CN103509806B - 茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于茶树基因工程领域，具体涉及一种茶树叶片多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP及其编码蛋白，同时还涉及利用诱导调节多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP表达强度在茶树病害防御中的应用。具体而言，本发明公开了一种茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP，为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。该基因CamPGIP编码的蛋白质为SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。该基因CamPGIP用于构建转基因植物，使所示转基因植物的抗病性（主要指炭疽病或云纹叶枯病）得以提高。

Description

茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP及其应用

技术领域

本发明属于茶树基因工程领域，具体涉及一种茶树叶片多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP及其编码蛋白，同时还涉及利用诱导调节多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP表达强度在茶树病害防御中的应用。

背景技术

茶树叶部病害严重影响光合作用并造成茶叶减产及品质下降。真菌是茶树叶部病害的主要病原体。真菌病害从病菌侵入直至出现病害症状依次经过侵入期、潜育期和发病期，病菌接触茶树叶片到两者建立起营养或寄生关系阶段为侵入期；寄生关系建立到明显病害症状出现的过程为潜育期；发病期是指染病茶树叶片在外部形态上反映出病理变化和病菌产生繁殖体阶段。侵入期阶段病原菌和茶树叶片的互作决定了病菌能否侵染茶树。

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase inhibiting protein，PGIP）是一种富含亮氨酸重复单元的细胞壁结合蛋白，异构体形式多样，等电点因异构体形式的不同而差异较大，具有典型的富亮氨酸重复序列（LRR）特征，是高等植物LRR的蛋白家族成员之一。研究发现，PGIP作为一种防卫物质，参与植物的抗病反应，可有效放止灰酶、曲霉、青霉等多种植物病原菌。真菌在侵入期与植物互作时释放内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-polygalacturonase）降解细胞壁中的多聚半乳糖醛酸及其部分甲酯化衍生物，导致细胞液外渗并为真菌生长和发育提供糖原，从而诱发植物发病，PGIP可非竞争性地抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶的活性，增强植物抗病性。

植物的防卫反应主要受到生物和非生物两种激发子诱导，非生物激发子主要有机械损伤、水杨酸、低温、茉莉酸等。其中水杨酸（Salicylic acid，SA）已被普遍认为是诱导植物系统产生抗逆防卫的信号分子之一，是植物体内普遍存在的一种天然活性物质，与植物多种生理调节过程有关，并诱导植物体内抗性酶活性的增加、加速木质素合成、限制病原菌的侵入和扩展，从而增强植物抗性。研究表明，水杨酸处理桃、苹果、马铃薯和菜豆，可诱导抗逆相关蛋白和酶的积累，增强植物抵抗黑星病、疫霉病等病原真菌。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种茶树叶片多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP及其编码蛋白，通过诱导该基因表达可提高茶树抗病性。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP，为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

本发明还同时提供了上述茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP编码的蛋白质，为SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。

本发明还同时提供了上述茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP的用途，用于构建转基因植物，使所述转基因植物的抗病性得以提高。所述病为炭疽病或云纹叶枯病。所述植物例如为烟草。

本发明还涉及利用诱导调节多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP表达强度。

本发明所述基因是应用消减杂交技术从茶树炭疽病叶与正常叶中分离的差异基因片段，然后采用3’RACE和5’RACE技术获得CamPGIP全长基因。该基因序列全长1225bp，包含一个长993bp的开放阅读框（ORF），具体位置为自5’端第31位至1023位碱基（如SEQ ID No：1中划线部分所示，1021位至1023位碱基为终止密码子，不编码氨基酸），编码序列SEQ IDNo:2的蛋白质。SEQ ID No：1所示的核苷酸序列经与美国生物信息数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比对证实，该序列与猕猴桃（登录号为Z49063.1）、越橘（登录号FJ347133.1）和葡萄（登录号为AF499451.1）等相应基因具有70%-80%的同源性，其中与猕猴桃（登录号为Z49063.1）有81%的最高同源性。研究显示，从猕猴桃中分离的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因转化苹果，转基因苹果与转化前对照无显著表型差异，但该基因受机械损伤和UV辐射诱导而表达增强；资料还证实，葡萄中多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因（VvPGIP1）可降低葡萄孢霉侵染率；此外，数据库检索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）表明，尚未有茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因及其编码蛋白记录。证明本发明序列是一种新的茶树CamPGIP基因。

本发明还提供了上述基因CamPGIP开放阅读框（如SEQ ID No：1中划线部分所示）编码的蛋白质，其具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。分析显示，该蛋白为脂溶性蛋白，脂溶指数达99.85，属于LRR蛋白家族成员之一。该蛋白序列中含有330个氨基酸，分子量约为36.26kD，等电点为6.88，其中强碱性氨基酸（Lys,Arg）占7.2%、强酸性氨基酸（Asp,Glu）占7.2%、疏水性氨基酸（Ala,Ile,Leu,Phe,Trp,Val）37%、极性氨基酸（Asn,Cys,Gln,Ser,Thr,Tyr）32.7%、其他氨基酸（Met,Gly,His,Pro）15.8%，蛋白结构中含有25.15%α螺旋，17.58%β折叠及57.27%的其他结构，包含底物结合区、富含亮氨酸重复序列区。经与美国生物信息数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比对证实，SEQ ID No：2所示的氨基酸序列与猕猴桃、越橘和葡萄等多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白具有70-80%的同源性；此外已公开的数据和文献中未检索到有关茶树中多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白序列。因此证明本发明序列是一种新的茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白序列。

本发明提供CamPGIP基因表达强度与病害关联分析。依据上述获得的茶树CamPGIP基因序列涉及特异性引物（序列如SEQ ID No：15和SEQ ID No：16所示，设计产物为229bp），同时以茶树肌动蛋白（Actin，ACT）基因（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923）为参比基因设计引物（序列如SEQ ID No：17和SEQ ID No：18，设计产物为419bp）。茶树种质资源圃中采集不同品种茶树病害发生叶，同时采集同品种同等成熟度的健康叶片为对照，分别提取总RNA并合成cDNA第一链，进行RT-PCR后经琼脂糖凝胶电泳分析CamPGIP基因表达强度（图2），结果显示不同品种不同病害中CamPGIP基因表达强度均显著高于同品种的健康叶片。说明CamPGIP基因表达上调是茶树对于病菌入侵的一种普遍应激响应之一，两者之间存在密切因果关联关系。

本发明进而探讨了外源水杨酸刺激与茶树叶片CamPGIP基因表达积累的关联关系。以不同浓度外源水杨酸处理茶树叶片，对叶片进行感病处理模拟病菌侵染损伤，采用RT-PCR技术分析外源水杨酸对CamPGIP基因表达的影响。结果显示（图3），外源水杨酸处理茶树叶片后，CamPGIP基因表达强度随水杨酸浓度的升高而显著增强；后期病害调查显示，经外源水杨酸处理后CamPGIP基因高表达的茶树叶片病害发生程度显著下降。说明外源诱导CamPGIP基因高表达可提高茶树抗病性。

本发明还提供一种利用该基因提高植物抗病性的验证及应用方法。该方法涉及含有所述基因的重组载体以及由所述重组载体转化得到的转基因植物。增强植物抗病性验证采用转基因烟草进行鉴定。具体做法包括pRI-201-AN-DNA-CamPGIP双元表达载体构建、农杆菌介导转化及烟草再生苗获得、转茶树CamPGIP基因烟草鉴定、感病处理阳性植株及野生型对照的病斑比较及CamPGIP基因表达分析（图5）。结果显示转茶树CamPGIP基因烟草叶片中CamPGIP基因表达强度显著高于野生对照，同时病斑则显著小于野生对照。由此可见，茶树CamPGIP基因表达上调是茶树对病菌入侵的一种重要防御性反应之一，提高CamPGIP基因表达水平可提高茶树对病菌的抵御能力。

本发明的要点在于提供了SEQ ID No：1所示的核苷酸序列和SEQ ID No：2所示的氨基酸序列及其在提高植物抗病性上的应用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是不同茶树品种健康叶片及患病叶片对比图；

图中A为“龙井43”茶树品种的健康叶片（左）与“炭疽病”叶片（右）对比图；B为“水古”茶树品种的健康叶片（左）与“炭疽病”叶片（右）对比图；C为“鸠坑”茶树品种的健康叶片（左）与“云纹叶枯病”叶片（右）对比图；D为“浙农25”茶树品种的健康叶片（左）与“云纹叶枯病”叶片（右）对比图。在健康茶树叶片中，表面完整、无坏死斑块，而在患病叶片中，出现明显圆形、椭圆形、环形或者不规则坏死斑块。

图2是茶树病害及健康对照叶片中CamPGIP基因表达图；

图中Actin代表肌动蛋白参比基因，该基因表达亮度一致，说明各样品该cDNA模板浓度一致、可比；CamPGIP代表茶树叶片多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因；编号1为“龙井43”茶树品种炭疽病害叶片、2为“龙井43”茶树品种健康叶片、3为“水古”茶树品种炭疽病害叶片、4为“水古”茶树品种健康叶片、5为“鸠坑”茶树品种云纹叶枯病害叶片、6为“鸠坑”茶树品种健康叶片、7为“浙农25”茶树品种云纹叶枯病害叶片、8为“浙农25”茶树品种健康叶片。

图3是不同浓度水杨酸（SA）处理茶树病情指数调查及叶片CamPGIP基因表达图；

图中A表示不同浓度SA处理茶树叶片接种病菌后的病情指数调查图；

图中B表示不同浓度SA处理茶树叶片接种病菌后叶片CamPGIP基因表达图；

病情指数调查结果显示随外源SA浓度增大，病情指数显著下降，即病害程度随SA浓度增大而减小。凝胶检测图中显示各样品Actin亮度一致，说明各样品cDNA浓度一致、可比，不同浓度SA处理组CamPGIP基因表达随SA浓度增大而增强，20mmol/L时表达最强，说明外源水杨酸诱导CamPGIP基因表达增强。综上，经外源水杨酸处理后CamPGIP基因高表达的茶树叶片病害发生程度显著下降。说明外源诱导CamPGIP基因高表达可提高茶树抗病性。

图4是转茶树CamPGIP基因烟草PCR鉴定图；

图中M表示DNA分子量标记；S1、S2表示野生对照烟草植株（2个重复）的CamPGIP-PCR凝胶泳道，该泳道无条带显示表明野生对照植株基因组中未转入重组茶树CamPGIP基因；S3、S4表示转茶树CamPGIP基因烟草（2个重复）的CamPGIP-PCR凝胶泳道，电泳条带显示在900-1000bp间，与引物设计的产物大小（993bp）相符，表示该植株成功转化茶树CamPGIP重组基因，即为转茶树CamPGIP基因烟草。

图5是转茶树CamPGIP基因烟草与野生型烟草（对照）炭疽病斑比较及CamPGIP基因表达对比图；

图中左侧为转茶树CamPGIP基因烟草叶片，右侧为对照野生烟草叶片，箭头所指为炭疽病斑，显示转茶树CamPGIP基因烟草叶片病斑很小，约为对照病斑的1/4左右；两组CamPGIP基因表达以茶树肌动蛋白基因Actin作为参比，转茶树CamPGIP基因烟草叶片Actin与野生对照烟草叶片Actin表达一致，表示两者cDNA浓度一致可比。对比显示转茶树CamPGIP基因烟草叶片中CamPGIP基因表达强度是野生对照的3倍以上。由此说明转茶树CamPGIP基因烟草叶片中，在CaMV35S强启动子驱动下，大量表达外源转入的CamPGIP基因，使转基因烟草的抗炭疽病能力显著提高。

图6是转茶树、猕猴桃、越橘和葡萄多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因烟草叶片病斑对比图；

图中a是转茶树CamPGIP基因烟草叶片病斑图，图b是转猕猴桃（登录号Z49063.1）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因烟草叶片病斑图，图c是转越橘（登录号FJ347133.1）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因烟草叶片病斑图，图d是转葡萄（登录号为AF499451.1）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因烟草叶片病斑图；

从图中可知，转茶树CamPGIP基因烟草叶片病斑数较转猕猴桃、越橘和葡萄多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因烟草少1-5倍，病斑大小也较转猕猴桃、越橘和葡萄多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因烟草小1/3左右。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，以便于更好地理解，但并不限定本发明。实施例中的试验方法，如无特殊说明均为常规方法。

实施例1：茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP的分离与克隆

1）利用抑制性消减杂交（SSH）分离茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP

采集茶树种质资源圃中福鼎大白茶树品种的病菌侵染叶片与同品种同成熟度的健康叶片，分别进行液氮充分研磨后，以TRIzol法（Invitrogen Life Technologies）提取两组茶树叶片总RNA，分别取上述两组总RNA以OligotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit（宝生物[大连]有限公司）纯化mRNA，利用PCR-Slelect^TM cDNA Subtraction Kit（Clontech Laboratories，Lnc.,Mountain View,USA）进行抑制性消减杂交。分别取上述两组纯化mRNA各2μg，以SMARTScribe逆转录酶进行cDNA第一链合成，进而以20×Second-Strand酶混合物合成cDNA第二链，获得双链cDNA（ds cDNA）。各组ds cDNA经Rsa1消化后分成两管，分别与接头Adaptor1（SEQ ID No:3所示）和Adaptor2R（SEQ ID No:4所示）连接成为tester cDNA，未连接接头的为driver cDNA。两次杂交中第一次过量driver cDNA分别加入两份tester cDNA中变性后退火杂交，使原来有丰度差别的tester单链cDNA均等化，合并两份杂交产物，另加上新的变性driver cDNA再次进行杂交退火，进一步富集差异表达的杂交体分子，并用DNA酶补平末端。依据巢式PCR原理进行两轮PCR反应，第一次PCR两端连接有不同接头的双链cDNA片段得以指数扩增，第二次PCR利用巢式引物富集差异表达的基因片段，具体操作参见试剂盒使用说明。SSH-PCR产物插入pMD18-T载体（宝生物[大连]有限公司），并以M13-F/M13-R引物组合（分别如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14所示）进行PCR验证，阳性克隆委托Invitrogen公司进行测序。

将测序所得序列以Vecscreen（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html）除去载体与接头序列得到差异表达基因EST片段，经Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）序列同源性比对，获得一个与猕猴桃、越橘和葡萄等多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因同源性较高的茶树新EST序列。

2）茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP克隆

依据该EST序列，设计特异引物（SEQ ID No:5至SEQ ID No:12所示）进行全长基因克隆。取福鼎茶树品种健康新梢（1芽2叶），液氮研磨后以TRIzol法提取茶树叶片总RNA，并以OligotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit（宝生物[大连]有限公司）纯化mRNA，取1μg纯化mRNA，以TaKaRa3’RACE Core Set Ver.2.0试剂盒（宝生物[大连]有限公司）进行3’端基因序列克隆：mRNA经逆转录酶M-MLV合成第一链cDNA，以第一链cDNA为模板，以特异性引物（SEQ ID No:5所示）和3’Outer Primer（SEQ ID No:6所示）进行Outer-PCR反应，取1μl Outer-PCR产物，以特异性引物（SEQ ID No:7所示）和3’Inner Primer（SEQ IDNo:8所示）进行Inner-PCR反应，预计3’END产物长度为680bp-750bp之间，具体操作参见试剂盒使用说明。

另取1μg纯化mRNA，以TaKaRa5’-Full RACE Kit试剂盒（宝生物[大连]有限公司）进行5’端基因序列克隆：mRNA的5’端经Alkaline Phosphatase（CIAP，碱性磷酸酶）的去磷酸化作用和Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）的“去帽子”反应后，与试剂盒中提供的5’RACE接头连接成为Ligated RNA；Ligated RNA经逆转录酶M-MLV合成第一链cDNA，以第一链cDNA为模板，以特异性引物（SEQ ID No:9所示）和5’Outer Primer（SEQ ID No:10所示）进行Outer-PCR反应，取1μl Outer-PCR产物，以特异性引物（SEQ ID No:11所示）和5’InnerPrimer（SEQ ID No:12所示）进行Inner-PCR反应，预计5’END产物长度为250bp-350bp之间，具体操作参见试剂盒使用说明。

将上述RACE产物于1.8%琼脂糖凝胶上电泳，并割取目标条带，以TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver.2.0（宝生物[大连]有限公司）进行条带回收，并插入pMD18-T载体（宝生物[大连]有限公司），并以M13-F/M13-R引物组合（分别如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14所示）进行PCR验证，阳性克隆委托Invitrogen公司进行序列分析。

将测序获得的片段由SeqMan软件（DNAStar公司）根据重叠区域进行片段拼接，获得CamPGIP全长序列，该基因为1225bp，具体如SEQ ID No：1所示。经与美国生物信息数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比对证实，该序列与猕猴桃、越橘和葡萄等具有70-80%的同源性。CamPGIP基因的开放阅读框（如SEQ ID No：1中划线部分所示）位于SEQ ID No：1序列5’端第31位至1023位碱基之间，编码包含330个氨基酸的蛋白序列，具体如SEQ IDNo：2所示，该序列与猕猴桃、越橘和葡萄等具有70%-80的同源性。可见，所获得的序列为茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP基因，检索还显示，数据库和文献中均未见茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因序列。

实施例2：茶树叶片多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP基因相对表达强度与病害关联分析

1）、茶树病害及健康对照叶片中CamPGIP基因表达：

依据上述获得的茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP序列，采用采用PrimerPremier5软件（Premier Inc.）设计表达引物（序列如SEQ ID No：15和SEQ ID No：16所示），设计产物大小为229bp。同时设计参比基因茶树肌动蛋白（Actin）基因（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923）表达引物（序列如SEQ ID No：17和SEQ IDNo：18），设计产物大小为419bp。

采摘茶树种质资源圃“龙井43”和“水古”品种的“炭疽病”病害叶及同等成熟度的健康对照叶片、“鸠坑”和“浙农25”品种的“云纹叶枯病”病害叶及同等成熟度的健康对照叶片（图1）进行冻存。取各样品叶片100mg，经液氮研磨后，采用实施例1的方法，以TRIzol法提取各组茶树叶片总RNA，以TaKaRa PrimeScript II1^st Strand cDNA Synthesis Kit（宝生物[大连]有限公司）进行cDNA第一链合成，以CamPGIP表达引物SEQ ID No:15和SEQ ID No:16进行RT-PCR表达分析：RT-PCR采用全式金2×Easy Taq^TM PCR SuperMix（全式金[北京]有限公司）进行，以茶树Actin为参比基因。

15μl反应体系为：ddH₂O4.9μl；2×Easy Taq^TM PCR SuperMix7.5μl；Primer(SEQ ID No：15&SEQ ID No：16或者SEQ ID No：17&SEQ ID No：18;10mM each)0.6μl；cDNA（浓度为100ng/μl）2μl。PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45s、60℃退火30s、72℃延伸30s、30个循环；72℃后延伸10min。产物以2.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图2所示。

基因表达结果显示，不同品种不同病害茶树叶片中CamPGIP基因表达强度均显著高于同品种的健康叶片。说明CamPGIP基因表达上调是茶树对于病菌入侵的一种普遍应激响应之一，两者之间存在密切因果关联关系。

2）、外源水杨酸（SA）刺激对茶树病害罹患率及CamPGIP基因相对表达强度的影响：

SA用蒸馏水溶解，将其配制成2，5，10，15，20mmol/L的浓度，用1mmol/L的NaOH将其pH值调至6.5，各加入0.05%（v/v）Tween20并混匀备用，以pH6.5水加入0.05%的Tween20为对照。选取长势相同的龙井43茶树，分成6个区组，组间设有隔离带，将对照处理液及上述浓度的SA分别对6个区组进行叶面喷雾处理，套袋保湿12h后重复上述操作3次以确保SA能够有效被植物吸收。将事先收集的带有炭疽病菌的龙井43叶片（100片）按照1g/20ml的比例用蒸馏水浸泡1h后，纱布过滤去除叶片，采用喷雾方式将滤液喷于前述不同处理的龙井43茶树。于处理后20天做病情调查并取样冻存用于基因表达分析。病情调查采用的分级标准为：Ⅰ级：叶片无病斑；Ⅱ级：叶片病斑面积为0-1mm²；Ⅲ级：叶片病斑面积为1-2mm²；Ⅳ级：叶片病斑面积为2-4mm²；Ⅴ级：叶片病斑面积为4mm²以上。

取各冻存样品（冻存3天后）叶片100mg，经液氮研磨后，以TRIzol法提取茶树叶片总RNA，以TaKaRa PrimeScript II1^st Strand cDNA Synthesis Kit（宝生物[大连]有限公司）进行cDNA第一链合成，以CamPGIP表达引物SEQ ID No:15和SEQ ID No:16进行RT-PCR表达验证，产物大小为296bp。RT-PCR采用全式金2×Easy Taq^TM PCR SuperMix（全式金[北京]有限公司）进行，以Actin为参比基因。15μl反应体系为：ddH₂O4.9μl；2×Easy Taq^TM PCR SuperMix7.5μl；Primer(SEQ ID No：15&SEQ ID No：16或者SEQ ID No：17&SEQ ID No：18;10mMeach)0.6μl；cDNA（浓度为100ng/μl）2μl。PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s、60℃退火30s、72℃延伸30s、30个循环，72℃后延伸10min。产物以2.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

显示病情指数调查及CamPGIP表达强度凝胶检测图。病情指数调查结果，显示随外源SA浓度增大，病情指数显著下降，即病害程度随SA浓度增大而减小，如图3所示。基因表达结果显示，茶树叶片CamPGIP基因表达随SA浓度处理增大而增强，20mmol/L时表达最强，说明外源水杨酸可诱导CamPGIP基因表达增强。综上，经外源水杨酸处理后CamPGIP基因高表达的茶树叶片病害发生程度显著下降。说明外源诱导CamPGIP基因高表达可提高茶树抗病性。

实施例3：转茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP烟草获得及其鉴定

1）RT-PCR扩增CamPGIP基因及扩增片段连入T-载体

根据SEQ ID No：1所示基因的开放阅读框（自5’端第31位至1023位碱基）序列设计引物，并在引物中引入Nde I和Sac1酶切位点，上下游引物分别如SEQ ID No:19和SEQ ID No:20所示，其中AA为保护碱基，SEQ ID No:19中划线部分为引入的Nde I酶切位点，SEQ ID No:20中划线部分为引入的Sac1酶切位点。以TRIzol试剂提取福鼎大白茶树品种嫩芽总RNA，cDNA第一链合成采用TaKaRa PrimeScript II1^st Strand cDNA Synthesis Kit（宝生物[大连]有限公司）进行。PCR反应以TaKaRa Ex Taq Hot Start Version（宝生物[大连]有限公司）进行，50μl反应体系中包括：ddH₂O30.5μl；TaKaRa Ex Taq Hot Start（5U/μl）0.5μl；Primer(SEQ ID No：19&SEQ ID No：20;10mM each)4μl；10×Ex Taq Buffer（Mg²⁺Plus）5μl；dNTP Mixture（2.5mMeach）8μl；cDNA（浓度为100ng/μl）2μl。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸3min，35循环；72℃后延伸10min。产物取20μl并混入4μl6×上样缓冲液（6×Loading Buffer）以1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2）pRI-201-AN-DNA-CamPGIP双元表达载体构建

上述电泳茶树CamPGIP基因目标条带割取后，以TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0（宝生物[大连]有限公司）进行条带回收，插入18-T Vector（宝生物[大连]有限公司）中间载体，并转化JM109感受态大肠杆菌（全式金[北京]有限公司），具体操作参见纯化试剂盒、载体及工程菌使用说明。经蓝白斑筛选及通用引物M13（引物序列如SEQ IDNo:13和SEQ ID No:14所示）PCR检测后，阳性克隆委托Invitrogen公司进行序列分析。将测序确认后的阳性克隆接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养12h，8000rpm离心2min后收集细菌沉淀，以TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.3.0（宝生物[大连]有限公司）提取含CamPGIP基因开放阅读框序列的重组pMD18-CamPGIP质粒，具体操作参见质粒提取试剂盒。将pMD18-CamPGIP质粒和真核双元表达载体TaKaRa pRI201-AN DNA（宝生物[大连]有限公司）同时经Nde I和Sac I双酶切及1.0%琼脂糖凝胶电泳，目的条带切割后以TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（宝生物[大连]有限公司）进行回收，具体操作参见限制性酶切、线性胶回收试剂盒操作说明。产物以DNA Ligation Kit Ver.2.1（宝生物[大连]有限公司）进行连接，连接反应体系制备后于16℃下连接过夜，连接液转化TG1感受态大肠杆菌，并涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上进行抗性筛选，阳性克隆接种于1ml LB液体培养基中扩增12h后进行通用引物M13（引物序列如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14所示）PCR检测，具体操作参见连接试剂盒、工程菌操作说明。阳性克隆接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养12h，8000rpm离心2min后收集细菌沉淀，以TaKaRa MiniBEST Plasmid PurificationKit Ver.3.0（宝生物[大连]有限公司）提取含CamPGIP基因开放阅读框序列的重组pRI-201-AN-DNA-CamPGIP双元表达载体质粒，具体操作参见质粒提取试剂盒。采用冻融交替法将重组pRI-201-AN-DNA-CamPGIP双元表达载体质粒导入发根农杆菌LBA4404，获得侵染用菌株。

3）农杆菌介导法转化烟草及再生苗的获得

将上述侵染用发根农杆菌LBA4404在添加50mg/L卡那霉素（Km）的发根农杆菌培养基（YEB）固体培养基上28℃黑暗培养活化两次，每次12h。挑取单菌落接种于20ml含50mg/LKm的液体YEB培养基中，28℃&250r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.5-0.8用于侵染。将烟草W38无菌苗叶片剪成1cm左右的烟草叶盘，于MS共培养培养基（MS培养基成分+2mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8）25℃下黑暗预培养3天后，置于发根农杆菌菌液中浸泡侵染7-8min，期间不断轻轻摇荡，无菌滤纸吸干多余的菌液，转移至MS共培养培养基中，25℃黑暗中共培养3天，转移于含75mg/L Km和250mg/L头孢霉素（Cef）的MS筛选培养基（又称抑菌培养基：MS共培养培养基+250mg/L头孢霉素+75mg/L Km）中25℃黑暗培养10天，取出置于25℃光照培养，使其分化愈伤组织直至出芽，待芽长至3-5cm时，剪下并转入生根培养基（1/2MS+0.1mg/L IBA+250mg/L Cef+75mg/L Km+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8）中诱导生根。野生型烟草为对照植株。

4）转茶树CamPGIP基因烟草鉴定

取转化烟草新鲜幼嫩叶片用CTAB法提取烟草基因组DNA，以引物SEQ ID No:21和SEQID No:22进行PCR验证，产物大小为993bp。RT-PCR采用全式金2×Easy Taq^TM PCR SuperMix（全式金[北京]有限公司）进行，15μl反应体系为：ddH₂O4.9μl；2×Easy Taq^TM PCR SuperMix（全式金[北京]有限公司）7.5μl；引物对(SEQ ID No：21&SEQ ID No：22;10mM each)0.6μl；DNA（浓度为100ng/μl）2μl。PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45s、55℃退火30s、72℃延伸60s、35个循环；72℃后延伸10min。产物以1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，目的条带大约为993bp（图4）。将转茶树CamPGIP基因阳性植株进行扩繁。

实施例4：转茶树CamPGIP基因烟草抗病性分析

无菌条件下将烟草先用75%的酒精进行表面消毒，再用0.1%的HgCl₂消毒后，用无菌水冲洗3-5次，接种炭疽病菌菌株（ACCC36167），25℃恒温培养3-5天，将培养好的菌株再次转接到覆盖于PDA培养基上的烟草叶片上，25℃恒温培养3-5天后按照上述方法再次转接菌种，如此重复继代5-7代，获得复壮菌株。复壮后的菌株接种到PDA培养基上25℃恒温培养5天，将分生孢子用无菌水洗脱并将孢子悬浮液浓度稀释至1×10⁴个/ml，保存于4℃冰箱内备用。

选取长势良好的上述转茶树CamPGIP基因烟草植株和野生对照植株，用灭菌牙签蘸取菌液于叶背扎小孔，套袋保湿，于接种后10天测量病斑大小并取样冻存用于基因表达分析。病斑观察显示，转茶树CamPGIP基因烟草叶片病斑仅为野生对照1/4左右（图5）。对冻存样采用实施例2中的RT-PCR方法进行CamPGIP基因表达强度分析，结果显示（图5），转茶树CamPGIP基因烟草叶片中CamPGIP基因表达强度显著高于野生对照。由此说明转茶树CamPGIP基因烟草叶片中，在CaMV35S强启动子驱动下，大量表达外源转入的CamPGIP基因，使转基因烟草的抗炭疽病能力显著提高。

实施例5：转茶树CamPGIP基因与转其它来源多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因烟草抗病性比较

按照实施例3的方法分别将已公开的登录号为Z49063.1的猕猴桃、登录号FJ347133.1的越橘和登录号为AF499451.1的葡萄的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因，通过转化载体构建、农杆菌介导法转化和再生苗鉴定等步骤，分别获得转猕猴桃、越橘和葡萄多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的烟草。并采用实施例4方法，对多种来源的转多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白烟草进行抗炭疽病比较，结果显示，转茶树CamPGIP基因的烟草的抗病性显著高于转猕猴桃或越橘或葡萄多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的烟草，转茶树CamPGIP基因的烟草病斑数目较转猕猴桃、越橘和葡萄多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的烟草少1-5倍，病斑大小也较转猕猴桃、越橘和葡萄多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因烟草小1/3左右（图6）。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江大学

 

<120> 茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP及其应用

 

<160> 22

 

<210> 1

<211> 1225

<212> DNA

<213> 茶树（Camellia sinensis L.）

 

<400> 1

caacaaacca  aaaaaataca  caaaccgaaa atgactctct  tctcagttct  gtccctctct  60

ctcctcgtct  ttctctctct  accatctcca  tctctctccg  aacccgaaat  ctgcaattcc  120

gaagacaaaa  aagtcctcct  gaaaatcaaa  gcagccctaa  acaatcccta  ccacttggcc  180

tcgtggaacc  cagaaactaa  ttgctgtgat  tggtactcag  tggagtgtga  tgaaatcacc  240

agtcgcatca  tttccctcaa  tatctttggc  ggtaacatct  ccggtcgaat  cccgccagct  300

gtcggagacc  tcccatacct  ccaaacctta  gttttccgca  aactctccaa  cctcaccggc  360

caaatccctt  ctgccattac  caaactcaaa  cagctcaaaa  tgataacatt  gagctggacc  420

aacctctctg  gtcctgtccc  ttcattcttt  actgagctta  aaaaccttac  cttccttgac  480

ctgtccttca  acgacctcac  cggttcgatc  cctcccgagc  tagcccaact  caccaacctc  540

ggtgccattc  gcttagacag  gaacaagctc  accggaacca  ttcccgaatc  ctttggaaag  600

ttcaccggat  cagtcccaga  cctttatctc  tctcacaacc  aactcactgg  accagtacca  660

aagtctttgg  gtaacttgaa  cttcacagtc  cttgattttt  cacgcaacca  gctttctggt  720

gatttgtcat  tcatcttcgg  atccaataaa  accatgcaga  tagttgactt  ctcaaggaac  780

atgttcgact  tcgatctcag  caacgtggtt  tttccggcga  gcttgacatc  gttggatctg  840

aaccataaca  agatctttgg  aagtcttccg  gcaggcttga  cggcgctgaa  ttttcagtac  900

ttgaacgtca  gctataatag  gctgtgtggc  ccgattccga  cgggtgggaa  gttgcagagc  960

tttgatctga  cgtcctattt  tcacaaccgg  tgcttgtgtg  gcgctccact  gccggcctgc  1020

tagtatgtat  cttcagcaag  tccagtttgg  aagtttgaag  tttgaagttt  gagtaatagt  1080

gtttgtcttg  tttcaataat  agtgtgaatt  tacattccgt  tctggtcaat  ttggacacaa  1140

attgtggata  aggctgtatt  gtttttgggt  gaatagactc  tttattgtct  ttataaataa  1200

agacaaattt  cagcaaagaa  aaaaa                                           1225

 

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> 茶树（Camellia sinensis L.）

 

<400> 2

Met Thr Leu Phe Ser Val Leu Ser Leu Ser Leu Leu Val Phe Leu

1               5                  10                  15

Ser Leu Pro Ser Pro Ser Leu Ser Glu Pro Glu Ile Cys Asn Ser

20                  25                  30

Glu Asp Lys Lys Val Leu Leu Lys Ile Lys Ala Ala Leu Asn Asn

35                  40                  45

Pro Tyr His Leu Ala Ser Trp Asn Pro Glu Thr Asn Cys Cys Asp

50                  55                  60

Trp Tyr Ser Val Glu Cys Asp Glu Ile Thr Ser Arg Ile Ile Ser

65                  70                  75

Leu Asn Ile Phe Gly Gly Asn Ile Ser Gly Arg Ile Pro Pro Ala

80                  85                  90

Val Gly Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Thr Leu Val Phe Arg Lys Leu

95                  100                 105

Ser Asn Leu Thr Gly Gln Ile Pro Ser Ala Ile Thr Lys Leu Lys

110                 115                 120

Gln Leu Lys Met Ile Thr Leu Ser Trp Thr Asn Leu Ser Gly Pro

125                 130                 135

Val Pro Ser Phe Phe Thr Glu Leu Lys Asn Leu Thr Phe Leu Asp

140                 145                 150

Leu Ser Phe Asn Asp Leu Thr Gly Ser Ile Pro Pro Glu Leu Ala

155                 160                 165

Gln Leu Thr Asn Leu Gly Ala Ile Arg Leu Asp Arg Asn Lys Leu

170                 175                 180

Thr Gly Thr Ile Pro Glu Ser Phe Gly Lys Phe Thr Gly Ser Val

185                 190                 195

Pro Asp Leu Tyr Leu Ser His Asn Gln Leu Thr Gly Pro Val Pro

200                 205                 210

Lys Ser Leu Gly Asn leu Asn Phe Thr Val Leu Asp Phe Ser Arg

215                 220                 225

Asn Gln Leu Ser Gly Asp Leu Ser Phe Ile Phe Gly Ser Asn Lys

230                 235                 240

Thr Met Gln Ile Val Asp Phe Ser Arg Asn Met Phe Asp Phe Asp

245                 250                 255

Leu Ser Asn Val Val Phe Pro Ala Ser Leu Thr Ser Leu Asp leu

260                 265                 270

Asn His Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu Pro Ala Gly Leu Thr Ala

275                 280                 285

Leu Asn Phe Gln Tyr Leu Asn Val Ser Tyr Asn Arg Leu Cys Gly

290                 295                 300

Pro Ile Pro Thr Gly Gly Lys Leu Gln Ser Phe Asp Leu Thr Ser

305                 310                 315

Tyr Phe His Asn Arg Cys Leu Cys Gly Ala Pro Leu Pro Ala Cys

320                 325                 330

 

 

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 接头Adaptor 1

 

<400> 3

ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt               44

 

 

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 接头Adaptor 2R

 

<400> 4

ctaatacgac tcactatagg gcagcgtggt cgcggccgag gt                42

 

 

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 特异性引物

 

<400> 5

ccattcgctt agacaggaac                  20

 

 

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 3’Outer Primer

 

<400> 6

taccgtcgtt ccactagtga ttt                    23

 

 

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223>特异性引物

 

<400> 7

gaaagttcac cggatcagtc                       20

 

 

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 3’Inner Primer

 

<400> 8

cgcggatcct ccactagtga tttcactata gg                 32

 

 

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 特异性引物

 

<400> 9

ttggaggtat gggaggtctc                      20

 

 

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 5’Outer Primer

 

<400> 10

catggctaca tgctgacagc cta                    23

 

 

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 特异性引物

 

<400> 11

tgagggaaat gatgcgactg                 20

 

 

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 5’Inner Primer

 

<400> 12

cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc gatg                    34

 

 

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> M13-F引物

 

<400> 13

gttttcccag tcacgac                17

 

 

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> M13-R引物

 

<400> 14

caggaaacag ctatgac                     17

 

 

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 表达引物

 

<400> 15

ctcaccggcc aaatcccttc tg                   22

 

 

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 表达引物

 

<400> 16

tggttccggt gagcttgttc ctgt                       24

 

 

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 表达引物

 

<400> 17

aaagcaaaca gagaaaagat gacc                  24

 

 

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 表达引物

 

<400> 18

agcaccaata gtaatgacct gacc                         24

 

 

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 上游引物

 

<400> 19

aacatatgat gactctcttc               20

 

 

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 下游引物

 

<400> 20

aagagctcgc aggccgg               17

 

 

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 引物

 

<400> 21

atgactctct tctcagttct g                  21

 

 

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 引物

 

<400> 22

gcaggccggc agtggag                        17

 

Claims (3)

1.茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP，其特征是：其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.权利要求1所述的茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP编码的蛋白质，其特征是：其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。 

3.权利要求1所述的茶树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CamPGIP的用途，其特征是：用于构建转基因植物，使所述转基因植物的抗病性得以提高，所述转基因植物为烟草，所述病为炭疽病。