펙션, 리포펙션, 일렉트로포레이션, 및 인펙션을 통해 세포로 주입될 수 있다.

벡터의 안전을 강화하고 치료효과를 높이기 위하여 추가의 요소가 벡터에 첨가될 수 있다. 이러한 요소의 예로는 재조합 바이러스로 감염된 세포에 대하여 음성적으로 선택하는데 사용될 수 있는 마커가 있다. 이러한 음성적 선택 마커의 예로는 항바이러스 갱시클로비어(gancyclovir)에 대한 특이성을 제공하는 TK 유전자가 있다. 특정한 유형의 세포 발현을 제한하는 요소가 포함될 수도 있다. 이러한 요소의 예로는 원하는 유형의 세포에 대하여 특이적인 프로모터 및 조절요소가 있다.

생체내 주입용으로 유용한 벡터의 다른 예로는 레트로바이러스 벡터가 있으며, 상기 바이러스는 측면(laternal) 감염 및 표적 특이성과 같은 장점을 제공한다. 측면 감염은 단일 감염된 세포가 이웃 세포에 감염되는 많은 자손 비리온을 생산하는 과정이며, 결과적으로 넓은 영역이 신속하게 감염될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 벡터는 표적화되는 세포에 따라 선택할 수 있다. 예를 들면, 유방암 세포를 치료하고자하는 경우에는 상피세포에 대하여 특이적인 벡터가 사용될 수 있으며, 마찬가지로 조혈계 세포를 치료하고자 하는 경우에는, 혈액 세포에 대하여 특이적인 바이러스 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

용 도

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포유류 세포 내에서의 티오레독신 유전자의 발현을 억제하는데 사용하면 이들 세포의 성장을 억제할 수 있다. 즉, 본 발명의 안티센스 올리고뉴크레오타이드는 포유류 세포 내에서 티오레독신 환원효소의 유전자 발현을 억제하는데 사용하면 이들 세포의 성장을 억제할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 포유류 세포 내에서 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소 mRNA의 존재를 검출하기 위한 혼성화 프로브로 사용할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드가 이러한 용도로 사용되는 경우에는, 적당한 검출 그룹(예를 들면, 방사능 동위원소, 리간드, 기타 바이오틴과 같은 특이 결합쌍 멤버)으로 올리고뉴클레오타이드를 표지할 수 있다. 끝으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 분자량 마커로 사용될 수도 있다.

본 발명의 특징 및 장점은 하기 실시예를 통해 보다 상세히 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 청구의 범위가 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예에서, 모든 온도는 섭씨 온도(달리 지정하지 않는 경우)이고, 모든 분율은 중량%(달리 지정하지 않는 경우)이다.

이하의 실시예에서, 모든 약어는 하기의 의미를 갖는다. 약어가 정의되지 않는 경우에는 일반적으로 받아들여지는 의미를 갖는다.

μM = 마이크로몰

mM = 밀리몰

M = 몰

㎕ = 마이크로리터

mg = 밀리그램

㎍ = 마이크로그램

PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동

rpm = 단위 시간당 회전수

ΔG = 자유에너지, 올리고뉴클레오타이드 이중쇄의 안정도 측정값

kcal = 킬로칼로리

FBS = 소의 태아 혈청

DDT = 디티오트리에톨

SDS = 소듐 도데실 설페이트

PBS = 포스페이트 완충 염수

PMSF = 페닐메틸술포닐 플루오라이드

분자생물학적으로 일반적인 방법:

특별히 설명하지 않은 당 기술분야에 공지된 분자생물학적 표준 방법은 Sambrook et al.²⁴; Ausubel et al.²⁵; 및 Perbal²⁶에 의한 것이 일반적이다.

올리고뉴클레오타이드

이중쇄 형태, 헤어핀 형태, 및 호모올리고머/서열 반복의 가능성은 가능한 한 작고, 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소 mRNA 서열 각각에 결합할 수 있는 가능성이 큰 같은 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적인 서열로부터 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 선택하였다. 또한, 사람 및 생쥐에게서 자주 나타나는 기타 반복서열에 대한 그릇된 프라이밍(priming)을 제거하였다. 이러한 특성은 컴퓨터 모델링 프로그램 OLIGO™ Primer Analysis Software, Version 5.0(International Bioscience, Inc. Plymouth MN)을 사용하여 측정하였다. 티오레독신과 관련된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대하여, 5'의 번역되지 않는 부분의 표적화를 위하여 5종류의 올리고뉴클레오타이드(2601-2605)를 선택하고, 번역 개시자리를 표적하기 위해서는 2종류의 올리고뉴클레오타이드(2606-2607)를 선택하고, 코딩 부위를 표적하기 위해서는 12종류의 올리고뉴클레오타이드(2608-2619)를 선택하였으며, 3'의 번역되지 않는 부분과의 혼성화를 위해서는 7종류의 올리고뉴클레오타이드(2620-2626)를 선택하였다. 총 66개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하여 Dalton Chemical Laboratories, Inc.(Nerth York, Canada) 또는 TriLink Biotechologies, Inc.(San Diegp, CA)에 주문하였다.

세포주

정상적인 인간의 태아 세포주 WI-38 및 다음과 같은 10 종류의 상이한 암세포주를 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 구입하였다: 섬유육종(HT-1080), 폐암종(A549), 난소 선암종(SK-OV-3), 간세포 암종(Hep G2), 흑색종(C8161), 유방 선암종(MDA-MB-231), 전이성 췌장 선암종(AsPC-1), 결장 선암종(HT-29), 자궁경부 암종(Hela S3), 인간 흑색종 세포주 A2058, 인간 취장암 SU.86.86. 세포주는 10%의 소의 태아 혈청(FBS)이 보충된 α-MEN 배양액(Gibco BRL, Gaithersburg, ND)에 보관하였다.

실시예 1

인간 암세포주 내에서의 티오레독신 과대발현

상이한 세포주로부터 세포 현탁액을 분취하여 조직배양 디시에 첨가하고 70 내지 80%이 융합(subconfluency)될 때까지 배양하였다. 노던 블롯 분석을 통해 티오레독신 mRNA 또는 단백질 각각의 수준을 측정하였다.

상기에 기재된 방법(Hurta and Wright²³)을 약간 변형시킨 노던 블롯을 이용하여 분석하였다. 간단히, TRIzol 시료(Gibco BRL, Gaithersburg MD)를 사용하여 세포로부터 완전한 세포 RNA를 준비하였다. 1.5% 포름알데하이드 겔상에서 RNA를 분리하여 나일론 막으로 옮겼다. 주형으로서 전방향 프라이머[SEQ ID NO: 69](5'-CAG ATC GAG AGC AAG ACT G-3'), 후방향 프라미머[SEQ ID NO: 70](5'-TTC ATT AAT GGT GGC TTC AA-3'), 및 인간 간의 5'-스트레치 프러스 cDNA 라이브러리(Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하여 블롯과³²P-표지된 300 bp PCR 단편을 혼성화 시켰다. 티오레독신 뉴클레오타이드 서열에 대한 정보는 Genbank의 접수번호 X77585로부터 얻었다. 인간 티오레독신 mRNA는 520 bp의 전사체로 발현되었으며(Tagaya et al.²⁸), 자동 방사선 사진 또는 포스포이미저(phosphorImager; Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 가시화 및 정량하였다.

RNA 로딩 대조군에 대하여 글리세르하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH)의 mRNA를 동시에 탐침하였다. 상기에 기재된 것과 동일한 cDNA 라이브러리로부터 전방향 프라이머[SEQ ID NO: 71](5'-CGC GGG GCT CTC CAG AAC AT-3') 및 후방향 프라이머[SEQ ID NO: 72](5'-GCA ATG CCA GCC CCA GCG TC-3')를 사용하여 PCR하여 308 bp의 GAPDH DNA 프로브를 만들었다.

도 1a에 나타난 바와 같이, 티오레독신 mRNA는 9종류의 상이한 종양 세포주에서 정상 세포에 비하여 상당히 높은 발현수준을 나타내었다. 그러나, 상이한 세포주 사이의 발현정도는 달랐으며, 대략 1.5 내지 5.6 배 가량으로 과대발현된 것으로 나타났다.

50 내지 150 ㎕의 2X 샘플 로딩 완충용액(100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.2 M DTT, 4% SDS, 20% 글리세롤, 및 0.015% 브로모페놀 블루) 내에서 전체 세포 단백질 추출물을 제조하였다. 상기에 기재된 방법(Choy et al.²⁹및 Fan et al.³⁰)을 약간 변형시킨 웨스턴 블롯을 이용하여 분석하였다. SDS-PAGE 겔상에서 단백질 추출물(10 내지 20 ㎍)을 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 다음, 인도 잉크로 염색하여 가시화하였다. 항-티오레독신 항체(0.2 내지 1 ㎍/㎖)(American Diagnostica Inc., Greenwich, CT)를 사용하여 티오레독신의 발현을 검출한 뒤, 1:8,000으로 희석시킨 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항염소 IgG(Sgma, St. Louis, MO)를 사용하여 검출하였다. ELC(Amersham, Arlington Heights, IL)에 의하여 대략 12 kDa의 단백질이 가시화되었다.

도 1b에 나타난 바와 같이, 티오레독신 및 단백질의 수준 사이에는 상당한 연관성이 있었다. 즉, 단백질의 발현패턴은 mRNA의 발현패턴과 매우 유사하여 변화되었다. 도 1b는 전체 단백질 로딩이 하위 패널에 걸쳐 일정하게 이루어졌음을 보여준다.

실시예 2

티오레독신과 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한

암세포주의 성장 억제

상기에 기재된 방법(Choy et al.²⁹)을 사용하여 26종류의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 암세포주의 콜로니 형성 능력을 측정하였다. 특히, 종양 세포의 현탁액을 분취하여 대략 1×10⁴밀도로 조직배양 디시에 첨가하고 37℃에서 10%의 FBS가 보충된 α-MEM 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 5 ㎖의 PBS를 사용하여 세포를 한차례 세척하고, 양이온성 지질(리포펙틴 시약, 최종 농도 5 ㎕/㎖, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)의 존재 하에서 4시간 동안 0.2 μM의 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리하였다. PBS로 세포를 한차례 세척하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제거하고 37℃, 성장배지(10%의 FBS가 보충된 α-MEM 배지)에서 7일 내지 10일 동안 세포를 배양하였다. 메티렌 블루를 사용하여 콜로니를 염색하고 상기에 기재된 바와 같이(Choy et al.²⁹및 Huang and Wright³¹) 콜로니를 직접 계측하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 존재하지 않는 배지에서 배양된 콜로니 수와 비교하여 억제율(%)을 계산하였다. 모든 실험은 4번씩 반복하였다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간 종양 세포주의 콜로니 형성 능력을 억제하는 효과를 나타내었다. 도 3a는 인간 결장암 세포주 HT-29에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이고; 도 3b는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이며; 도 3c는 인간 간암 세포주 HepG2에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이며; 도 3d는 인간 흑색종 세포주 SK-OV-3에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이고; 도 3e는 인간 난소암 세포주 SK-OV-3에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이며; 도 3f는 인간 폐암 세포주 A549에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이다.

실시예 3

티오레독신과 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리후

mRNA의 수준 감소

인간 간암 세포(Hep G2) 또는 유방암 세포(MDA-MB-231)를 융합(70 내지 80%)될 때까지 동시 배양하여 티오레독신과 상보적인 0.2 μM의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 양이온성 지질(리포펙틴 시약, 최종 농도 5 ㎕/㎖, Gibco-BRL) 및 Opti-MEM(Gibco-BRL)의 존재 하에서 4시간 동안 배양하였다. PBS를 사용하여 세포를 한차례 세척하고 10%의 FBS가 보충된 α-MEM(Gibco-BRL) 배지에서 16시간 동안 배양하였다. TRIzol 시료(Gibco BRL, Gaithersburg MD) 내에서 전체 RNA를 제조하여 상기에 기재된 바와 같이 노던 블롯으로 분석하였다. 인간 티오레독신 mRNA 수준은 정량하고 GAPDH mRNA 수준을 기준으로 보정하여 비처리 세포로부터 얻어진 티오레독신 mRNA의 수준에 대한 분율(%)로 나타내었다. 도 4a 및 도 4b는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 대조군 세포에 비하여 티오레독신 mRNA의 수준을 적어도 50% 가량 감소시켰음을 보여준다.

실시예 4

다양한 세포주 내에서의 티오레독신 단백질의 발현 감소

다양한 세포주를 융합(70 내지 80%)될 때까지 배양하여 티오레독신과 상보적인 0.2 μM의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 양이온성 지질(리포펙틴 시약, 최종 농도 5 ㎕/㎖, Gibco-BRL) 및 Opti-MEM(Gibco-BRL)의 존재 하에서 4시간 동안 배양하였다. PBS를 사용하여 세포를 한차례 세척하고 10%의 FBS가 보충된 α-MEM(Gibco-BRL) 배지에서 20시간 동안 배양하였다. 2X 샘플 로딩 완충용액(100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.2 M DTT. 4% SDS, 20% 글리세롤, 및 0.015% 브로모페놀 블루) 내에서 완전한 세포의 단백질을 제조하기 전에 처리 및 배양을 반복하고, 상기에 기재된 방법(Choy et al.²⁹및 Fan et al.³⁰)을 약간 변형시킨 웨스턴 블롯을 이용하여 분석하였다.

항-티오레독신 항체(0.2 내지 1 ㎍/㎖)(American Diagnostica Inc., Greenwich, CT)를 사용하여 티오레독신의 발현을 검출한 뒤, 1:8,000으로 희석시킨 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항염소 IgG(Sgma, St. Louis, MO)를 사용하여 검출하였다. ECL(Amersham, Arlington Heights, IL)에 의하여 대략 12 kDa의 단백질이 가시화되었다.

테스트된 세포주는 인간 결장암 세포주 HT-29(도 5a) 및 MDA-MB-231 인간 유방암 세포(포 5b) 이었다. 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 처리에 의하여 단백질 수준이 감소되었다.

3종류의 인간 종양 세포주(결장, 유방, 및 간암 각각에 대한 HT-29, MDA-MB-231, 및 HepG2)를 상기에 기재된 0.2 μM의 올리고뉴클레오타이드 2601[SEQ ID NO: 1]로 처리하였다. 도 5c는 각 세포주 내에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 티오레독신 단백질의 발현 억제를 나타낸 것이다. 하위 패널은 단백질 로딩이 패널 전반에 걸쳐 고르게 이루어졌음을 보여준다.

실시예 5

티오레독신과 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 정맥내 처리에 의한

생쥐내 인간 종양세포의 성장 억제

Charles River Laboratories(Montreal Canada)로부터 CD-1 무흉선 누드 마우스를 구입하였다. 6주 내지 7주된 CD-1 무흉선 암 누드 마우스의 오른쪽 옆구리의 피하를 통해 HT-29 인간 결장암 세포주(통상, 100 ㎕의 PBS 내에 3×10⁶세포)를 주입하였다. 종양의 크기가 대략 100 mm³가 되었을 때, 통상적으로 종양세포를 주입하고 5일이 지난 후, 꼬리의 정맥을 통해 격일로 매일 10 mg/kg의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대형환제로 투여하였다. 동일 기간 동안 대조군 동물에는 염수를 주입하였다. 통상적으로, 그후 10일 동안 치료를 계속하였다.

도 6a는 CD-1 누드 마우스 내에서의 HT-29 종양 성장에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효과를 나타낸 것이다. 9일에 걸쳐 평균 이틀 간격으로 캘리퍼를 사용하여 측정한 종양의 크기 감소로 항종양 활성을 측정하였다. 도면상의 각각의 점은 실험 그룹당 5마리의 생쥐로부터 측정한 종양의 평균 크기를 나타낸 것이다. 공분산을 이용하여 각각의 치료 그룹내에서 시간에 따른 생쥐의 퇴화 곡선을 비교 분석하였다. 이 같은 분석을 통해 기울기가 동일하거나, 기울기가 같은 경우 절편이 동일하다는 가설이 유도되었다. 모든 분석에는 SAS(Statistical Analysis System) 버젼 6.12가 사용되었다. 염수 대조군과 비교하여도 6a에 도시된 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 0.0001 이하의 p값으로 종양의 성장을 억제하였다.

치료의 마지막(일반적으로, 마지막 치료 후 24시간 뒤)에 동물을 죽여 종양의 중량을 측정하였다. 도 6b는 종양의 평균 중량을 나타낸 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 종양의 성장을 억제하는데 상댕히 효과적인 것으로 나타났다. 편차를 원-웨이(one-way) 분석하여 치료 그룹의 평균을 비교하였다. 전체적으로 모든 그룹의 효과가 상당한 경우에는 적어도 4회 평균을 사용하는 우선 순위 복합비교를 사용하여 상당한 편차를 나타낸 치료그룹의 쌍을 찾았다. 종양의 중량을 비교한 경우에도, 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 0.0198 이하의 p값을 가지는 염수 대조군에 비하여 정적으로 상당한 억제 효과가 나타냈다(도 6b)

6주 내지 7주된 CD-1 무흉선 암 누드 마우스의 오른쪽 옆구리의 피하를 통해 HT-29 인간 결장암 세포를 주입하였다. 종양의 크기가 대략 100 mm³가 되었을 때, 통상적으로 종양세포를 주입하고 5일이 지난 후, 꼬리의 정맥을 통해 격일로 매일 10 mg/kg의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대형환제로 투여하였다. 동일 기간 동안 대조군 동물에는 염수를 주입하였다. 주입 후 8일 뒤에 생쥐를 죽이고, 종양을 동일한 크기의 단편으로 절제한 뒤, 즉시 RIPA 추출 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.02% NaN₃, 1 m〈 PMSF, 및 10μM 류펙틴)에 넣고, 신속하게 균질화하여 단백질을 준비하하였다. 상기에 기재된 방법(Choy et al.²⁹및 Fan et al.³⁰)을 약간 변형시킨 웨스터 블롯을 이용하여 티오레독신 단백질 수준에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효과를 측정하였다. 12% SDS-PAGE 겔상에서 단백질 추출물을 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 다음, 인도 잉크로 염색하여 가시화하였다. 항-티오레독신 항체(0.2 내지 1 ㎍/㎖)(American Diagnostica Inc., Greenwich, CT) 및 1:8,000으로 희석시킨 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항염소 IgG(Sgma, St. Louis, MO)를 사용하여 티오레독신의 발현을 검출하였다. ECL(Amersham, Arlington Heights, IL)에 의하여 대략 12 kDa의 단백질이 가시화되었다. 각 레인 내에 단백질 로딩은 거의 동일하게 이루어졌다. 인도 임크로 염색된 블롯 부분은 단백질이 각 레인에 동일하게 로딩되었음을 보여준다. 도 6c로부터 염수로 처리된 생쥐로부터 발췌한 대조군 종양조직에 비하여 티오레독신을 표적하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 처리된 생쥐로부터 발췌한 종양조직에서 티오레독신의 발현이 감소되었음을 명확하게 확인할 수 있다.

실시예 6

인간 종양 세포주 내에서의 티오레독신 환원효소의 과대발현

상이한 세포주로부터 세포 현탁액을 분취하여 조직배양 페트리 디시에 첨가하고 융합(70 내지 80%)될 때까지 배양하였다. 노던 블롯 분석을 통해 티오레독신 환원효소 mRNA의 수준을 측정하였다.

상기에 기재된 방법(Hurta and Wright²⁷)을 약간 변형시킨 웨스터 블롯을 이용하여 분석하였다. 간단히, 정해진 시간에 TRIzol 시료(Gibco BRL, Gaithersburg MD)를 사용하여 세포로부터 완전한 세포의 RNA를 제조하였다. 1.5% 포름알데하이드 겔상에서 RNA를 분리하여 나일론 막으로 옮겼다. 주형으로서 전방향 프라이머[SEQ ID NO: 73](5'-TTC GCT TAG AAA CCG TAG GG-3'), 후방향 프라미머[SEQ ID NO: 74](5'-CCA ATG GCC AAA AGT AAC TA-3'), 및 인간 간의 5'-신장 프러스 cDNA 라이브러리(Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하여 블롯과³²P-표지된 330 bp PCR 단편을 혼성화 시켰다. 인간 티오레독신 환원효소의 mRNA는 3826 bp의 뉴클레오타이드 전사체로 발현되었으며(Gasdaska et al.²⁸), 자동 방사선 사진 또는 포스포이미저(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 가시화 및 정량하였다.

RNA 로딩 대조군에 대하여 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH)의 mRNA를 동시에 탐침하였다. 상기에 기재된 것과 동일한 cDNA 라이브러리로부터 전방향 프라이머[SEQ ID NO: 71](5'-CGC GGG GCT CTC CAG AAC AT-3') 및 후방향 프라이머[SEQ ID NO: 72](5'-GCA ATG CCA GCC CCA GCG TC-3')를 사용하여 PCR하여 308 bp의 GAPDH DNA 프로브를 만들었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 티오레독신 환원효소의 mRNA는 9종류의 상이한 종양 세포주에서 정상 세포에 비하여 상당히 높은 발현수준을 나타내었다.

실시예 7

티오레독신 환원효소와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한

암세포주의 성장 억제

상기에 기재된 방법(Choy et al.²⁹)을 사용하여 40종류의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 암세포주의 콜로니 형성 능력을 측정하였다. 특히, 종양 세포의 현탁액을 분취하여 대략 1×10⁴밀도로 조직배양 디시에 첨가하고 37℃에서 10%의 FBS가 보충된 α-MEM 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 5 ㎖의 PBS를 사용하여 세포를 한차례 세척하고, 양이온성 지질(리포펙틴 시약, 최종 농도 5 ㎕/㎖, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)의 존재 하에서 4시간 동안 0.2 μM의 정해진 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리하였다. 메틸렌 블루를 사용하여 콜로니를 염색하고 상기에 기재된 바와 같이(Choy et al.²⁹및 Huang and Wright³¹) 콜로니를 직접 계측하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 존재하지 않는 배지에서 배양된 콜로니 수와 비교하여 억제율(%)을 계산하였다. 모든 실험은 4번씩 반복하였다.

대다수의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간 종양 세포주의 콜로니 형성 능력을 억제하는 효과를 나타내었다. 도 8a는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이고; 도 8b는 인간 흑색종 세포주 A2058에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이며; 도 8c는 인간 간암 세포주 HepG2에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이며; 도 3d는 인간 췌장암 세포주 SU.86.86에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 억제율(%)을 도시한 것이다.

실시예 8

티오레독신 환원효소와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드

처리후 mRNA의 수준 감소

인간 결장암 세포(Hep G2) 또는 유방암 세포(MDA-MB-231)를 융합(70 내지 80%)될 때까지 동시 배양하여, 티오레독신 환원효소와 상보적인 0.2 μM의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 양이온성 지질(리포펙틴 시약, 최종 농도 5 ㎕/㎖, Gibco-BRL) 및 Opti-MEM(Gibco-BRL)의 존재 하에서 4시간 동안 배양하였다. PBS를 사용하여 세포를 한차례 세척하고 10%의 FBS가 보충된 α-MEM(Gibco-BRL) 배지에서 16시간 동안 배양하였다. TRIzol 시료(Gibco BRL, Gaithersburg MD) 내에서 전체 RNA를 제조하여 상기에 기재된 바와 같이 노던 블롯으로 분석하였다. 인간 티오레독신 환원효소의 mRNA 수준을 정량하고 GAPDH mRNA 수준을 기준으로 보정하여 비처리 세포로부터 얻어진 티오레독신 환원효소의 mRNA 수준에 대한 분율(%)로 나타내었다. 도 9a 및 도 9b는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 대조군 세포에 비하여 티오레독신 환원효소의 mRNA 수준을 적어도 50% 가량 감소시켰음 보여준다.

실시예 9

안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리후

세포 내에서의 티오레독신 환원효소 단백질의 발현 감소

AsPC-1 인간 췌장암 세포를 융합(70 내지 80%)될 때까지 배양하여, 0.2 μM의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 3014[SEQ ID NO: 40] 및 3037[SEQ ID NO: 63]을 처리하여 양이온성 지질(리포펙틴 시약, 최종 농도 5 ㎕/㎖, Gibco-BRL) 및 Opti-MEM(Gibco-BRL)의 존재 하에서 4시간 동안 배양하였다. PBS를 사용하여 세포를 한차례 세척하고 10%의 FBS를 함유하는 α-MEM(Gibco-BRL) 배양액에서 20시간 동안 배양하였다. 2X 샘플 로딩 완충용액(100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.2 M DTT. 4% SDS, 20% 글리세롤, 및 0.015% 브로모페놀 블루) 내에서 완전한 세포의 단백질을 제조하기 전에 처리 및 배양을 반복하고, 상기에 기재된 방법(Choy et al.²⁹및 Fan et al.³⁰)을 약간 변형시킨 웨스턴 블롯을 이용하여 분석하였다. 항-티오레독신 환원효소의 항체(0.2 내지 1 ㎍/㎖)(Research Genetics, Inc., Huntsvill Al)를 사용하여 티오레독신 훤원효소의 발현을 검출한 뒤, 1:8,000으로 희석시킨 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항염소 IgG(Sgma, St. Louis, MO)를 사용하여 검출하였다. ELC(Amersham, Arlington Heights, IL)에 의하여 대략 12 kDa의 단백질이 가시화되었다.

실시예 10

안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리에 의한

생쥐내 인간 종양세포의 성장 억제

6주 내지 7주된 CD-1 무흉선 암 누드 마우스의 오른쪽 옆구리의 피하를 통해 HT-29 인간 결장암 세포(통상, 100 ㎕의 PBS 내에 3×10⁶세포)를 주입하였다. 종양의 크기가 대략 100 mm³가 되었을 때, 통상적으로 종양세포를 주입하고 5일이 지난 후, 꼬리의 정맥을 통해 격일로 매일 10 mg/kg의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대형환제로 투여하였다. 동일 기간 동안 대조군 동물에는 염수를 주입하였다.

도 11a는 CD-1 누드 마우스 내에서의 티오레독신 환원효소와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 HT-29 종양의 성장에 대한 효과를 나타낸 것이다. 9일에 걸쳐 평균 이틀 간격으로 캘리퍼를 사용하여 측정한 종양의 크기 감소로 항종양 활성을 측정하였다. 도면상의 각각의 점은 실험 그룹당 5마리의 생쥐로부터 측정한 종양의 평균 크기를 나타낸 것이다. 치료의 마지막(일반적으로, 마지막 치료 후 24시간 뒤)에 동물을 도살하여 종양의 중량을 측정하였다. 도 11b는 종양의 평균중량을 나타낸 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 종양의 성장을 억제하는데 상당히 효과적인 것으로 나타났다. 염수 대조군에 비하여 도 11a에 도시된 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 종양의 성장을 0.0001 이하의 p값으로 억제하였다. 종양의 중량을 비교한 경우에도, 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 염수 대조군에 비하여 0.0141 이하의 p값으로 만족스러운 정도로 상당히 억제하는 것으로 나타났다(도 11b)

실시예 11

안티센스 올리고뉴클레오타이드의 정맥내 처리에 의한

생쥐내의 인간 종양에서의 티오레독신 환원효소 단백질 수준의 감소

6주 내지 7주된 CD-1 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리의 피하를 통해 HT-29 인간 결장암 세포(통상, 100 ㎕의 PBS 내에 3×10⁶세포)를 주입하였다. 종양의 크기가 대략 100 mm³가 되었을 때, 통상적으로 종양세포를 주입하고 5일이 지난 후, 꼬리의 정맥을 통해 격일로 매일 10 mg/kg의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대형환제로 투여하였다. 동일 기간 동안 대조군 동물에는 염수를 주입하였다. 주입 후 8일 뒤에 생쥐를 죽이고, 종양을 동일한 크기의 단편으로 절제한 뒤, 즉시 RIPA 추출 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.02% NaN₃, 1 mM PMSF, 및 10 μM 류펩틴)에 넣고, 신속하게 균질화하여 단백질을 제조하였다. 상기에 기재된 방법(Choy et al.²⁹및 Fan et al.³⁰)을 약간 변형시킨 웨스턴 블롯을 이용하여 티오레독신 환원효소 단백질의 수준에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효과를 측정하였다. 12% SDS-PAGE 겔상에서 단백질 추출물을 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 다음, 인도 잉크로 염색하여 가시화하였다. 항-티오레독신 환원효소 항체(0.2 내지 1 ㎍/㎖)(Research Genetics, Inc., Huntsvill AL)를 사용하여 티오레독신 환원효소의 발현을 검출한 뒤, 1:8,000으로 희석시킨 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항염소 IgG(Sgma, St. Louis, MO)를 사용하여 검출하였다. ECL(Amersham, Arlington Heights, IL)에 의하여 대략 12 kDa의 단백질이 가시화되었다. 단백질은 각 레인 내에 거의 동일하게 로딩되었다(도 12 참조).

Claims

표 1에 기재된 서열 2601-2626[SEQ ID NO: 1-26]으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 약 17개 내지 50개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
제1항에 있어서,

하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 추가로 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
제1항에 있어서,

티오레독신 mRNA와 상보적이지 않은 부가적인 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
표 2에 기재된 서열 3001-3040[SEQ ID NO: 27-66]으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 약 17개 내지 50개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
제4항에 있어서,

하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 추가로 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
제1항에 있어서,

티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적이지 않은 부가적인 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
포유류의 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
포유류의 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적인 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 약리학적으로 수용 가능한 부형제를 포함하는 약제 조성물.
제8항에 있어서,

표 1에 기재된 서열 2601-2626[SEQ ID NO: 1-26]으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 약 17개 내지 50개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 약리학적으로 수용 가능한 부형제를 포함하는 약제 조성물.
제8항에 있어서,

표 2에 기재된 서열 3001-3040[SEQ ID NO: 27-66]으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 약 20개 내지 50개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 약리학적으로 수용 가능한 부형제를 포함하는 약제 조성물.
종양의 성장이 억제되는 조건하에서 포유류의 티오레독신 mRNA와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 종양을 가지고 있는 포유류에 투여하여 포유류의 종양성장을 억제하는 방법.
제11항에 있어서,

포유류에 화학치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 종양성장 억제 방법.
제11항에 있어서,

올리고뉴클레오타이드가 표 1에 기재된 서열 2601-2626[SEQ ID NO: 1-26]으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양성장 억제 방법.
제11항에 있어서,

올리고뉴클레오타이드가 뉴클리아제 내성인 종양성장 억제 방법.
종양의 성장이 억제되는 조건하에서 포유류의 티오레독신 환원효소의 유전자와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 종양을 가지고 있는 포유류에 투여하여 포유류의 종양성장을 억제하는 방법.
제15항에 있어서,

포유류에 화학치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 종양성장 억제 방법.
제15항에 있어서,

올리고뉴클레오타이드가 뉴클리아제 내성인 종양성장 억제 방법.
제15항에 있어서,

올리고뉴클레오타이드가 표 2에 기재된 서열 3001-3040[SEQ ID NO: 27-66]으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 종양성장 억제 방법.
종양의 전이가 억제되는 조건하에서 포유류의 티오레독신 유전자와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 전이성 종양을 가지고 있는 포유류에 투여하여 포유류의 종양전이를 억제하는 방법.
제19항에 있어서,

포유류에 화학치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 종양전이 억제 방법.
종양의 전이가 억제되는 조건하에서 포유류의 티오레독신 환원효소의 유전자와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 전이성 종양을 가지고 있는 포유류에 투여하여 포유류의 종양전이를 억제하는 방법.
제21항에 있어서,

포유류에 화학치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 종양전이 억제 방법.
포유류의 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 종양세포의 성장을 억제하기 위한 올리고뉴클레오타이드의 용도.
포유류의 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 종양의 전이를 억제하기 위한 올리고뉴클레오타이드의 용도.
종양세포의 성장을 억제하는 약제를 제조하기 위한 포유류의 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 용도.
종양의 전이를 억제하는 약제를 제조하기 위한 포유류의 티오레독신 mRNA 또는 티오레독신 환원효소의 mRNA와 상보적인 약 3개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 용도.