CN105671012A - 一种雨生红球藻硒蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

一种雨生红球藻硒蛋白及其编码基因与应用,本发明涉及一种生物工程领域，为提供有机硒，本发明提供一种硒蛋白，所述的硒蛋白含有氨基酸残基序列如序列表中SEQ？ID？No:2所示或是将SEQ？ID？No：2的氨基酸残基序列的一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加，且与上述蛋白具有相同活性的经SEQ？ID？No：2衍生的氨基酸残基序列。本发明的有益效果在于，提供一种安全性更高的有机硒蛋白，以及编码基因。

Description

一种雨生红球藻硒蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种生物工程领域，特别是一种雨生红球藻硒蛋白及其编码蛋白与应用。
背景技术
硒是一种人体必需的微量营养元素，参与许多重要的细胞活动，硒元素被认为与动物发育、免疫功能、抑制病毒等有密切关系，缺硒将导致一系列重要的生理过程失调，引起心脏病、神经肌肉失调、癌症与炎症以及不育。中国大陆大部分地区是低硒带，如果人体硒含量长期低于0.1mg/kg,就会导致肝坏死、冠心病、心肌损坏、扩张性心肌炎、大骨关节病、克山病、溶血性贫血、肝癌、胃癌、结肠癌及胰腺癌等疾病。相对于过量的无机硒对生物体具有一定毒性，在我国补硒提倡采用安全性更高的有机硒强化剂。
在有机硒中，硒蛋白是具有活性的氨基酸，其具有一个以上硒代半胱氨酸(Sec)。硒元素掺入半胱氨酸后，成为活性中心。在蛋白质转录翻译中，UGA通常作为终止密码子，而在硒蛋白中，由于有SBP2、SECIS、EFSec等结构的存在，使得Sec-tRNA能将UGA密码子编码成Sec从而翻译成硒蛋白。
在漫长的进化历史中，植物、真菌和部分昆虫中丢失了硒蛋白，而低等藻类、动物保留了硒蛋白组，表明硒蛋白具有的重要生理功能，在强大的选择压力下仍然保留下来。L.Adam等2014研究表明，Sec突变成无硒的半胱氨酸之后，硒蛋白TR1的催化活性大幅降低。而且在硒蛋白中，硫氧还蛋白还原酶(TR)是一种关键硒酶，作为位于细胞核或者细胞质的胞浆酶，对维护免疫细胞氧化还原尤为重要。TR与硫氧还蛋白形成正常细胞中主要的二硫化物还原体系，调节活性氧水平，调整细胞氧化还原功能，与细胞的生长、信号转导及表型有着密切的联系。
发明内容
首先，本发明提供一种雨生红球藻硒蛋白，雨生红球藻硒蛋白－硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxinreductase,HpTR1)，来源自雨生红球藻SAG192.80，所述的雨生红球藻硒蛋白具有的氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNo:2所示，或是将SEQIDNo：2的氨基酸残基序列的一个或几个(不超过10个)氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加，且与上述蛋白具有相同活性的经SEQIDNo：2衍生的氨基酸残基序列。
其次，本发明提供雨生红球藻硒蛋白的编码基因，其cDNA基因选自下述核苷酸序列之一或几种：
(1)序列表中SEQIDNo：1的DNA序列；
(2)编码序列表中SEQIDNo：2蛋白质序列的核苷酸片段；
(3)在高严谨条件下能与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列,即在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下进行杂交，避免错配可能性；
(4)同序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
进一步的，所述基因序列的开放阅读框是SEQIDNo：3自5’端第25位至1632位碱基。
含有上述的硒蛋白编码基因序列的表达载体、转基因细胞系或宿主菌属于本专利的保护范围。
再次，本发明提供一种提高雨生红球藻硒蛋白含量的方法，所述方法是将硒蛋白编码基因转入植物中，所述的硒蛋白编码基因来自下列核苷酸之一或几种：
(1)序列表中SEQIDNo：1的DNA序列，或
(2)编码序列表中SEQIDNo：2蛋白质序列的核苷酸片段，或
(3)在高严谨条件下能与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，或
(4)同序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
最后，本发明中硒蛋白编码基因在提高植物硒蛋白含量上的应用也属于本发明保护的范畴，如转入雨生红球藻。
本发明的有益效果在于，提供一种安全性更高的有机硒蛋白，以及编码基因。
附图说明
图1是雨生红球藻TR1硒蛋白基因全长序列及保守的SECIS结构。
图2是氨基酸序列与其它物种TR1氨基酸序列的多重比对结果。
图3是雨生红球藻mRNA水平表达差异。
图4是雨生红球藻经13mg/L亚硒酸钠处理组与对照组的TR1硒酶活性差异。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1雨生红球藻硫氧还蛋白还原酶基因的获得
将雨生红球藻在ESP培养基中静止培养，培养基的组成如下：NaNO30.2g/L，K2HPO40.02g/L，MgSO4﹒7H2O0.02g/L，土壤提取液30mL/L，EDTA0.004g/L,FeSO4﹒7H2O0.0035g/L，ZnSO4﹒7H2O5×10-6g/L，MnSO4﹒4H2O1×10-5g/L，H3BO35×10-5g/L，CuSO4﹒5H2O2.5×10-8g/L，Co(NO3)2﹒6H2O5×10-6g/L，蛋白胨1g/L，pH调至7-8.5范围内。培养温度为22±0.5℃，光强20μmolm-2s-1，培养15天。
其中，土壤提取液配置方法如下：在三角瓶中加入1/3体积天然腐殖土，应避免含有化肥及农药，也应避免含有过量黏土，加入去离子水至超过土壤表面5厘米，24小时间隔内高压蒸汽灭菌1小时两次，高速离心分离沉积物，轻轻倒出上清液至保存容器，121℃高压灭菌20分钟后保存于冰箱。
硫氧还蛋白还原酶TR1基因克隆与富集验证：
利用PCRcDNASynthesisKit试剂盒(Clontech，美国)采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从雨生红球藻中扩增其硫氧还蛋白还原酶TR1cDNA，所用引物如表1所示，经5’－RACE和3’－RACE扩增之后组装完成全长的雨生红球藻TR1全长cDNA(如SEQIDNo：3所示)，其结构如图1所示，其中，图1-A为DNA序列及对应的氨基酸序列，＊号标注的是硒代半胱氨酸密码子位点。开放阅读框内高亮区域为NADP绑定蛋白、吡啶核苷酸二硫醚氧化还原酶及二聚体化功能域等基序。3’－UTR区粗体显示的是SECIS元件。图1-B为SECIS元件的二级结构，具有标志性的顶环和AG/GA四重奏等保守结构。
表1雨生红球藻TR1cDNA克隆、测序及实时荧光定量PCR所用引物序列。
通过序列比对发现，红球藻TR1基因雨生红球藻与人类TR1基因的一致性达到69％，具有显著的硒蛋白基因结构，如图2所示，根据雨生红球藻TR1基因开放阅读框推断的硒蛋白氨基酸序列与其它物种TR1氨基酸序列的多重比对结果，包括人(NP_877393)、鼠(NP001035988)、鸡(NP_001025933)、斑马鱼(NP_001025933)、莱茵衣藻(XP_001696072)、球石藻(BAH20464)、团藻(XP002948633)、褐潮藻(XP_009037)、线虫(AAD41826)。黑色阴影标示完全一致序列，灰色阴影标示保守替代序列,高度保守的GGTCVNVGCIP和GCUG由框标注，其中硒代半胱氨酸由＊号标注。其编码区倒数第二位与其它物种TR1硒蛋白基因一致，是由TGA编码硒代半胱氨酸(U)的位点，且核心功能区具有完全保守的GGTCVNVGCIP与GCUG序列。
实施例2HpTR1基因表达的荧光定量分析
根据雨生红球藻TR1基因序列设计qRT－PCR引物(表1)，利用荧光定量PCR技术，对处理组与对照组的样品进行分析，mRNA水平表达差异结果如图3所示：对处于指数生长期的藻细胞(密度约为每毫升3×105个细胞)用13mg/L亚硒酸钠处理，其结果显示：TR1的转录水平在第6小时达到最高峰，达到初始表达水平的两倍以上。而未加硒的对照组的TR1转录水平无显著差异。
实施例3HpTR1基因的酶活性检测
为进一步确认硒蛋白富集效果，利用硫氧还蛋白还原酶活性检测试剂盒K763(Biovision，美国)对蛋白活性进行分析。该试剂盒检测原理是通过DTNB还原法分别对含有TR特异性抑制剂与不含抑制剂的对照组进行两次检测，其差值即为TR在NADPH存在的情况下催化的DTNB的还原量，计算催化产生的TNB在412nm的比色值可以得到TR活性。雨生红球藻经13mg/L亚硒酸钠处理的结果如图4所示：在加硒处理组中，第三小时TR活性有显著上升，到第六小时达到峰值，接近初始值的2倍，而第十二小时后衰减到1.5倍，之后TR活性与初始值无显著差异。相比加硒实验组，对照组各时间段TR活性并无显著差异。
序列表

Claims (6)

1.一种雨生红球藻硒蛋白，其特征在于，氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNo:2所示或是将SEQIDNo：2的氨基酸残基序列的一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加，且与上述蛋白具有相同活性的经SEQIDNo：2衍生的氨基酸残基序列。
2.如权利要求1所述的一种雨生红球藻硒蛋白，其特征在于，差异的氨基酸序列残基不超过10个。
3.权利要求1所述的雨生红球藻硒蛋白的编码基因，其特征在于，来自下列核苷酸：
(1)序列表中SEQIDNo：1的DNA序列，或
(2)编码序列表中SEQIDNo：2蛋白质序列的核苷酸片段，或
(3)在高严谨条件下能与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，或
(4)同序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.含有权利要求3所述的硒蛋白编码基因序列的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
5.一种提高雨生红球藻硒蛋白含量的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求3的硒蛋白编码基因转入植物中。
6.如权利要求3所述的硒蛋白编码基因在提高植物硒蛋白含量上的应用。
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