JP2002501743A

JP2002501743A - チオレドキシン遺伝子またはチオレドキシンレダクターゼ遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチド配列ならびに細胞増殖を調節するためのその使用方法

Info

Publication number: JP2002501743A
Application number: JP2000529423A
Authority: JP
Inventors: ジムエイ．ライト，; エイピングエイチ．ヤング，; ヨーンエス．リー，
Original assignee: ジェネセンステクノロジーズインコーポレイテッド
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2002-01-22
Also published as: WO1999038963A1; AU760396B2; CN1294630A; EP1049772A1; US6566514B1; AU2261299A; BR9907990A; CN1302107C; KR20010040448A; IL137177A0; CA2319710A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物において腫瘍細胞の増殖を調節するチオレドキシン遺伝子およびチオレドキシンレダクターゼ遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、哺乳動物において腫瘍細胞の増殖を阻害する際にこのような化合物を使用する方法に関する。本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤および有効量の本発明の化合物を含む薬学的組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の参照）本出願は、１９９８年１月３０日に出願された米国特許仮出願シリアル番号６
０／０７３，１９６に対して優先権を主張し、この出願は、その全体において本
明細書中で参考として援用される。

【０００２】（発明の背景）（発明の分野）本発明は、哺乳動物における腫瘍細胞の増殖を調節するチオレドキシンおよび
チオレドキシンレダクターゼ遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドに関する。本
発明はまた、哺乳動物において腫瘍細胞の増殖を阻害する際にこのような化合物を使用する方法に関する。本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤および有効
量の本発明の化合物を含む、薬学的組成物に関する。

【０００３】（参考文献）以下の全ての刊行物、特許出願および特許は、上付き番号として本出願中で引
用される：

【０００４】

【数１】全ての上記の刊行物、特許出願および特許は、各々の個々の刊行物、特許出願
または特許がその全体において参考として援用されることを具体的かつ個別に示
されるのと同じ程度にその全体において本明細書中で参考として援用される。

【０００５】（技術水準）チオレドキシンは、ＤＮＡ合成に不可欠であるリボヌクレオチドレダクターゼ
に対する還元補因子としてもともとは同定された広範に存在する小さいレドック
スタンパク質である¹。チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼは、このチオレドキシン系を含む。チオレドキシンレダクターゼは、セレノシステイ
ン含有フラボ酵素であり、このフラボ酵素は、プロトンドナーとしてＮＡＤＰＨ
を使用してチオレドキシンを還元し、次いでこのチオレドキシンは、他のタンパ
ク質を還元し、それによってそれらの機能に影響する。

【０００６】近年、哺乳動物チオレドキシンが、種々の他の生化学経路に関与しているとみ
なされている。例えば、それは、ジチオールジスルフィド交換により転写因子の
レドックス特性を調節し、それらのＤＮＡ結合特徴を変更する。転写因子（例え
ば、ＮＦ−κＢ³、ＢＺＬＦＩ⁴およびＴＦＩＩＩＣ⁵）は、直接的に調節されるが、ＡＰ−１活性化は、チオレドキシンによりさらに還元される核レドックス因
子Ｒｅｆ−１を通じて間接的に媒介される⁶。さらに、チオレドキシンは、ジスルフィド含有タンパク質の再折り畳み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を容易にし、グル
ココルチコイドレセプターまたはインターロイキン−２レセプターを活性化し、
マクロファージ中でのヒト免疫不全ウイルス発現を阻害し、Ｈ₂Ｏ₂スカベンジ遊
離ラジカルを還元し、酸化ストレスに対して細胞を保護し、そして初期妊娠因子
であることが示されている。

【０００７】クローン化ヒトチオレドキシンは、ＨＴＬＶ−１形質転換Ｔ細胞により放出さ
れる、成人Ｔ細胞白血病由来因子と呼ばれる増殖因子に類似することが示されて
いる⁷。それは、分泌の経路を利用する。細胞外に発現したチオレドキシンは、正常な線維芽細胞、リンパ球系細胞および多数のヒト固形腫瘍細胞株の増殖を刺
激する⁸オヨヒ゛⁹。レドックス不活性型は、この増殖刺激がチオレドキシンのレドックス活性を必要とすることを示すために使用されている⁹。チオレドキシンによる増殖刺激は、他の増殖因子に対して感受性の細胞を通じて間接的に誘導される
ようである¹⁰。続いて、チオレドキシンは、いくつかの原発性腫瘍（例えば、肺
、結腸、頸部および肝細胞癌において過剰に発現されることが報告されている¹¹ 〜¹⁴。さらに、野生型チオレドキシンｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされた
ヒト乳癌細胞は、腫瘍増殖を増加すること¹⁵、インビボでの自発的なアポトーシ
スを減少すること¹⁶および種々の抗癌治療化合物により誘導されるアポトーシス
に対する感受性を減少すること¹⁶を示した。一方、ドミナント−ネガティブなレ
ドックス不活性化変異チオレドキシンを用いてトランスフェクトされた細胞は、
インビトロでの固定化独立（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）増
殖およびインビボでの腫瘍増殖の阻害の減少を示した¹⁵。

【０００８】チオレドキシンレダクターゼは、多数のヒト腫瘍により過剰発現されることが
示されている¹²。抗腫瘍のキノン¹⁷オヨヒ゛¹⁸ニトロソウレア¹⁹および１３−シス− レチノイン酸²⁰による細胞チオレドキシンレダクターゼの阻害は、チオレドキシ
ン系の活性の減少および結果として増殖阻害活性の寄与を導く。

【０００９】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対して配列特異的なハイ
ブリダイゼーションにより標的特異的な様式で、遺伝子発現を阻害するために利
用されている²。癌遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド媒介性抑制は、これらの化合物が癌遺伝子を支配する機構の同定のために有用であり得²¹、そして
また、癌の処置のための新規な治療化合物として見込まれ得る²²ことを明らかに
した。従って、チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼに対して指向
されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定することが望ましく、これらは、
より高い特異性を有しそしてより低い毒性を有するチオレドキシンまたはチオレ
ドキシンレダクターゼの発現を阻害するように作用する。

【００１０】（発明の要旨）本発明は、哺乳動物における腫瘍細胞中のチオレドキシンおよびチオレドキシ
ンレダクターゼの発現を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにこ
のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物に関する。本発明
はまた、哺乳動物における腫瘍細胞の増殖および転移を阻害するためのこのよう
なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する方法に関する。

【００１１】従って、その組成物の１つの局面において、本発明は、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドに関し、このオリゴヌクレオチドは、約３〜約５０のヌクレオチドを
含み、このヌクレオチドは、哺乳動物のチオレドキシンｍＲＮＡまたはチオレド
キシンレダクターゼｍＲＮＡに相補的である。このアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、ヌクレアーゼ抵抗性であり得、そして１つ以上のホスホロチオエートヌ
クレオチド間結合を有し得る。このアンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに、
チオレドキシンｍＲＮＡまたはチオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡに相補的で
ない、さらなるヌクレオチドを含み得る。

【００１２】その組成物の別の局面において、本発明は、約１７〜約５０のヌクレオチドを
含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここでこのオリゴヌクレオチドは
、表１に示される配列２６０１〜２６２６（配列番号１〜２６）からなる群から
選択される配列を含む。

【００１３】その組成物の別の局面において、本発明は、約２０〜約５０のヌクレオチドを
含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここでこのオリゴヌクレオチドは
、表１に示される配列３００１〜３０４０（配列番号２７〜６６）からなる群か
ら選択される配列を含む。

【００１４】その組成物のなお別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤お
よび有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物に関し、この
オリゴヌクレオチドは、約３〜約５０のヌクレオチドを含み、このヌクレオチド
は、哺乳動物のチオレドキシン遺伝子またはチオレドキシンレダクターゼ遺伝子
に相補的である。

【００１５】その組成物のなお別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤お
よび約１７〜約５０のヌクレオチドを含む有効量のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを含む薬学的組成物に関し、このオリゴヌクレオチドは、表１に示される配
列２６０１〜２６２６（配列番号１〜２６）からなる群から選択される配列を含
む。

【００１６】その組成物のなお別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤お
よび約２０〜約５０のヌクレオチドを含む有効量のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを含む薬学的組成物に関し、このオリゴヌクレオチドは、表２に示される配
列３００１〜３０４０（配列番号２７〜６６）からなる群から選択される配列を
含む。

【００１７】その方法の１つの局面において、本発明は、腫瘍を有する疑いのある哺乳動物
に、哺乳動物のチオレドキシン遺伝子に相補的である約３ヌクレオチド〜約５０
のヌクレオチドを含む有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、この腫瘍の
増殖が阻害されるような条件下で投与する工程を包含する、哺乳動物の腫瘍の増
殖を阻害するための方法に関する。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、化
学療法剤とともに投与され得る。

【００１８】その方法の別の局面において、本発明は、腫瘍を有する疑いのある哺乳動物に
、哺乳動物のチオレドキシンレダクターゼ遺伝子に相補的である約３ヌクレオチ
ド〜約５０のヌクレオチドを含む有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、
この腫瘍の増殖が阻害されるような条件下で投与する工程を包含する、哺乳動物
の腫瘍の増殖を阻害するための方法に関する。このアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、化学療法剤とともに投与され得る。

【００１９】その方法の別の局面において、本発明は、転移性腫瘍を有する疑いのある哺乳
動物に、哺乳動物のチオレドキシン遺伝子に相補的な約３ヌクレオチドから約５
０ヌクレオチドを含む有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、この腫瘍の
転移が阻害されるような条件下で投与する工程を包含する、哺乳動物の腫瘍の転
移を阻害するための方法に関する。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、化
学療法剤とともに投与され得る。

【００２０】その方法の別の局面において、本発明は、腫瘍を有する疑いのある哺乳動物に
、哺乳動物のチオレドキシンレダクターゼ遺伝子に相補的な約３ヌクレオチドか
ら約５０ヌクレオチドを含む有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、この
腫瘍の転移が阻害されるような条件下で投与する工程を包含する、哺乳動物の腫
瘍の転移を阻害するための方法に関する。このアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、化学療法剤とともに投与され得る。

【００２１】（発明の詳細な説明）（定義）本明細書中で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有する：用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、本明細書中で使用される場合
、所望のｍＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、こ
のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、チオレドキシンｍＲＮＡか、またはチオ
レドキシンレダクターゼｍＲＮＡに相補的である。このアンチセンスオリゴヌク
レオチドは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域、コード領域、またはｍＲＮＡの３’非
翻訳領域のいずれにも相補的であり得ることが意図される。

【００２２】用語「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基、糖、および糖間（バ
ックボーン）結合からなる、ヌクレオチドのオリゴマー、またはヌクレオチドの
ポリマー、あるいはヌクレオシドモノマーをいう。この用語はまた、同様に機能
する、天然に存在しないモノマーまたはその部分を含む、改変型あるいは置換型
オリゴマーを含む。このような改変型または置換型オリゴマーは、その特性（例
えば、細胞の取り込みの増加、またはヌクレアーゼの存在下における安定性の増
加）ゆえに、天然に存在する形態よりも好まれ得る。この用語はまた、２つ以上
のキメラ的に別個の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドを含む。例えば、キメ
ラオリゴヌクレオチドは、有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性の増加、細
胞への取り込みの増加）を付与する改変型ヌクレオチドの少なくとも１つの領域
を含み得るか、または本発明の２つ以上のオリゴヌクレオチドが組み合わされて
、キメラオリゴヌクレオチドを形成し得る。

【００２３】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸かデオキシリボ核酸で
あり得、そして天然に存在するモノマー塩基かまたは合成モノマー塩基（アデニ
ン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルを含む）を含み得る。このオ
リゴヌクレオチドはまた、改変型塩基（例えば、キサンチン、ヒポキサンチン、
２−アミノアデニン、６−メチルアデニン、２−プロピルアデニン、および他の
アルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、
６−アザシトシン、および６−アザチミン、シュードウラシル、４−チオウラシ
ル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオ
ールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、および他の８−置換型アデ
ニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チ
オアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、および他の８−置換型グアニ
ン、他のアザウラシル、他のアザチミジン、他のアザシトシンまたは他のアザグ
アニン、および他のデアザウラシル、他のデアザチミジン、他のデアザシトシン
または他のデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル、および５−トリ
フルオロシトシン）を含み得る。この改変はまた、このオリゴヌクレオチドの種
々の部分（例えば、糖、塩基、またはバックボーン構成成分を含む）に対する他
の化学基（例えば、メチル、エチル、プロピル基）の付加を含み得る。

【００２４】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ホスフェートバックボーン
、短鎖アルキル糖間結合または短鎖シクロアルキル糖間結合、あるいは短鎖ヘテ
ロ原子糖間結合またはヘテロサイクリック糖間結合において、改変型リン酸素へ
テロ原子を含み得る。例えば、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、メチル
ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステ
ル、およびモルホリノオリゴマーを含み得る。本発明の１つの実施態様において
、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、４〜６個の３’末端ヌクレオチド間
を結ぶ、ホスホロチオエート結合を含む。別の実施態様において、このホスホロ
チオエート結合は、全てのヌクレオチドを結合する。このアンチセンスオリゴヌ
クレオチドはまた、糖模倣物を有し得る。

【００２５】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチドの構造が基本
的に変えられる場合、ヌクレオチドアナログを含み得る。このようなオリゴヌク
レオチドアナログの例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり、ここで、ＤＮＡ（ま
たはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）ホスフェートバックボー
ンは、ペプチド中に見出されるものと類似のポリアミドバックボーンと置換され
る（Ｎｉｅｌｓｅｎら²⁹；ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ³⁰；Ｂｕｃｈａｒｄｔ
（故人）ら³¹、米国特許第５，７６６，８５５号；Ｂｕｃｈａｒｄｔ（故人）ら ³² 、米国特許第５，７１９，２６２号）。ＰＮＡアナログは、酵素による分解に
抵抗性があり、そしてインビボおよびインビトロで伸長した寿命を有することが
示された。ＰＮＡはまた、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間の電荷による反発がないこ
とに起因して、天然に存在する核酸分子によりも、相補的ＤＮＡ配列により強く
結合する。

【００２６】本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ポリマーバックボーン、環状バックボー
ン、または非環状バックボーンを含む他のヌクレオチドを含み得る。例えば、こ
のヌクレオチドは、モルホリノバックボーン構造を含み得る（米国特許第５，０
３４，５０６号³³）。

【００２７】本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレアーゼおよびＲＮＡヌクレアー
ゼによる分解に感受性でないようにか、あるいはそれ自体が、ＤＮＡヌクレアー
ゼまたはＲＮＡヌクレアーゼからオリゴヌクレオチドを保護する送達ビヒクル中
に配置されるようにかのいずれかに改変される場合に、「ヌクレアーゼ抵抗性」
である。ヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドは、例えば、メチルホスホネー
ト、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、およ
びモルホリノオリゴマーを含む。ヌクレアーゼ抵抗性を付与するための適切な送
達ビヒクルは、例えば、リポソームを含む。

【００２８】本発明のオリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性
を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するため
の基のような基を含み得る。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、レポータ
ー基、または標識（例えば、蛍光色素または放射性標識）を含まない。

【００２９】このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、その配列が二重鎖形成
、ヘアピン形成およびホモオリゴマー／配列反復を示す見込みが最も少ないが、
チオレドキシン遺伝子配列またはチオレドキシンレダクターゼ遺伝子配列に結合
する高〜中程度の可能性を有するように、チオレドキシン遺伝子またはチオレド
キシンレダクターゼ遺伝子に相補的な配列から選択される。これらの特性は、コ
ンピューターモデル化プログラムであるＯＬＩＧＯＰｒｉｍｅｒＡｎａｌｙ
ｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＮにより配布される）を
使用して決定され得る。このコンピュータープログラムは、これらの５つのパラ
メーターの定性的評価の決定を可能にする。

【００３０】あるいは、このアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、この配列が、２つ以
上の哺乳動物種間で、チオレドキシン遺伝子かまたはチオレドキシンレダクター
ゼ遺伝子のいずれかについて高度に保存されることに基づいて、選択され得る。
これらの特性は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＣｏｍｐ
ｕｔｅｒグループ（ＧＣＧ）ソフトウェアのＢＬＡＳＴＮプログラム（Ａｌｔｓ
ｃｈｕｌら³⁴）とＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースを使用して、決
定され得る（ＤｅｖｅｒｅｕｘＪ．ら³⁵）。

【００３１】このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、置換、挿入、および欠失のような変
異を含み得る。好ましくは、変異を有する配列の１０％よりも少ない。

【００３２】このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約３ヌクレオチ
ドまたは約３ヌクレオチドアナログを含み、好ましくは約３〜約１００ヌクレオ
チドまたは約３〜約１００ヌクレオチドアナログ、より好ましくは、約３〜約５
０ヌクレオチドまたは約３〜約５０ヌクレオチドアナログ、最も好ましくは、約
１７〜約３５ヌクレオチドまたは約１７〜約３５ヌクレオチドアナログを含む。

【００３３】好ましくは、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表１および表２（以下
）に示される配列を含む。表１ヒトチオレドキシンｍＲＮＡに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレ
オチド

【００３４】

【表１】表２ヒトチオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有するアンチ
センスオリゴヌクレオチド

【００３５】

【表２】表１および表２において、「Ｔｍ」とは、最近接（ｎｅａｒｅｓｔｎｅｉｂ
ｏｕｒ）の熱力学的値に従って計算されるオリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度
である。この温度では、核酸分子の５０％が二重鎖であり、そして５０％が変性
されている。「ΔＧ」とは、そのオリゴヌクレオチドの自由エネルギーであり、
これはオリゴヌクレオチド二重鎖の安定性の大きさである。

【００３６】用語「アルキル」とは、好ましくは１〜２０の炭素原子を有し、そしてより好
ましくは１〜６の炭素原子を有する、１価アルキル基をいう。この用語は、メチ
ル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ヘキ
シルなどのような基により例示される。

【００３７】用語「アリール」とは、単環（例えば、フェニル）かまたは多縮合（融合）環
（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する６〜１４の炭素原子の不飽和芳
香族炭素環基をいう。好ましいアリールは、フェニル、ナフチルなどを含む。

【００３８】用語「シクロアルキル」とは、単環または多縮合環を有する３〜２０の炭素原
子の環状アルキル基をいう。このようなシクロアルキル基には、例示目的のため
に、単環構造（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シク
ロオクチルなど）かまたは多環構造（例えば、アダマンタニルなど）が挙げられ
る。

【００３９】用語「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨ
ードをいい、そして好ましくは、フルオロまたはクロロのいずれかである。

【００４０】用語「チオール」とは、−ＳＨ基をいう。

【００４１】１つ以上の置換基を含む任意の上記の基に関して、もちろん、このような基は
、立体的に実行不可能であり、かつ／または合成により実現不可能である任意の
置換、あるいは置換パターンを含まないことが理解される。さらに、本発明の化
合物は、これらの化合物の置換から生じる全ての立体化学異性体を含む。

【００４２】用語「薬学的に受容可能な塩」とは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの生物学的有効性および特性を保持し、そして生物学的かまたは他の点では所
望でなくはない、塩をいう。多くの場合、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、アミノ基および／もしくはカルボキシル基、またはそれらに類似の基の
存在によって、酸塩および／あるいは塩基塩を形成し得る。

【００４３】薬学的に受容可能な塩基付加塩は、無機塩および有機塩から調製され得る。無
機塩から派生する塩には、例示目的のためのみに、ナトリウム塩、カリウム塩、
リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩が挙げられ
る。有機塩から派生する塩は、１級アミン、２級アミン、および３級アミン（例
えば、アルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、置換型アルキ
ルアミン、ジ（置換アルキル）アミン、トリ（置換アルキル）アミン、アルケニ
ルアミン、ジアルケニルアミン、トリアルケニルアミン、置換型アルケニルアミ
ン、ジ（置換アルケニル）アミン、トリ（置換アルケニル）アミン、シクロアル
キルアミン、ジ（シクロアルキル）アミン、トリ（シクロアルキル）アミン、置
換型シクロアルキルアミン、二置換型シクロアルキルアミン、三置換型シクロア
ルキルアミン、シクロアルケニルアミン、ジ（シクロアルケニル）アミン、トリ
（シクロアルケニル）アミン、置換型シクロアルケニルアミン、二置換型シクロ
アルケニルアミン、三置換型シクロアルケニルアミン、アリールアミン、ジアリ
ールアミン、トリアリールアミン、ヘテロアリールアミン、ジヘテロアリールア
ミン、トリヘテロアリールアミン、ヘテロサイクリックアミン、ジヘテロサイク
リックアミン、トリヘテロサイクリックアミン、混合型ジ−アミンおよび混合型
トリ−アミン）の塩を含むが、これらに限定されず、ここで、このアミン上の少
なくとも２つの置換基が異なり、そして以下からなる基から選択される：アルキ
ル、置換型アルキル、アルケニル、置換型アルケニル、シクロアルキル、置換型
シクロアルキル、シクロアルケニル、置換型シクロアルケニル、アリール、ヘテ
ロアリール、ヘテロサイクリックなど。２つまたは３つの置換基が、アミノの窒
素とともに、ヘテロサイクリック基、またはヘテロアリール基を形成するアミン
もまた、含まれる。

【００４４】適切なアミンの例には、例示目的のためのみに、イソプロピルアミン、トリメ
チルアミン、ジエチルアミン、トリ（イソプロピル）アミン、トリ（ｎ−プロピ
ル）アミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン
、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、
コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン
、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、Ｎ−エチルピ
ペリジンなどが挙げられる。他のカルボン酸誘導体（例えば、カルボキサミド、
低級アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミドなどを含む、カルボン
酸アミド）が、本発明の実施に有用であることもまた、理解されるべきである。

【００４５】薬学的に受容可能な酸付加塩は、無機酸および有機酸から調製され得る。無機
酸から派生する塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられ
る。有機酸から派生する塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン
酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸
、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスル
ホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが挙げらる。

【００４６】用語「チオレドキシン遺伝子」とは、リボヌクレオチドレダクターゼまたはメ
チオニンスルホキシドレダクターゼに対する水素供与体として作用し得るタンパ
ク質をコードする任意の遺伝子をいう。好ましくは、このチオレドキシン遺伝子
は、転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ、ＢＺＬＦ１、ＴＦＩＩＩＣおよびＡＰ−１
）のレドックス特性を調節し得るタンパク質をコードし、そしてそのＤＮＡ結合
特徴を変化させる。このタンパク質が有し得る他の機能は、ジスルフィドを有す
るタンパク質の再折り畳みを容易にする能力、グルココルチコイドレセプターま
たはインターロイキン−２レセプターを活性化する能力、あるいはマクロファー
ジにおいて免疫不全ウイルス発現を阻害する能力、細胞内Ｈ₂Ｏを還元する能力、遊離ラジカルを除去する能力、酸化ストレスに対して細胞を保護する能力、お
よび初期妊娠因子の基本的構成成分として作用する能力が挙げられるが、これら
に限定されない。好ましくは、このチオレドキシン遺伝子は、正常な線維芽細胞
、リンパ球系細胞、および多くのヒト固形腫瘍細胞系の増殖を刺激し得、かつヒ
ト腫瘍において過剰発現した場合に、腫瘍の増殖を刺激しアポトーシスを減少し
得るタンパク質をコードする。

【００４７】用語「チオレドキシンレダクターゼ遺伝子」は、チオレドキシンのＮＡＤＰＨ
依存性還元を触媒し得るタンパク質をコードする任意の遺伝子をいう。

【００４８】用語「相補的」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列が標的配列（すなわ
ち、チオレドキシン遺伝子（またはｍＲＮＡ）またはチオレドキシンレダクター
ゼ遺伝子（またはｍＲＮＡ））に結合し得ることを意味する。好ましくは、アン
チセンスオリゴヌクレオチド配列は、標的配列と少なくとも約７５％同一性、好
ましくはいくつかの塩基のギャップまたはミスマッチを許容して、標的配列と少
なくとも約９０％同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％同一性を有する。
同一性は、例えば、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＣｏｍ
ｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ソフトウェアのＢＬＡＳＴＮプログラムを使
用することによって決定され得る。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ド配列は、本明細書中に記載されるＯＬＩＧＯプログラムによって決定する場合
、少なくとも４５℃、より好ましくは少なくとも約５０℃、最も好ましくは少な
くとも約５５℃の融解温度を有する、チオレドキシンｍＲＮＡまたはチオレドキ
シンレダクターゼｍＲＮＡにハイブリダイズする。

【００４９】用語「増殖を阻害する」は、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５
０％、最も好ましくは少なくとも７５％の、少なくとも１つの腫瘍細胞型の増殖
における減少を意味する。増殖における減少は、ヌードマウスにおける腫瘍のサ
イズ、または腫瘍細胞がインビトロでコロニーを形成することの不可能性を測定
することによって、腫瘍細胞について決定され得る。

【００５０】用語「哺乳動物（ｍａｍｍａｌ）」または「哺乳動物（ｍａｍｍａｌｉａｎ）
」は、ヒト、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウスなどを含む
、すべての哺乳動物を意味する。

【００５１】「腫瘍を有すると疑われる哺乳動物」は、その哺乳動物が、増殖性の障害もし
くは腫瘍を有し得るか、または増殖性の障害もしくは腫瘍と診断されているか、
または増殖性の障害もしくは腫瘍と以前に診断されたことがあり、その腫瘍が外
科的に切除されており、そしてその哺乳動物がいくつかの残留腫瘍細胞を有する
と疑われていることを意味する。

【００５２】（アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製）本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来技術および周知技術によっ
て調製され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、固相合成を用いて、特に市販
の装置（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＣａｎａｄａＩｎ
ｃ．、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｃａｎａｄａから入手可能な装置）を用いて調
製され得る。このオリゴヌクレオチドはまた、当該分野において公知の方法によ
って、天然に存在するチオレドキシン遺伝子またはチオレドキシンレダクターゼ
遺伝子の酵素消化によって調製され得る。

【００５３】（アンチセンスオリゴヌクレオチドの単離および精製）所望される場合、本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの
単離および精製は、例えば濾過、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィー、薄
層クロマトグラフィー、厚層（ｔｈｉｃｋｌａｙｅｒ）クロマトグラフィー、
分取低速液体クロマトグラフィー（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅｌｏｗ−ｐｒｅｓ
ｓｕｒｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）もしくは分取高速液
体クロマトグラフィー、またはこれらの手順の組み合わせのような任意の適切な
分離または精製によってもたらされ得る。しかし、当然のことながら他の等価な
分離または単離手順もまた使用され得る。

【００５４】このアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、オリゴヌク
レオチドの配列を考慮し、そして当該分野において公知の手順を使用して構築さ
れ得る。

【００５５】ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の所望の転写を達成するた
めに必要とされる発現エレメントのすべてを含むように、当業者によって構築さ
れ得る。したがって、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする
配列に作動可能に連結された転写制御配列を含むベクターを提供する。適切な転
写および翻訳エレメントは、種々の供給源（細菌遺伝子、真菌遺伝子、ウイルス
遺伝子、哺乳動物遺伝子、または昆虫遺伝子を含む）に由来し得る。適切なエレ
メントの選択は、選択される宿主細胞に依存する。

【００５６】レポーター遺伝子は、ベクターに含まれ得る。適切なレポーター遺伝子には、
β−ガラクトシダーゼ（例えば、ｌａｃＺ）、クロラムフェニコール、アセチル
−トランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、あるいは免疫グロブリン、また
はその部分が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの転写は、レポータ
ー遺伝子の発現についてのモニタリングによってモニタリングされ得る。

【００５７】このベクターは、当該分野において公知の種々の方法のうちのいずれか１つに
よって、細胞または組織に導入され得る。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｄ
ら²⁴；Ａｕｓｕｂｅｌら²⁵；Ｃｈａｎｇら³⁶；Ｖｅｇａら³⁷；およびＶｅｃｔｏ
ｒｓ：ＡＳｕｒｖｅｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃ
ｔｏｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＵｓｅｓ³⁸において一般に記載されているのが
見出され得、そして例えば安定なトランスフェクションまたは一過性トランスフ
ェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウイル
スベクターでの感染を含む。

【００５８】感染による核酸の導入は、いくつかの利点を提供する。より高い効率性および
組織型についての特異性が入手され得る。ウイルスは、代表的には特定の細胞型
に感染し、そしてその中で増殖する。したがって、ウイルスの特異性を用いて、
インビボ、または組織もしくは細胞の混合された培養物内で、特定の細胞型にベ
クターを標的化し得る。ウイルス性ベクターはまた、レセプター媒介事象を介し
て標的特異性を変更するように、特定のレセプターまたはリガンドで改変され得
る。

【００５９】本発明のオリゴヌクレオチドは、不溶化され得る。例えば、このオリゴヌクレ
オチドは、適切なキャリアに結合され得る。適切なキャリアの例は、アガロース
、セルロース、デキストラン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、カルボ
キシメチルセルロースポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィ
ルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン−メチルビニル−エー
テル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポ
リマー、ナイロン、シルクなどである。キャリアは、例えば、チューブ、試験プ
レート、ビーズディスク、球体などの形状であり得る。

【００６０】不溶化されたオリゴヌクレオチドは、公知の化学的方法または物理学的方法（
例えば、臭化シアンカップリング）を用いて、オリゴヌクレオチドを適切な不溶
性キャリアと反応させることによって調製され得る。

【００６１】本発明のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを切断するリボザイムであり得るこ
とが意図される。好ましくは、リボザイムは、本発明のオリゴヌクレオチドの配
列に相同な配列、およびｍＲＮＡを切断するために必要な触媒中心を有する。例
えば、チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡを破壊する相
同なリボザイム配列が選択され得る。本発明において利用されるリボザイム型は
、当該分野において公知の型から選択され得る。いくつかのリボザイム構造ファ
ミリーが同定されており、これにはＩ型イントロン、ＲＮａｓｅＰ、δ型肝炎
ウイルスリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、およびタバコリングスポット
ウイルスサテライトＲＮＡ（ｓＴＲＳＶ）の負鎖に元々は由来するヘアピンリボ
ザイムが挙げられる（Ｓｕｌｌｉｖａｎ１９９４，米国特許第５，２２５，３
４７号³⁹）。ハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムモチーフは、遺伝子治療
のためのｍＲＮＡのトランス切断に最も一般的に適合される（Ｓｕｌｌｉｖａｎ
１９９４）。本発明において、好ましくはヘアピンリボザイムが使用される。
一般に、リボザイムは、３０〜１００ヌクレオチド長である。

【００６２】（薬学的処方物）薬剤として使用される場合、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、
薬学的組成物の形態で投与される。これらの化合物は、経口、直腸、経皮、皮下
、静脈内、筋肉内、および鼻内を含む、種々の経路によって投与され得る。これ
らの化合物は、注射用組成物および経口組成物の両方として有効である。そのよ
うな組成物は、薬学分野において周知の様式で調製され、そして少なくとも１つ
の活性化合物を含む。例えば、この薬学的組成物は、静脈内に投与される。この
薬学的組成物は、処置されるべき腫瘍に直接投与され得ることが意図される。

【００６３】本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、活
性成分として１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物を
含む。本発明の組成物を作製する際に、活性成分は、通常、賦形剤と混合され、
賦形剤によって希釈されるか、またはカプセル、少量入りの袋（ｓａｃｈｅｔ）
、紙、または他の容器の形態であり得るキャリア内に封入される。賦形剤が希釈
剤として作用する場合、賦形剤は、固体物質、半固体物質、または液体物質であ
り得、これは、活性成分のビヒクル、キャリア、または媒体として作用する。し
たがって、この組成物は、錠剤、丸剤、粉末、口内錠、少量入りの袋（ｓａｃｈ
ｅｔ）、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エ
アロゾル（固体として、または液体媒体中で）、例えば１０重量％までの活性化
合物を含む軟膏、軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌の
注射用液、および滅菌のパックされた粉末の形態であり得る。

【００６４】処方物の調製において、他の成分と組み合わせる前に適切な粒子サイズを提供
するために、活性化合物を粉末にすることが必要であり得る。活性化合物が実質
的に不溶性である場合、活性化合物は、通常２００メッシュ未満の粒子サイズま
で粉末化される。活性化合物が実質的に水溶性である場合、粒子サイズは、通常
、処方物中の実質的に一定の分布を提供するように粉末化（例えば、約４０メッ
シュ）することによって調節される。

【００６５】適切な賦形剤のいくつかの例には、ラクトース、デキストロース、スクロース
、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、
アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロー
ス、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセル
ロースが挙げられる。処方物はさらに、以下を含み得る：タルク、ステアリン酸
マグネシウム、および鉱油のような潤滑剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；メチ
ルベンゾエートおよびプロピルヒドロキシベンゾエートのような保存剤；甘味剤
；および香味剤。本発明の組成物は、当該分野において公知の手順を使用するこ
とによる患者への投与の後の、活性成分の、迅速な放出、徐放、または遅延性放
出を提供するように、処方され得る。

【００６６】組成物は、好ましくは、単位投薬形態で処方され、各々の投薬量は、約３ｍｇ
から約３ｇ、より通常には約１０ｍｇから約１．５ｇの活性成分を含む。用語「
単位投薬形態」は、ヒト被験体および他の哺乳動物についての単位投薬量として
適切な物理的に個々の単位をいい、各単位は、適切な薬学的賦形剤と組み合わせ
て、所望の治療効果を生じるように計算された活性な物質の所定の量を含む。

【００６７】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、広い投薬量範囲で有効であり、そして一
般に、薬学的に有効な量で投与される。有効な量は、投与された場合に症状を軽
減する量である。好ましくは、有効な量は、腫瘍細胞増殖を阻害し得る量である
。好ましくは、有効な量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重で
ある。しかし、実際に投与されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの量は、関連
する状況（処置される状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物、個
々の患者の年齢、体重、および応答、患者の症状の重篤度などを含む）を考慮し
て、医師によって決定される。治療過程は、数日から数ヶ月、または疾患の軽減
が達成されるまで継続され得る。

【００６８】錠剤のような固体組成物を調製するために、主な活性成分／アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを薬学的賦形剤と混合し、本発明の化合物の均質な混合物を含む
固体の予備処方組成物を形成する。これらの予備処方組成物を均質という場合、
活性な成分は、組成物中に均等に分散され、その結果組成物は、錠剤、丸剤、お
よびカプセルのような等価的に有効な単位投薬形態に容易に細分割され得ること
を意味する。

【００６９】本発明の錠剤または丸剤は、長期の作用という利点を与える投薬形態を提供す
るように、コートされ得るか、またはその他の様式で調合され得る。例えば、錠
剤または丸剤は、内側投薬成分および外側投薬成分を含み得、外側投薬成分は、
内側投薬成分を覆う包みの形態である。２つの成分は、胃中での崩壊に耐え、そ
して内側成分がインタクトに十二指腸に入るか、または放出が遅延されるのを可
能にするように作用する腸溶解性の層によって分離され得る。そのような腸溶解
性の層またはコーティングのために、種々の物質（例えば、多くのポリマー状酸
（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃａｃｉｄ）、ならびにセラック、セチルアルコール、お
よび酢酸セルロースのような物質とのポリマー状酸の混合物を含む）が使用され
得る。

【００７０】本発明の新規な組成物が経口投与、または注射による投与のために組み込まれ
得る液体形態には、水溶液、適切に香味付けされたシロップ、水性懸濁液または
油性懸濁液、および、トウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油、または
ピーナッツ油のような食用油との香味付けされたエマルジョン、ならびにエリキ
シル剤、および類似の薬学的ビヒクルが挙げられる。

【００７１】吸入またはガス吸入のための組成物には、薬学的に受容可能な水性溶媒もしく
は有機溶媒、またはその混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が挙げられ
る。液体組成物または固体組成物は、本明細書中に記載されるような適切な薬学
的に受容可能な賦形剤を含み得る。好ましくは、この組成物は、局所効果または
全身性効果のための経口または経鼻の呼吸経路によって投与される。好ましく薬
学的に受容可能な溶媒中の組成物は、不活性ガスによって霧状にされ得る。霧状
にされた溶液は、霧状化デバイスから直接的に吸入され得るか、または霧状化デ
バイスは、フェイスマスクテント、または間欠的陽圧呼吸装置に取り付けられ得
る。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、適切な様式で処方物を送達するデバイ
スから、好ましくは経口的または経鼻的に投与され得る。

【００７２】本発明の方法において使用される別の好ましい処方物は、経皮送達デバイス（
「パッチ」）を使用する。そのような経皮パッチを使用して、制御された量の本
発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続的または不連続的注入を提供し得
る。薬剤の送達のための経皮パッチの構築および使用は、当該分野において周知
である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号⁴⁰（本明細書中において参考
として援用される）を参照のこと。そのようなパッチは、薬剤の連続的送達、拍
動性送達、または必要があり次第の送達のために構築され得る。

【００７３】送達の別の好ましい方法は、皮膚層を通るネイキッドアンチセンスオリゴヌク
レオチドの「ショットガン」送達を含む。「ネイキッド」アンチセンスオリゴヌ
クレオチドの送達は当該分野において周知である。例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、
米国特許第５，５８０，８５９号⁴¹を参照のこと。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの「ショットガン」送達の前に脂質小
胞中に封入され得ることが意図される。

【００７４】以下の処方例は、本発明の代表的な薬学的組成物を例示する。

【００７５】（処方例１）以下の成分を含む硬ゼラチンカプセルを調製する：

【００７６】

【表３】上記成分を混合し、３４０ｍｇ量で硬ゼラチンカプセルに充填する。

【００７７】（処方例２）錠剤処方は、以下の成分を用いて調製する：

【００７８】

【表４】成分を混合し、そして圧縮して錠剤を形成する（各々、２４０ｍｇの重量であ
る）。

【００７９】（処方例３）以下の成分を含む乾燥粉末呼吸器処方物を調製する：

【００８０】

【表５】活性成分をラクトースと混合し、そしてその混合物を乾燥粉末吸入器に添加す
る。

【００８１】（処方例４）各々３０ｍｇの活性成分を含む錠剤を、以下のように調製する：

【００８２】

【表６】活性な成分であるデンプンおよびセルロースをＮｏ．２０のＵ．Ｓ．メッシュ
ふるいを通過させ、そして徹底的に混合する。ポリビニルピロリドンの溶液を、
得られた粉末と混合し、次いでこれを１６のＵ．Ｓ．メッシュふるいを通過させ
る。このように作製した顆粒を５０℃〜６０℃で乾燥し、そして１６のＵ．Ｓ．
メッシュふるいを通過させる。次いで、事前にＮｏ．３０のＵ．Ｓ．メッシュふ
るいを通過したカルボキシメチルナトリウムデンプン、ステアリン酸マグネシウ
ムおよび滑石を顆粒に添加し、その混合後、これらを錠剤機で圧縮し、それぞれ
１２０ｍｇの重量の錠剤を作製する。

【００８３】（製剤の実施例５）それぞれ４０ｍｇの医薬を含有するカプセルを以下のように作製する：成分量（ｍｇ／カプセル）活性成分４０．０ｍｇデンプン１０９．０ｍｇステアリン酸マグネシウム１．０ｍｇ合計１５０．０ｍｇ。

【００８４】活性成分、デンプンおよびステアリン酸マグネシウムを混合し、Ｎｏ．２０の
Ｕ．Ｓ．メッシュふるいを通し、そして１５０ｍｇの量を硬質のゼラチンカプセ
ルに充填した。

【００８５】（製剤の実施例６）それぞれ２５ｍｇの活性成分を含有する座剤を以下のように作製する：成分量活性成分２５ｍｇ飽和脂肪酸グリセリド〜２，０００ｍｇ。

【００８６】活性成分を、Ｎｏ．６０のＵ．Ｓ．メッシュふるいに通し、そして必要最小限
の熱を使用して事前に融解した飽和脂肪酸グリセリドに懸濁する。次いで、混合
物を名目上２．０ｇ容積の座薬の鋳型に流し込み、そして冷却させる。

【００８７】（製剤の実施例７）５．０ｍＬの用量あたりそれぞれ５０ｍｇの医薬を含有する懸濁液を、以下の
ように作製する：成分量活性成分５０．０ｍｇキサンタンガム４．０ｍｇカルボキシメチルセルロースナトリウム（１１％）微結晶性セルロース（８９％）５０．０ｍｇショ糖１．７５ｇ安息香酸ナトリウム１０．０ｍｇ香料および色素任意精製水〜５．０ｍＬ。

【００８８】活性成分、ショ糖、およびキサンタンガムを混合し、Ｎｏ．１０のＵ．Ｓ．メ
ッシュふるいを通し、次いで微結晶性セルロースおよびカルボキシメチルセルロ
ースナトリウムの水中に事前に作製した溶液と混合する。安息香酸ナトリウム、
香料、および色素をいくらかの水で希釈し、そして撹拌しながら添加する。次い
で、十分な水を添加し必要な容量を作製する。

【００８９】（製剤の実施例８）成分量（ｍｇ／カプセル）活性成分１５．０ｍｇデンプン４０７．０ｍｇステアリン酸マグネシウム３．０ｍｇ合計４２５．０ｍｇ。

【００９０】活性成分、デンプンおよびステアリン酸マグネシウムを混合し、Ｎｏ．２０の
Ｕ．Ｓ．メッシュふるいを通し、そして４２５．０ｍｇの量を硬質のゼラチンカ
プセルに充填した。

【００９１】（製剤の実施例９）製剤は以下のように調製され得る：成分量活性成分５．０ｍｇトウモロコシ油１．０ｍＬ。

【００９２】（製剤の実施例１０）局所用製剤は、以下のように調製され得る：成分量活性成分１〜１０ｇ乳化ワックス３０ｇ液体パラフィン２０ｇ白色軟性パラフィン〜１００ｇ。

【００９３】白色軟性パラフィンを溶解するまで加熱する。液体パラフィンおよび乳化ワッ
クスを混合し、そして溶解するまで撹拌する。活性成分を添加し、そして分散さ
れるまで撹拌を続ける。次いで、混合物を固まるまで冷却する。

【００９４】本発明において用いるために適切な他の製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ²³に見出され得る。

【００９５】アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含
む薬学的組成物は、適切な容器に包装された必要な物質を提供する便利なキット
に包装され得る。

【００９６】本発明のオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、腫瘍細胞の増殖を調節する
。従って、哺乳動物における腫瘍細胞の増殖を干渉または阻害するための方法が
提供される。この方法は、腫瘍または腫瘍細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌ
クレオチドと接触させる工程を含む。

【００９７】用語「接触」は、オリゴヌクレオチド、リボザイムなどを細胞懸濁液もしくは
組織サンプルに添加する工程、またはオリゴヌクレオチドなどを直接もしくは間
接的に動物内の細胞もしくは組織に投与する工程をいう。

【００９８】この方法は、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、肉腫、黒色腫
、腺腫、固体組織の癌腫、低酸素腫瘍、口、咽頭、喉頭および肺の扁平上皮癌、
頸部癌および膀胱癌のような尿生殖器の癌、造血器官の癌、結腸癌、乳癌、膵臓
癌、腎臓癌、脳の癌、皮膚癌、肝臓癌、頭頸部の癌、ならびに神経系の癌のよう
な種々の癌の形態、ならびに乳頭腫のような良性病変を含む増殖性の障害を処置
するために用いられ得る。乾癬のような他の増殖傷害ならびに関節硬化症、血管
形成、およびウイルス感染を含む他の増殖傷害もまた含まれる。

【００９９】本発明のオリゴヌクレオチドはまた、薬物耐性の腫瘍を処置するために用いら
れ得る。薬物耐性腫瘍の例は、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メト
トレキサートまたはヒドロキシ尿素のような化学療法剤に対して耐性の腫瘍、な
らびにコルヒチン、ビンブラスチンおよびドキソルビシンのような複数の抗癌薬
に対して抵抗性を与えることが公知であるＰ−糖タンパク質を高レベル発現する
腫瘍；またはＤｒｅｅｌｅｙら⁴³によって記載されるように多剤耐性のタンパク
質を発現する腫瘍である。従って、本発明のオリゴヌクレオチドが、公知の抗癌
化合物または化学療法剤と組み合わせてまたはこれに追加して投与され得ること
が意図される。化学療法剤は、腫瘍の増殖を阻害し得る化合物である。このよう
な化合物としては、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキサー
トおよびヒドロキシ尿素が挙げられるがこれらに限定されない。化学療法剤の量
が有効量（すなわち、腫瘍の増殖を阻害するのに十分な量）または有効量未満の
いずれかであり得ることが意図される。

【０１００】本発明のオリゴヌクレオチドは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌、ＨＴ−２９結
腸腺癌、Ａ５４９肺癌腫およびＡ２０５８黒色腫癌細胞のような転移性である腫
瘍の増殖を減弱することが見出されている。本発明の実施態様において、哺乳動
物における転移性腫瘍の増殖を減弱する方法が提供される。この方法は、チオレ
ドキシンｍＲＮＡもしくはチオレドキシンリダクターゼｍＲＮＡに相補的な一定
量のオリゴヌクレオチド、または表１および２に示される一定量のオリゴヌクレ
オチドを投与する工程を含む。

【０１０１】オリゴヌクレオチドは、ウイルスまたは非ウイルスベクターを用いて送達され
得る。配列は、本発明のオリゴヌクレオチドが細胞において発現されるようにカ
セットまたは構築物に組み込まれ得る。好ましくは、この構築物は、オリゴヌク
レオチドが細胞において転写されることを可能にする適切な転写調節領域を含む
。

【０１０２】従って、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドをコードする配列に作動可能
に連結された転写調節配列を含むベクターを提供する。本発明は、さらに、これ
らのベクターで形質転換される適切な真核生物細胞および原核生物細胞から選択
される宿主細胞を提供する。

【０１０３】適切なベクターが公知であり、そして好ましくは配列の所望の転写を得るため
に必要な発現エレメントの全てを含む。ファージミドは、このような有利なベク
ターの特定の例である。なぜならファージミドは、プラスミドとしてか、または
バクテリオファージベクターとしてのいずれかで用いられ得るからである。ベク
ターの例としては、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、
ＤＮＡウイルス、リポソームおよび他の組換えベクターのようなベクターが挙げ
られる。ベクターはまた、原核生物宿主系または真核生物宿主系のいずれかにお
いて用いるためのエレメントを含み得る。当業者は、どの宿主系が特定のベクタ
ーに適合性であるかを公知である。

【０１０４】ベクターは、安定なまたは一時的なトランスフェクション、リポフェクション
、エレクトロポレーションおよび組換えウイルスベクターでの感染により細胞に
導入され得る。

【０１０５】さらなる特徴が、ベクターの安全性を保証するためおよび／またはベクターの
治療的有効性を増強するためにベクターに追加され得る。このような特徴として
は、例えば、組換えウイルスに感染した細胞に対してネガティブ選択するために
用いられ得るマーカーが挙げられる。このようなネガティブ選択マーカーの例は
、抗ウイルスガンシクロビルに対して選択性を与えるＴＫ遺伝子である。特定の
細胞型に対する発現を制限する特徴もまた、含まれ得る。このような特徴として
は、例えば、所望の細胞型に特異的なプロモーターおよび調節エレメントが挙げ
られる。

【０１０６】レトロウイルスベクターは、所望の核酸のインビボ導入のために有用なベクタ
ーの別の例である。なぜなら、このベクターは、隣接感染（ｌａｔｅｒａｌｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｎ）および標的特異性のような利点を提供するからである。隣接
感染は、単回感染した細胞が、隣接する細胞に感染する多くの子孫ビリオンを産
生する過程である。この結果、大領域が迅速に感染する。

【０１０７】本発明の方法において用いられるべきベクターは、標的化されるべき所望の細
胞型に依存して選択され得る。例えば、乳癌が処置されるべき場合には、上皮細
胞に特異的なベクターが用いられ得る。同様に、造血系の細胞が処置されるべき
場合には、血液細胞に特異的なウイルスベクターが好ましい。

【０１０８】（有用性）本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、種々の目的のために用いられ得
る。それらは、哺乳動物細胞においてチオレドキシン遺伝子の発現を阻害するた
めに用いられ得、その細胞の増殖を阻害する。それらは、哺乳動物細胞において
チオレドキシンリダクターゼ遺伝子の発現を阻害するために用いられ得、その細
胞の増殖を阻害する。オリゴヌクレオチドは、哺乳動物細胞におけるチオレドキ
シンのｍＲＮＡまたはチオレドキシンリダクターゼのｍＲＮＡの存在を検出する
ためのハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。そのように用いる
場合、オリゴヌクレオチドは、適切な検出可能基（例えば、放射性同位体、リガ
ンド、特異的結合対の別のメンバー、例えばビオチン）で標識され得る。最後に
、オリゴヌクレオチドは、分子量マーカーとして用いられ得る。

【０１０９】本発明およびその利点をさらに例証するため、以下の特定の実施例を提供する
が、どのような方法でも請求の範囲を制限することは意図しない。

【０１１０】（実施例）以下の実施例において、すべての温度は、摂氏温度（他に示さない限り）であ
り、そして全てのパーセンテージは、重量パーセンテージ（これも、他に示さな
い限り）である。

【０１１１】以下の実施例において、以下の略語は、以下の意味を有する。略語を規定しな
い場合には、一般的に受容される意味を有する： μＭ＝マイクロモル濃度ｍＭ＝ミリモル濃度Ｍ＝モル濃度ｍｌ＝ミリリットル μｌ＝マイクロリットルｍｇ＝ミリグラム μｇ＝マイクログラムＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動ｒｐｍ＝１分あたりの回転 △Ｇ＝自由エネルギー、オリゴヌクレオチド二本鎖安定性の測定ｋｃａｌ＝キロカロリーＦＢＳ＝胎仔ウシ血清ＤＴＴ＝ジチオトレイトールＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウムＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水ＰＭＳＦ＝フッ化フェニルメチルスルホニル。

【０１１２】（分子生物学の一般的方法：）当該分野で公知であり、そして詳細に記載されていない標準的な分子生物学の
技術は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら²⁴；Ａｕｓｕｂｅｌら²⁵；およびＰｅｒ
ｂａｌ²⁶に従った。

【０１１３】（オリゴヌクレオチド）アンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列が二重鎖形成、ヘアピン形成、およ
びホモオリゴマー／配列の反復を示す可能性が最も低いが、それぞれ、チオレド
キシンｍＲＮＡ配列またはチオレドキシンリダクターゼｍＲＮＡ配列に高い結合
能力を有するように、チオレドキシンのｍＲＮＡまたはチオレドキシンリダクタ
ーゼのｍＲＮＡに相補的な配列から選択した。さらに、ヒトおよびマウスにおけ
る、他の頻繁に生じる配列または反復配列に対する偽のプライミングを排除した
。これらの特性を、コンピューターモデリングプログラム（ＯＬＩＧＯ（登録商
標）プライマー分析ソフトウエア、バージョン５．０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．ＰｌｙｍｏｕｔｈＭＮ）を用いて決
定した。チオレドキシンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関しては、
５オリゴヌクレオチド（２６０１〜２６０５）を、５’非翻訳領域に標的化する
ために選択し、２オリゴヌクレオチド（２６０６〜２６０７）は、翻訳開始部位
の周囲を標的化し、１２オリゴヌクレオチド（２６０８〜２６１９）は、コード
領域を標的化し、一方、７オリゴヌクレオチド（２６２０〜２６２６）は、３’
非翻訳領域にハイブリダイズした。６６の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの全てを、設計し、次いでＤａｌｔｏｎＣｈｅｍｉｃａｌＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓＩｎｃ．（ＮｏｒｔｈＹｏｒｋ，Ｃａｎａｄａ）またはＴｒｉＬ
ｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ．）のいずれかから購入した。

【０１１４】（細胞株）ヒト正常胚性肺細胞株ＷＩ−３８、および線維肉腫（ＨＴ−１０８０）、肺癌
腫（Ａ５４９）、卵巣腺癌（ＳＫ−ＯＶ−３）、肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）、黒
色腫（Ｃ８１６１）、乳房腺癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、転移性膵臓腺癌（Ａ
ｓＰＣ−１）、結腸腺癌（ＨＴ−２９）、頸部癌（ＨｅＬａＳ３）、ヒト黒色
腫細胞株Ａ２０５８、ヒト膵臓癌ＳＵ．８６．８６を含む１０の異なるヒト癌細
胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。こ
の細胞株を、１０％の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補充したα−ＭＥＭ培地（Ｇｉ
ｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で維持した。

【０１１５】（実施例１ヒト癌細胞株におけるチオレドキシンの過剰発現）異なる細胞株由来の細胞懸濁液のアリコートを組織培養皿に加え、サブコンフ
ルエント（７０−８０％）まで増殖させた。チオレドキシンのｍＲＮＡまたはタ
ンパク質のレベルをノーザンブロット分析またはウェスタンブロット分析によっ
てそれぞれ決定した。

【０１１６】ノーザンブロット分析を先に記載したように（ＨｕｒｔａおよびＷｒｉｇｈｔ ²³ ）若干の改変を伴って行った。手短に言えば、細胞の全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ
試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇＭＤ）を使用して、指
示された時間で細胞から調製した。ＲＮＡ（１０〜２０μｇ）を１．５％ホルム
アルデヒドゲル上で分画し、そしてナイロン膜に転写した。このブロットを、テ
ンプレートとして、順方向プライマー（配列番号６９）（５’−ＣＡＧＡＴＣ
ＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＴＧ−３’）、逆方向プライマー（配列番号
７０）（５’−ＴＴＣＡＴＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＡＡ−３’
）およびヒト肝臓５’−伸長およびｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，
ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を使用して合成された³²Ｐ標識の３００ｂｐのＰＣ
Ｒフラグメントとハイブリダイズした。チオレドキシンヌクレオチド配列情報を
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７７５８５から入手した。ヒトチオレドキシンｍＲＮ
Ａを５２０ｂｐ転写物（Ｔａｇａｙａら²⁸）として発現させ、そしてオートラジ
オグラフィーまたはｐｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙ
ｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して可視化および定量化した
。

【０１１７】グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを
、ＲＮＡローディングコントロールのために同時にプローブした。再びＰＣＲを
用いて、上記に記載した同じｃＤＮＡライブラリーから、順方向プライマー（配
列番号７１）（５’−ＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴ
−３’）および逆方向プライマー（配列番号７２）（５’−ＧＣＡＡＴＧＣ
ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＣ−３’）を使用して３０８ｂｐのＧＡＰＤ
ＨＤＮＡプローブを生成した。

【０１１８】図１に明確に記載されるように、チオレドキシンのｍＲＮＡは、９の異なる全
ての腫瘍細胞株において、正常な細胞と比較して有意により高い発現レベルを示
した。しかし、発現の程度は異なる細胞株間で変化し、そして過剰発現の約１．
５〜５．６倍の範囲を示した。

【０１１９】全細胞タンパク質抽出物を、５０〜１５０μｌの２×サンプルローディング緩
衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，０．２ＭＤＴＴ，４％
ＳＤＳ，２０％グリセロールおよび０．０１５％ブロモフェノールブルー）中に
調製した。ウェスタンブロッティング分析を先に記載したように（Ｃｈｏｙら²⁹ およびＦａｎら³⁰）若干の改変を伴って行った。タンパク質抽出物（１０〜２０
μｇ）を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分画し、ニトロセルロース膜に転写
し、そしてインドインク染色によって可視化した。チオレドキシンの発現を、抗
チオレドキシン抗体（０．２〜１μｇ／ｍｌ）（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃａＩｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）、続いて、１：８，００
０の希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で検出した。約１２ｋＤａのタンパク質をＥＬＣ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）によって可視化した。

【０１２０】図１Ｂに示されるように、ｍＲＮＡ発現パターンにおいて認められた変化の程
度に酷似するタンパク質発現パターンとして、チオレドキシンのｍＲＮＡとタン
パク質のレベルの間に優位な相関関係が存在した。図１Ｂの下位のパネルは、全
タンパク質ローディングがパネルを超えて一致したことを示す。

【０１２１】（実施例２．チオレドキシンに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによ
る癌細胞株の増殖阻害）２６の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された癌細胞株のコロニ
ー形成能力を、先に記載した方法（Ｃｈｏｙら²⁹）を用いて推定した。詳細には
、腫瘍細胞懸濁液のアリコートを約１×１０⁴の密度で組織培養皿に播種し、そして１０％ＦＢＳを補充したα−ＭＥＭ培地にて３７℃で一晩インキュベート
した。細胞を５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、そして０．２μＭの指示されたアア
ンチセンスオリゴヌクレオチドで、陽イオン性脂質（リポフェクチン試薬，最終
濃度５μｇ／ｍｌ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の
存在下で４時間処理した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞をＰＢＳで
１回洗浄することによって除去し、そして細胞を増殖培地（１０％ＦＢＳを補
充したα−ＭＥＭ培地）にて７〜１０日間３７℃で培養した。コロニーをメチレ
ンブルーで染色し、そして記載されるように（Ｃｈｏｙら²⁹ならびにＨｕａｎｇ
およびＷｒｉｇｈｔ³¹）直接的に計数することによって評価した。パーセント阻
害を、アンチセンスオリゴヌクレオチドの非存在下で増殖させた培養物中に存在
するコロニーの数と比較することによって計算した。全ての実験を４連で行った
。

【０１２２】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト腫瘍細胞株のコロニー形成能力に対
して阻害効果を及ぼした。各アンチセンスオリゴヌクレオチドのパーセント阻害
を、ヒト結腸細胞株ＨＴ−２９については図３Ａ；ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１については図３Ｂ；ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２については図３Ｃ；ヒ
ト黒色腫細胞株Ａ２０５８については図３Ｄ；ヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３
については図３Ｅ；およびヒト肺癌細胞株Ａ５４９については図３Ｆに示す。

【０１２３】（実施例３．チオレドキシンに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでの
処理後に減少するｍＲＮＡレベル）ヒトの肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）または乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）
をサブコンフルエント（７０〜８０％）まで増殖させ、そしてチオレドキシンに
相補的な０．２μＭのホスホロチオネートアンチセンスオリゴヌクレオチドで、
陽イオン性脂質（リポフェクチン試薬，最終濃度５μｇ／ｍｌ，Ｇｉｂｃｏ−Ｂ
ＲＬ）およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の存在下で４時間処置し
た。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そして細胞を１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ
培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）にて１６時間インキュベートした。全ＲＮＡをＴＲ
Ｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に調製し、そしてノーザンブロット分析を
以前に記載したように行った。ヒトチオレドキシンのｍＲＮＡレベルを定量化し
、そしてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに規準化し、そして未処理細胞から得られ
たチオレドキシンのｍＲＮＡレベルのパーセントとして例示した。図４Ａおよび
図４Ｂは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、チオレドキシンのｍＲＮＡレベ
ルをコントロール細胞の少なくとも５０％まで減少させることを示す。

【０１２４】（実施例４．チオレドキシンに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでの
処置後の種々の細胞株におけるチオレドキシンタンパク質発現の減少）種々の細胞株をサブコンフルエント（７０〜８０％）まで増殖させ、そして０
．２μＭのホスホロチオネートアンチセンスオリゴヌクレオチドで、陽イオン性
脂質（リポフェクチン試薬，最終濃度５μｇ／ｍｌ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）およ
びＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の存在下で４時間処理した。細胞を
ＰＢＳで１回洗浄し、そして細胞を１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地（Ｇｉ
ｂｃｏ−ＢＲＬ）にて２０時間インキュベートした。次いで、処理およびインキ
ュベーションを、全細胞タンパク質抽出物を２×サンプルローディング緩衝液（
１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，０．２ＭＤＴＴ，４％ＳＤＳ
，２０％グリセロールおよび０．０１５％ブロモフェノールブルー）中に調製す
る前に再度繰り返し、そしてウェスタンブロット分析を先に記載したように（Ｃ
ｈｏｙら²⁹およびＦａｎら³⁰）若干の改変を伴って行った。チオレドキシンの発
現を、抗チオレドキシン抗体（０．２〜１μｇ／ｍｌ）（ＡｍｅｒｉｃａｎＤ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃａＩｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）、続いて、１：
８，０００の希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で検出した。約１２ｋＤａのタンパク質をＥＬＣ（
Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）によって可視
化した。

【０１２５】試験された細胞株は、ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９（図５Ａ）およびＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−２３１ヒト乳癌細胞（図５Ｂ）であった。タンパク質レベルは、指示された
アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置によって減少された。

【０１２６】３の異なるヒト腫瘍細胞株（結腸癌、乳癌および肝臓癌について、それぞれ、
ＨＴ−２９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｅｐＧ２）を、上記に示される０．
２μＭのオリゴヌクレオチド２６０１（配列番号１）で処置した。図５Ｃは、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドによる、各細胞株におけるチオレドキシンタンパ
ク質発現の阻害を示す。下位のパネルは、タンパク質ローディングがパネルを超
えて一致したことを示す。

【０１２７】（実施例５．マウスにおけるチオレドキシンに相補的なアンチセンスオリゴヌ
クレオチドでの静脈内処置によるヒト腫瘍細胞増殖の阻害）ＣＤ−１胸腺欠損ヌードマウスをＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ（ＭｏｎｔｒｅａｌＣａｎａｄａ）から購入した。ＨＴ−２９ヒ
ト結腸癌細胞（代表的に、１００μｌのＰＢＳ中に３×１０⁶細胞）を、６〜７週齢のＣＤ−１胸腺欠損雌ヌードマウス右側腹部に皮下注射した。各実験群は５
匹のマウスを含んだ。腫瘍のサイズが約１００ｍｍ³の容積に達した後（代表的には腫瘍細胞注射後５日後）、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、尾静
脈にボーラス注入によって１日おきに１０ｍｇ／ｋｇで投与した。コントロール
動物は、同じ期間、生理食塩水のみを受ける。処置は、代表的に、その後１０日
間続いた。

【０１２８】図６Ａは、ＣＤ−１ヌードマウスにおけるＨＴ−２９腫瘍増殖に対するアンチ
センスオリゴヌクレオチドの効果を示す。抗腫瘍活性を腫瘍容積の阻害によって
推定した。これは、キャリパを用いて９日間にわたり２日間隔の平均で測定した
。図の各ポイントは、実験群あたり５匹の動物から算定された平均腫瘍容積を示
す。共分散分析を使用して、各処置群における時間にわたるマウスの回帰曲線を
比較した。勾配が等しい場合、傾きの同等性、または切片の同等性の特定の仮説
は、この分析に由来する。全ての分析はＳＡＳ（ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＡｎ
ａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ）バージョン６．１２を使用した。生理食塩水コン
トロールと比較した場合、図６Ａに示される各アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、腫瘍の増殖を阻害（ｐ値≦０．０００１）した。

【０１２９】この処置の最後（通常、最後の処置の２４時間後）で動物を屠殺し、そして腫
瘍の重量を測定した。図６Ｂは腫瘍の平均重量を示す。アンチセンスオリゴヌク
レオチドは、腫瘍増殖に対して有意な阻害効果を示した。一元分散分析を使用し
て、処置群の平均値を比較した。群全体の効果が有意である場合、最小平方平均
を用いる経験的な多重比較を使用して、有意に異なる処置群の対を見出した。腫
瘍重量を比較した場合、各アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、生理食塩水
コントロールと比較すると統計的に有意な阻害（ｐ値≦０．０１９８）を示した
（図６Ｂ）。

【０１３０】ＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞を、６〜７週齢のＣＤ−１無胸腺雌性ヌードマウス
の右側腹部に皮下注射した。腫瘍の大きさが約１００ｍｍ³の体積に達した後（代表的には腫瘍細胞注射後５日）、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、
隔日で１０ｍｇ／ｋｇ、尾静脈中へのボーラス注入によって投与した。コントロ
ール動物に、生理食塩水のみを同一期間投与した。マウスを、８回の注射後に屠
殺し、そして類似した大きさの切除した腫瘍フラグメントを、ＲＩＰＡ抽出緩衝
液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％
ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．０２
％ＮａＮ₃、１ｍＭＰＭＳＦおよび１０μＭロイペプチン）に速やかに収集し、そしてタンパク質調製のために迅速にホモジナイズした。アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドのチオレドキシンタンパク質レベルへの効果を測定するために、
ウェスタンブロット分析を、いくつかの改変を加えて以前に記載されたように行
った（Ｃｈｏｙら²⁹およびＦａｎら³⁰）。このタンパク質抽出物（１０〜２０μ
ｇ）を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分画し、ニトロセルロースメンブランに
転写し、そして墨（Ｉｎｄｉａｉｎｋ）染色によって可視化した。チオレドキ
シンの発現を、抗チオレドキシン抗体（０．２〜１μｇ／ｍｌ）（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａＩｎｃ．，Ｇｒｅｅｗｉｃｈ，ＣＴ）に続いて
１：８，０００の希釈度の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合化抗ヤギＩｇＧ（Ｓ
ｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて検出した。約５０ｋＤａのタンパ
ク質を、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，Ｉ
Ｌ）によって可視化した。各レーンに充填するタンパク質は、ほぼ同じであった
。墨で染色したブロットの一部分を、各レーンにおける均等な充填を実証するた
めに下に示した。チオレドキシンの発現が、生理食塩水で処理したマウスから得
たコントロール腫瘍組織と比較して、チオレドキシンを標的とするアンチセンス
オリゴヌクレオチドを用いて処理したマウスから得た腫瘍組織において減少する
ことは、図６Ｃから明らかである。

【０１３１】（実施例６ヒト腫瘍細胞株におけるチオレドキシンレダクターゼの過剰発現
）異なる細胞株由来の細胞懸濁液のアリコートを、組織培養ペトリ皿に添加し、
そしてサブコンフルエンシー（７０〜８０％）まで増殖した。チオレドキシンレ
ダクターゼｍＲＮＡのレベルを、ノーザンブロット分析によって決定した。

【０１３２】ノーザンブロット分析を、わずかな改変を加えて以前に記載されたように行っ
た（ＨｕｒｔａおよびＷｒｉｇｈｔ²⁷）。手短に言えば、細胞の総ＲＮＡをＴＲ
Ｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇＭＤ）を用い
て、指示された時間に細胞から調製した。ＲＮＡ（１０〜２０μｇ）を、１．５
％ホルムアルデヒドゲルで分画し、そしてナイロンメンブランに転写した。この
ブロットを、正方向プライマー［配列番号７３］（５’−ＴＴＧＧＣＴＴＡ
ＧＡＡＡＣＣＧＴＡＧＧＧ−３’）、逆方向プライマー［配列番号７４
］（５’−ＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＡＣＴＡ−３’）、
ならびに鋳型としてヒト肝臓５’−ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）およびｃＤＮ
Ａライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を用いて合成
した³²Ｐ標識化３３０ｂｐＰＣＲフラグメントとハイブリダイズさせた。ヒト
チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡを、３８２６ヌクレオチド転写物（Ｇａｓ
ｄａｓｋａら³²）として発現させ、そしてオートラジオグラフィーまたはホスホ
ルイメージャー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ
ＣＡ）を用いて可視化および定量化した。

【０１３３】グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを
ＲＮＡ充填コントロールに対して同時にプローブ化した。再び、ＰＣＲを用い、
上記と同じｃＤＮＡライブラリー由来の正方向プライマー［配列番号７１］（５
’−ＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴ−３’）、および
逆方向プライマー［配列番号７２］（５’−ＧＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣ
ＣＣＡＧＣＧＴＣ−３’）を使用して３０８ｂｐＧＡＰＤＨＤＮＡプロ
ーブを生成した。

【０１３４】図７に明らかに示されるように、９個の異なる腫瘍細胞株の全てにおけるチオ
レドキシンレダクターゼｍＲＮＡは、正常な細胞株と比較して有意により高いレ
ベルの発現を示した。

【０１３５】（実施例７．チオレドキシンレダクターゼに相補的なアンチセンスオリゴヌク
レオチドによる癌細胞株の増殖の阻害）４０個の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した癌細胞株のコロニ
ーを形成する能力を、以前に記載された方法（Ｃｈｏｙら²⁹）を用いて評価した
。詳細には、腫瘍細胞懸濁液のアリコートを、約１×１０⁴の密度で組織培養ディッシュに添加し、そして１０％ＦＢＳを補充したα−ＭＥＭ培地に３７℃で一
晩インキュベートした。細胞を、５ｍｌのＰＢＳで一回洗浄し、そしてカチオン
性脂質（リポフェクチン試薬、最終濃度、５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，
ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇＭＤ）の存在下で０．２μＭの指示されたアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドで４時間処理した。このアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを、ＰＢＳで一回、細胞を洗浄することによって取り除き、そしてこの細胞を
増殖培地（１０％ＦＢＳを補充したα−ＭＥＭ培地）で３７℃で７〜１０日間培
養した。コロニーをメチレンブルーで染色し、そして記載されたように（Ｃｈｏ
ｙら²⁹、ならびにＨｕａｎｇおよびＷｒｉｇｈｔ³¹）直接計数することによって
記録した。阻害の割合を、アンチセンスオリゴヌクレオチドの非存在下で増殖し
た培養物中に存在するコロニーの数と比較することによって計算した。全ての実
験を４重に行った。

【０１３６】アンチセンスオリゴヌクレオチドの大多数は、ヒト腫瘍細胞株のコロニーを形
成する能力に対して中程度の阻害効果を発揮した。各アンチセンスオリゴヌクレ
オチドの阻害の割合を、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１について図８Ａに
；ヒト黒色腫細胞株Ａ２０５８について図８Ｂに；ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２
について図８Ｃに；およびヒト膵臓癌細胞株ＳＵ．８６．８６について図８Ｄに
示す。

【０１３７】（実施例８チオレドキシンレダクターゼに相補的なアンチセンスオリゴヌク
レオチドオで処理した後のｍＲＮＡレベルの低下）ヒト結腸癌細胞（ＨＴ−２９）または乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を、
サブコンフルエンシー（７０〜８０％）まで増殖させ、そしてカチオン性脂質（
リポフェクチン試薬、最終濃度、５μｇ／ｍｌ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）およびＯ
ｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の存在下でチオレドキシンレダクターゼ
に相補的な０．２μＭのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドで
４時間処理した。細胞をＰＢＳで一回洗浄し、そして１０％ＦＢＳを含むα−Ｍ
ＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で１６時間インキュベートした。総ＲＮＡを
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で調製し、そしてノーザンブロット分
析を初めの方に記載したように行った。ヒトチオレドキシンレダクターゼｍＲＮ
Ａレベルを、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して定量化および標準化し、そし
て非処理化細胞から得られたチオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡレベルの割合
として図示した。図９Ａおよび図９Ｂは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、
チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡレベルをコントロール細胞レベルの５０％
未満に低下させたことを示す。

【０１３８】（実施例９アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後の細胞におけるチオ
レドキシンレダクターゼタンパク質発現の減少）ＡｓＰＣ−１ヒト膵臓癌細胞を、サブコンフルエンシー（７０〜８０％）まで
増殖させ、そしてカチオン性脂質（リポフェクチン試薬、最終濃度、５μｇ／ｍ
ｌ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の存
在下で０．２μＭのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド３０１
４［配列番号４０］および３０３７［配列番号６３］で４時間処理した。細胞を
ＰＢＳで一回洗浄し、そして１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−
ＢＲＬ）中で２０時間インキュベートした。次いで、全ての細胞タンパク質抽出
物を２×サンプル充填緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０
．２ＭＤＴＴ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、および０．０１５％ブロモ
フェノールブルー）中に調製する前に、この処置およびインキュベーションを、
もう一度繰り返し、そしてウェスタンブロット分析を、いくつかの改変を加えて
以前に記載されたように行った（Ｃｈｏｙら²⁹およびＦａｎら³⁰）。チオレドキ
シンレダクターゼの発現を、抗チオレドキシンレダクターゼ抗体（０．２〜１μ
ｇ／ｍｌ）（ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉ
ｌｅＡＬ）に続いて１：８，０００の希釈度の西洋ワサビペルオキシダーゼ結
合化抗ヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて検出した。
約５０ｋＤａのタンパク質を、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ
Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）によって可視化した。図１０を参照のこと。

【０１３９】（実施例１０アンチセンスオリゴヌクレオチド処理によるマウスにおける腫
瘍細胞増殖の阻害）ＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞（代表的には１００μｌのＰＢＳ中３×１０⁶個の細胞）を６〜７週齢のＣＤ−１無胸腺雌性ヌードマウスの右側腹部に皮下注射し
た。腫瘍の大きさが約１００ｍｍ³の体積に達した後（代表的には腫瘍細胞注射後５日）、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、隔日で１０ｍｇ／ｋｇ、
尾静脈中にボーラス注入によって投与した。コントロール動物に、生理食塩水の
みを同一期間投与した。処置は、代表的には、その後１０日続けた。

【０１４０】図１１Ａは、チオレドキシンレダクターゼに相補的なアンチセンスオリゴヌク
レオチドのＣＤ−１ヌードマウスにおけるＨＴ−２９腫瘍増殖への効果を示す。
抗腫瘍活性を、腫瘍体積の阻害によって評価した。腫瘍体積を、平均２日間隔で
９日間にわたって、キャリパ−で計測した。図における各点は、１実験群当たり
５匹の動物から算出した腫瘍体積の平均を表す。処置の終わりに（通常、最後の
処置後２４時間）この動物を屠殺し、そして腫瘍重量を計測した。図１１Ｂは、
この腫瘍の重量の平均を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍増殖に
対して有意な阻害効果を示した。生理食塩水コントロールと比較した場合、図１
１Ａに示される各アンチセンスオリゴヌクレオチドは、０．０００１以下のｐ値
で腫瘍の増殖を阻止した。腫瘍の重量を比較した場合、それぞれのアンチセンス
オリゴヌクレオチドはまた、生理食塩水コントロールと比較した場合、０．０１
４１以下のｐ値で統計学的に有意な阻害を示した（図１１Ｂ）。

【０１４１】（実施例１１．アンチセンスオリゴヌクレオチドで静脈注射処置することによ
る、マウスにおけるヒト腫瘍のチオレドキシンレダクターゼタンパク質レベルの
低下）ＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞（代表的には１００μｌのＰＢＳ中３×１０⁶個の細胞）を６〜７週齢のＣＤ−１無胸腺雌性ヌードマウスの右側腹部に皮下注射し
た。腫瘍の大きさが約１００ｍｍ³の体積に達した後（代表的には腫瘍細胞注射後５日）、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、隔日で１０ｍｇ／ｋｇ、
尾静脈中にボーラス注入によって投与した。コントロール動物に、生理食塩水の
みを同一期間投与した。マウスを、８回の注射後に屠殺し、そして切除した同様
の大きさの腫瘍フラグメントを、ＲＩＰＡ抽出緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキ
シコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．０２％ＮａＮ₃、１ｍＭＰＭＳＦおよび１０μＭロイペプチン）に直ちに収集し、そしてタンパク質調製のた
めに迅速にホモジナイズした。アンチセンスオリゴヌクレオチドのチオレドキシ
ンレダクターゼタンパク質レベルへの効果を測定するために、ウェスタンブロッ
ト分析を、いくつかの改変を加えて以前に記載されたように行った（Ｃｈｏｙら ²⁹ およびＦａｎら³⁰）。このタンパク質抽出物（１０〜２０μｇ）を、１２％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分画し、ニトロセルロースメンブランに転写し、そして墨
（Ｉｎｄｉａｉｎｋ）染色によって可視化した。チオレドキシンレダクターゼ
の発現を、抗チオレドキシンレダクターゼ抗体（０．２〜１μｇ／ｍｌ）（Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＨｕｎｔｓｖｉｌｌｅＡＬ）に
続いて１：８，０００の希釈度の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合化抗ヤギＩｇ
Ｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて検出した。約５０ｋＤａの
タンパク質を、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔ
ｓ，ＩＬ）によって可視化した。各レーンに充填するタンパク質は、ほぼ同じで
あった。図１２を参照のこと。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは、種々の細胞株におけるチオレドキシンｍＲＮＡのノーザンブロット
のオートラジオグラフである：ヒト正常胚性肺細胞株（ＷＩ−３８）、繊維肉腫
（ＨＴ−１０８０）、肺癌腫（Ａ５４９）、卵巣腺癌（ＳＫ−ＯＶ−３）、肝細
胞癌腫（ＨｅｐＧ２）、黒色腫（Ｃ８１６１）、乳房腺腫（ＭＤＡ−ＭＢ−２
３１）、転移性膵腺癌（ＡｓＰＣ−１）結腸腺癌（ＨＴ−２９）、頸部癌腫（Ｈ
ｅＬａＳ３）。図１Ｂは、種々の細胞株において発現されるチオレドキシンタンパク質のウエ
スタンブロットの写真である。より低いパネルは、各レーンに充填された総タン
パク質を示す。

【図２】図２は、チオレドキシンのｃＤＮＡ配列（配列番号６７および６８）である。
２６の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドがアニールするハイブリダイゼー
ション部位を示す。

【図３Ａ】図３Ａは、チオレドキシンｃＤＮＡに相補的な２６の異なるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いて処理した後の、種々のヒト癌細胞株のコロニー形成能力
の阻害パーセントを示す図である。試験された細胞株は、ヒト結腸癌ＴＨ−２９
である（図３Ａ）。

【図３Ｂ】図３Ｂは、チオレドキシンｃＤＮＡに相補的な２６の異なるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いて処理した後の、種々のヒト癌細胞株のコロニー形成能力
の阻害パーセントを示す図である。試験された細胞株は、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ
−ＭＢ−２３１である（図３Ｂ）。

【図３Ｃ】図３Ｃは、チオレドキシンｃＤＮＡに相補的な２６の異なるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いて処理した後の、種々のヒト癌細胞株のコロニー形成能力
の阻害パーセントを示す図である。試験された細胞株は、ヒト肝癌細胞株Ｈｅｐ
Ｇ２である（図３Ｃ）。

【図３Ｄ】図３Ｄは、チオレドキシンｃＤＮＡに相補的な２６の異なるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いて処理した後の、種々のヒト癌細胞株のコロニー形成能力
の阻害パーセントを示す図である。試験された細胞株は、ヒト黒色腫細胞株Ａ２
０５８である（図３Ｄ）。

【図３Ｅ】図３Ｅは、チオレドキシンｃＤＮＡに相補的な２６の異なるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いて処理した後の、種々のヒト癌細胞株のコロニー形成能力
の阻害パーセントを示す図である。試験された細胞株は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫ
−ＯＶ−３である（図３Ｅ）。

【図３Ｆ】図３Ｆは、チオレドキシンｃＤＮＡに相補的な２６の異なるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いて処理した後の、種々のヒト癌細胞株のコロニー形成能力
の阻害パーセントを示す図である。試験された細胞株は、ヒト肺癌細胞株Ａ５４
９である（図３Ｆ）。

【図４】図４Ａは、チオレドキシンｍＲＮＡに相補的な６つのアンチセンスオリゴヌク
レオチドを用いて処理した後の、ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２におけるチオレド
キシンｍＲＮＡレベルの減少を、未処理細胞株におけるｍＲＮＡレベルのパーセ
ンテージとして示す図である。図４Ｂは、チオレドキシンｍＲＮＡに相補的な６つのアンチセンスオリゴヌク
レオチドを用いて処理した後の、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における
チオレドキシンｍＲＮＡレベルの減少を、未処理細胞株におけるｍＲＮＡレベル
のパーセンテージとして示す図である。

【図５Ａ】図５Ａは、示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理した後の、
ヒト結腸癌細胞株ＨＴ−２９において発現されたチオレドキシンタンパク質のレ
ベルを示すウエスタンブロットの写真である。

【図５Ｂ】図５Ｂは、示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理した後の、
ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において発現されたチオレドキシンタンパ
ク質のレベルを示すウエスタンブロットの写真である。

【図５Ｃ】図５Ｃは、アンチセンスオリゴヌクレオチド２６０１（配列番号１）を用いて
処理した後の、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ−２９、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２
３１、およびヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２において発現されたチオレドキシンタ
ンパク質のレベルを示すウエスタンブロットの写真である。より低いパネルは、
タンパク質充填がこのパネルにわたって一貫したことを示す。

【図６Ａ】図６Ａは、示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた一日おきのマウ
スの静脈内処理の後の、ヌードマウスにおける腫瘍のサイズの経時的な図表であ
る。

【図６Ｂ】図６Ｂは、示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた一日おきのマウ
スの静脈内処理の約１０日後、ヌードマウスから取り出した腫瘍の重量のグラフ
である。

【図６Ｃ】図６Ｃは、示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた一日おきのマウ
スの静脈内処理の約１０日後にヌードマウスから切り出したヒト結腸癌ＨＴ−２
９腫瘍におけるチオレドキシンタンパク質発現のレベルを示す、ウエスタンブロ
ットの写真である。墨（Ｉｎｄｉａｉｎｋ）で染色されたブロットの一部を、
タンパク質充填を実証するために示す。

【図７】図７は、示された腫瘍細胞株において発現されたチオレドキシンレダクターゼ
ｍＲＮＡのレベルを示すノーザンブロットのオートラジオグラフである

【図８Ａ】図８Ａは、チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡに相補的な４０の異なるアン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理した後の、種々のヒト癌細胞株のコロ
ニー形成能力の阻害パーセンテージを示すグラフである。試験された細胞株は、
ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１である（図８Ａ）。

【図８Ｂ】図８Ｂは、チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡに相補的な４０の異なるアン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理した後の、種々のヒト癌細胞株のコロ
ニー形成能力の阻害パーセンテージを示すグラフである。試験された細胞株は、
ヒト黒色腫Ａ２０５８である（図８Ｂ）。

【図８Ｃ】図８Ｃは、チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡに相補的な４０の異なるアン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理した後の、種々のヒト癌細胞株のコロ
ニー形成能力の阻害パーセンテージを示すグラフである。試験された細胞株は、
ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２である（図８Ｃ）。

【図８Ｄ】図８Ｄは、チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡに相補的な４０の異なるアン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理した後の、種々のヒト癌細胞株のコロ
ニー形成能力の阻害パーセントを示すグラフである。試験された細胞株は、ヒト
膵臓癌ＳＵ．８６．８６である（図８Ｄ）。

【図９】図９Ａは、示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理した後の、
細胞株におけるチオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡレベルの発現のレベルを、
未処理細胞株におけるｍＲＮＡレベルのパーセンテージとして示す図である。図
９Ａは、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ−２９である。図９Ｂは、示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理した後の、
細胞株におけるチオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡレベルの発現のレベルを、
未処理細胞株におけるｍＲＮＡレベルのパーセンテージとして示す図である。図
９Ｂは、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１である。

【図１０】図１０は、アンチセンスオリゴヌクレオチド３０１４および３０３７（配列番
号４０および６３）を用いて処理した後の、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ−１にお
けるチオレドキシンレダクターゼタンパク質発現のレベルを示すウエスタンブロ
ットの写真である。

【図１１Ａ】図１１Ａは、示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた一日おきのマ
ウスの静脈内処理の後の、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍のサイズの経時的な図
表である。

【図１１Ｂ】図１１Ｂは、示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた一日おきのマ
ウスの静脈内処理の約１０日後、マウスから取り出したヒト腫瘍の重量の図であ
る。

【図１２】図１２は、示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて一日おきにマウ
スの静脈内処理の約１０日後にヌードマウスから切り出したヒト結腸癌ＨＴ−２
９腫瘍におけるチオレドキシンレダクターゼタンパク質発現のレベルを示す、ウ
エスタンブロットの写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｈ 21/04 (Ａ６１Ｋ 31/711 //(Ａ６１Ｋ 31/711 45:00） 45:00） (Ａ６１Ｋ 48/00 (Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヤング，エイピングエイチ．カナダ国エム２アール１ピー３オンタリオ，ノースヨーク，センラックロード 201 (72)発明者リー，ヨーンエス．カナダ国エル５エイ２エル７オンタリオ，ミシサウガ，コルサーロード 2219 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 CA12 EA02 GA13 GA14 HA12 4C057 BB02 DD01 MM02 4C084 AA02 AA06 AA17 BA35 NA14 ZB262 ZC202 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】約１７〜約５０ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌク
レオチドであって、ここで該オリゴヌクレオチドが表１に示されるような配列２
６０１〜２６２６（配列番号１〜２６）からなる群から選択される配列を含む、
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに
含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】チオレドキシンｍＲＮＡに相補的でないさらなるヌクレオチ
ドをさらに含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】前記オリゴヌクレオチドが表２に示されるような配列３００
１〜３０４０（配列番号２７〜６６）からなる群から選択される配列を含む、約
１７〜約５０ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに
含む、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡに相補的でないさらな
るヌクレオチドをさらに含む、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド。
【請求項７】ヌクレオチドが、哺乳動物の前記チオレドキシンｍＲＮＡま
たは前記チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡに相補的である、約３〜５０ヌク
レオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項８】薬学的組成物であって、薬学的に受容可能な賦形剤および約
３〜５０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む有効量のアンチセン
スオリゴヌクレオチドを含み、ヌクレオチドが哺乳動物の前記チオレドキシンｍ
ＲＮＡまたは前記チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡに相補的である、薬学的
組成物。
【請求項９】請求項８に記載の薬学的組成物であって、ここで前記アンチ
センスオリゴヌクレオチドが約１７〜約５０ヌクレオチドを含み、そして表１に
示されるような配列２６０１〜２６２６（配列番号１〜２６）からなる群から選
択される配列を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】請求項８に記載の薬学的組成物であって、ここで前記アン
チセンスオリゴヌクレオチドが約１７〜約５０ヌクレオチドを含み、そして表２
に示されるような配列３００１〜３０４０（配列番号２７〜６６）からなる群か
ら選択される配列を含む、薬学的組成物。
【請求項１１】哺乳動物の腫瘍の増殖を阻害するための方法であって、腫
瘍を有していることが疑われる哺乳動物に、哺乳動物の前記チオレドキシンｍＲ
ＮＡに相補的である約３〜約５０ヌクレオチドを含む有効量のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを、腫瘍の増殖が阻害されるような条件下で投与する工程を含む
、方法。
【請求項１２】哺乳動物に化学療法剤を投与する工程をさらに含む、請求
項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記オリゴヌクレオチドが表１に示されるような配列２６
０１〜２６２６（配列番号１〜２６）からなる群から選択される配列を含む、請
求項１１に記載の方法。
【請求項１４】前記オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ抵抗性である、請
求項１１に記載の方法。
【請求項１５】哺乳動物の腫瘍の増殖を阻害するための方法であって、腫
瘍を有していることが疑われる哺乳動物に、哺乳動物のチオレドキシンレダクタ
ーゼ遺伝子に相補的である少なくとも約３〜約５０ヌクレオチドを含む有効量の
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、腫瘍の増殖が阻害されるような条件下で投
与する工程を含む、方法。
【請求項１６】前記哺乳動物に化学療法剤を投与する工程をさらに含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ抵抗性である、請
求項１５に記載の方法。
【請求項１８】前記オリゴヌクレオチドが表２に示されるような配列３０
０１〜３０４０（配列番号２７〜６６）からなる群から選択される配列を含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】哺乳動物の腫瘍の転移を阻害するための方法であって、転
移性腫瘍を有していることが疑われる哺乳動物に、哺乳動物のチオレドキシン遺
伝子に相補的である約３ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドを含む有効量のアン
チセンスオリゴヌクレオチドを、腫瘍の転移が阻害されるような条件下で投与す
る工程を含む、方法。
【請求項２０】前記哺乳動物に化学療法剤を投与する工程をさらに含む、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】哺乳動物の腫瘍の転移を阻害するための方法であって、転
移性の腫瘍を有していることが疑われる哺乳動物に、哺乳動物のチオレドキシン
レダクターゼ遺伝子に相補的である約３ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドを含
む有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、腫瘍の転移が阻害されるような
条件下で投与する工程を含む、方法。
【請求項２２】前記哺乳動物に化学療法剤を投与する工程をさらに含む、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】腫瘍細胞の増殖を阻害するための、約３〜約５０ヌクレオ
チドを含むオリゴヌクレオチドの使用であって、ヌクレオチドが、哺乳動物の前
記チオレドキシンｍＲＮＡまたは前記チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡと相
補的である、使用。
【請求項２４】転移を阻害するための、約３〜約５０ヌクレオチドを含む
オリゴヌクレオチドの使用であって、ヌクレオチドが、哺乳動物の前記チオレド
キシンｍＲＮＡまたは前記チオレドキシンレダクターゼｍＲＮＡと相補的である
、使用。
【請求項２５】腫瘍細胞の増殖を阻害するために医薬を調製するための、
約３〜約５０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの使用であって、ヌクレオ
チドが、哺乳動物の前記チオレドキシンｍＲＮＡまたは前記チオレドキシンレダ
クターゼｍＲＮＡと相補的である、使用。
【請求項２６】転移を阻害するために医薬を調製するための、約３〜約５
０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの使用であって、ヌクレオチドが、哺
乳動物の前記チオレドキシンｍＲＮＡまたは前記チオレドキシンレダクターゼｍ
ＲＮＡと相補的である、使用。