CN102154336A - 嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶基因及其重组蛋白 - Google Patents
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Abstract
嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶基因及其重组蛋白。涉及重组蛋白，提供嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶基因及其重组蛋白与制备方法。PCR扩增嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶基因，并将其导入载体，构建重组载体并将其导入宿主细菌，构建表达嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的重组工程菌；将其发酵培养，分离纯化发酵液，即得嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶。首次从嗜酸硫化芽孢杆菌基因组中获得了嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶基因，并通过原核表达得到了嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶。硫氧还蛋白还原酶在嗜酸硫化芽孢杆菌的抗铜作用中起着重要作用，对硫氧化蛋白还原酶的研究，对今后的工业应用有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及重组蛋白，特别涉及一种嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的基因及其重组蛋白。
背景技术
生物冶金方法是一种利用微生物的催化氧化作用，将矿物中的金属以离子形式溶解到浸出液中并回收的方法。由于该方法具有操作简单、成本低、能耗少、流程短等特点(1、姚国成，阮仁满，温建康.生物冶金常用浸矿菌种及改良育种的基本方法[J].金属矿山，2002，11：26-29.)，已成为矿产资源加工的一项重要技术。深海嗜酸硫化芽胞杆菌(Sulfobacillus sp)属于革兰氏阳性菌，是一种在高温、低pH条件下生长的重要生物浸矿菌。硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase，TrxR)是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员(2、张笑天，熊咏民.硫氧还蛋白还原酶研究进展[J].国外医学医学地理分册2004，25(4)151-158)。硫氧还蛋白还原酶和硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)、NADPH构成了对生物体具有重要作用的硫氧还蛋白系统。该系统能稳定细胞内环境、预防活性氧损害、还原DNA合成中的还原酶及多种具有重要功能的蛋白质。
与谷胱甘肽还原酶、汞还原酶、二氢硫锌酰胺脱氢酶一样，硫氧还蛋白还原酶也是一种二硫化物还原酶，它能通过核黄素载体将嘧啶核苷酸中的电子转移到含有二硫键的底物上。与谷胱甘肽还原酶相比，硫氧还蛋白还原酶的C末端伸长了16个残基，其中含有保守的活性位点-Gly-Cys-Sec-Gly，该位点在该酶的氧化还原反应中起着重要作用。目前，在Escherichia.coli中已有4种类型的硫氧还蛋白还原酶的结构被解析，其蛋白结构本质一致的(3、Kuriyan J，Krishna T S R，Wong L，et al.Convergent evolution of similar function in two structurally divergent enzymes[J].Nature.1991，352：172-174.)。
硫氧还蛋白还原酶的主要作用是催化NADPH将氧化型的硫氧还蛋白(Trx)中的二硫键还原成-(SH)2，除此之外，硫氧还蛋白还原酶还能还原维生素K3、硫辛酸、DTNB和四氧嘧啶、磷脂氢过氧化物等；硫氧还蛋白还原酶的催化氧化还原活性在大肠杆菌中有了较全面的了解，它主要通过NADPH旋转66°而FAD保持不动，从而完成电子传递(4、Nordman X L，T’Olason J M，et al.The mammalian Cytosolic selenoenzyme thioredoxin reduction subiquinone a novel menchanism for defense against oxidative stress[J].J.Biol.Chem，2003，278：2141-2146.)。硫氧还蛋白还原酶作为硫氧还蛋白系统的一员，它还参与调节细胞内ROS的水平，与哺乳动物细胞的表型、生长及信号转导有密切的关系(5、Rundlo F A K.Arner E S.Regulation of the mammalian selenoprotein thioredoxin reductase 1in relation to cellular phenotype，growth and signaling events[J].Antioxid Redox Signal.2004，6：41-52.)。
值得注意的是：通过对嗜酸硫化芽孢杆菌在适当的铜离子浓度下培养，然后与正常培养条件下进行差异显示实验，申请人发现TrxR基因上调，这就说明TrxR基因在抗铜方面起着一定的作用。铜是生物体必需的微量元素，是许多蛋白和酶的组成成分，以辅基的形式参与细胞内多种重要的代谢途径。但铜离子能氧化蛋白、脂类和DNA，促进形成自由基，从而对生物体产生毒性(6、Gaetke L M，Chow C K.Copper toxicity，oxidative stress，and antioxidant nutrients[J].Toxicology，2003，189(1-2)：147-163.)；嗜酸硫化芽孢杆菌作为一种浸矿微生物，它与铜离子存在着密切的关系。研究发现微生物对重金属的抗性的机制有以下3种：(1)通过外排系统将有毒物质排出体外；(2)通过含巯基等分子将有毒物质形成络合物或螯合物；(3)通过酶促或化学反应将有毒物质还原为无毒或低毒的状态(7、Nies D H.Microbial heavy metal resistance[J].Appl Microbiol Biotechnol，1999，51(6)：730-750.)。目前，对TrxR的抗铜机制还不了解，有待进一步的研究。
发明内容
本发明的第一目的在于提供嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶基因。
本发明的第二目的在于提供嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶。
本发明的第三目的在于提供嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的制备方法。
所述嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶基因的序列为：
atgccaacgg aacaggtaat cattctcggt accggtccgg ccggctatac ggccgcaatc 60
tatgccgcgc gggccaactt gtcgccctta gtgattgaag gcgaagaacc cggtgggcaa 120
ctgttgctca cgacagaggt ggaaaatttt ccgggattcc cggaaggcat tttaggcccg 180
gacttgatgg aaaacatgaa aaaacaggcc gaaaagttcg gggcccgctt tgaatacgga 240
cgcgcttcga gcgttgactt gtctcaacgc ccctttcggg tggtggtgga cgaaagcacc 300
gaatatacca ccgaagcgct cattattgcc accggggcca gtgccaaatt actagaaatt 360
cccggtgaag ccgagctcat tggccgtggg gtctccacct gtgccacctg tgacgggttt 420
tttttccaaa acaaacccat catcgtggtg ggaggcggcg attccgccat ggaagaagcc 480
ctgttcttga ccaaatatgc gtccgaagtg accatcgtcc accggcggga tactctacgg 540
gcatccaaag tcatgcaaga acgcgcccac cagaacccca agattcggtg gcaaatgaat 600
cgcacgcccg ttgaagtgct ggcgcaaaac ggcaaagtca gcgggcttcg cgtacggaat 660
aacgaaacgg gagcgctcga agatttgcct gccggcggca ttttcgtatc gataggccac 720
cggcccaata ccgaatttct cggaggccaa ttggcgcttg atccggtggg ttatattcag 780
gtggacgggg tcagcaccta caccagtgtc gaaggggtat tcgcgtgcgg cgacgtggcc 840
gatccgcgct accgccaagc tattaccgcc gccggcagcg gctgtcgggc tgccatggat 900
gtggaacgct ggctggaatc gatccaccat caggcgggtc agttgaccca ttcctaa 957
所述嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的氨基酸序列为：
Met Pro Thr Glu Gln Val Ile Ile Leu Gly Thr Gly Pro Ala Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Ala Ala Ile Tyr Ala Ala Arg Ala Asn Leu Ser Pro Leu Val Ile
20 25 30
Glu Gly Glu Glu Pro Gly Gly Gln Leu Leu Leu Thr Thr Glu Val Glu
35 40 45
Asn Phe Pro Gly Phe Pro Glu Gly Ile Leu Gly Pro Asp Leu Met Glu
50 55 60
Asn Met Lys Lys Gln Ala Glu Lys Phe Gly Ala Arg Phe Glu Tyr Gly
65 70 75 80
Arg Ala Ser Ser Val Asp Leu Ser Gln Arg Pro Phe Arg Val Val Val
85 90 95
Asp Glu Ser Thr Glu Tyr Thr Thr Glu Ala Leu Ile Ile Ala Thr Gly
100 105 110
Ala Ser Ala Lys Leu Leu Glu Ile Pro Gly Glu Ala Glu Leu Ile Gly
115 120 125
Arg Gly Val Ser Thr Cys Ala Thr Cys Asp Gly Phe Phe Phe Gln Asn
130 135 140
Lys Pro Ile Ile Val Val Gly Gly Gly Asp Ser Ala Met Glu Glu Ala
145 150 155 160
Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Ser Glu Val Thr Ile Val His Arg Arg
165 170 175
Asp Thr Leu Arg Ala Ser Lys Val Met Gln Glu Arg Ala His Gln Asn
180 185 190
Pro Lys Ile Arg Trp Gln Met Asn Arg Thr Pro Val Glu Val Leu Ala
195 200 205
Gln Asn Gly Lys Val Ser Gly Leu Arg Val Arg Asn Asn Glu Thr Gly
210 215 220
Ala Leu Glu Asp Leu Pro Ala Gly Gly Ile Phe Val Ser Ile Gly His
225 230 235 240
Arg Pro Asn Thr Glu Phe Leu Gly Gly Gln Leu Ala Leu Asp Pro Val
245 250 255
Gly Tyr Ile Gln Val Asp Gly Val Ser Thr Tyr Thr Ser Val Glu Gly
260 265 270
Val Phe Ala Cys Gly Asp Val Ala Asp Pro Arg Tyr Arg Gln Ala Ile
275 280 285
Thr Ala Ala Gly Ser Gly Cys Arg Ala Ala Met Asp Val Glu Arg Trp
290 295 300
Leu Glu Ser Ile His His Gln Ala Gly Gln Leu Thr His Ser
305 310 315
所述嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的制备方法包括以下步骤：
1)PCR扩增嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶基因，并将其导入载体，构建重组载体；
2)将重组载体导入宿主细菌，构建表达嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶的重组工程菌；
3)将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶。
在步骤1)中，所述PCR扩增中所用的正向引物和反向引物分别为：
正向引物：5′-GC GGATCC ATGCCAACGGAAC-3′；
反向引物：5′-GC AAGCTT TTAGGAATGGGTC-3′；
所述PCR扩增中所用模板为嗜酸硫化芽孢杆菌基因组，所述嗜酸硫化芽孢杆菌TPY(Sulfobacillus acidophilus TPY)已于2010年08月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010203，中国典型培养物保藏中心的地址为：中国，武汉，武汉大学。
所述载体可为pET-GST等。
在步骤2)中，所述宿主细菌可为E.coli BL21(DE3)等。
在步骤3)中，所述分离纯化可采用GST融合蛋白纯化。
本发明的突出优点和技术效果如下：
首次从嗜酸硫化芽孢杆菌基因组中获得了嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶基因，并通过原核表达得到了嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶。硫氧还蛋白还原酶是一个非常重要的还原酶，它的主要作用是催化NADPH将氧化型的硫氧还蛋白(Trx)中的二硫键还原成-(SH)2，而Trx在电子传递过程中起着重要作用，对其进行研究对阐明嗜酸硫化芽孢杆菌电子传递途径具有重要意义。除此之外，硫氧还蛋白还原酶还能还原维生素K3、硫辛酸、DTNB、四氧嘧啶和磷脂氢过氧化物等。通过差异显示实验，硫氧还蛋白还原酶在嗜酸硫化芽孢杆菌的抗铜作用中起着重要作用，对硫氧化蛋白还原酶的研究，对今后的工业应用有重要意义。
附图说明
图1为嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶基因在大肠杆菌表达产物的电泳图。在图1中，1、3为蛋白Marker，97、66、45、30、20、14为蛋白分子量，单位为道尔顿。2为嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶基因在大肠杆菌表达后的产物，4、5是纯化获得的嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的技术方案。
本发明所用嗜酸硫化芽孢杆菌TPY是从太平洋热液区样品中分离纯化得到的一株中等嗜热嗜酸菌，具体分离纯化方法可参考中国发明专利200610135418.9。
实施例1嗜酸硫化芽孢杆菌基因组的提取
1)取100mL的已经培养至稳定期的嗜酸硫化芽孢杆菌培养液，于10000rpm下离心10min收集嗜酸硫化芽孢杆菌；
2)用pH＝2的去离子水洗涤嗜酸硫化芽孢杆菌，去除盐离子；
3)用500μL的TE(pH8.0)重悬，加入30μL的溶菌酶(50μg/μL)(由于嗜酸硫化芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，破壁较难)，混匀，37℃水浴10min；
4)加入30μL 10％的SDS溶液和10μl RNase(20μg/μL)混匀，55℃水浴10min，再加入3μL蛋白酶K(20μg/μL)，55℃水浴10min，直至菌液变澄清；
5)加入150μL 5mol/L的NaCl，充分混匀，再加入80μL的CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃水浴10min；
6)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀，12,000rpm离心10min，上清液转移入新管中；如果对DNA质量要求比较高可以多抽提几次；
7)加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置2～3h，直到DNA沉淀下来，12,000rpm离心10min；
8)弃上清，用70％的乙醇洗两次，晾干；
9)沉淀溶解于30～60μL超纯水中，-20℃储存备用。
实施例2嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶基因的扩增和重组工程菌的构建
PCR扩增反应体系
嗜酸硫化芽孢杆菌基因组DNA 2μl(80～100ng)
正反向引物、反向引物 各10pmol
10×PCR缓冲液 2.5μL
dNTP(2.5mmol/L) 2μL
Taq聚合酶 3μL
超纯水 补至25μL
正、反向引物分别为：
正向引物：5′-GC GGATCC ATGCCAACGGAAC-3′；
反向引物：5′-GC AAGCTT TTAGGAATGGGTC-3′；
PCR反应程序：
95℃ 5min
94℃ 1min
55℃ 1min
72℃ 1.5min 35循环
72℃ 10min
回收PCR反应产物，连接到pMD18T-Simple vector(购自TaKaRa)
连接体系为：
DNA片段 3μL(DNA片段的摩尔数应控制在载体摩尔数的3～10倍)
质粒载体(pET-GST) 1μL
10×T4DNA连接缓冲液 2.5μL
T4DNA连接酶(350U/μL) 1.0μL
超纯水 补至25μL
连接产物送去测序，将测序正确的进行双酶切，回收酶切后的目的片段
酶切反应体系(20μL)：含有目的基因的pMD18-T质粒 5μL
酶切缓冲液(10×K) 2μL
BamHI+HindIII 各0.5μL
超纯水 12μL
酶切后的目的片段连接到pET-GST载体，再将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组工程菌。转化的具体步骤为：
1)取E.coli BL21(DE3)感受态细胞，加入含有目的基因(即嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶基因)的pET-GST重组质粒，冰浴30min；
2)于42℃下热激90s，迅速转至冰浴中，冷却2min；
3)加入800μL LB液体培养基，于37℃摇床上低速摇动1h；
4)取适量转化菌液涂布于LB固体培养基上，含100μg/mL Amp；
5)倒置平板，培养12～16h，挑选平板上长出的阳性克隆，扩大培养并冻存保种。
实施例3嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶的表达
将含有目的片段的pET-GST表达载体转入大肠杆菌BL21后，取1mL大肠杆菌BL21重组工程菌加入到100mL LB培养基(含有氨苄青霉素10ug)中，37℃摇床培养到OD600＝0.5左右，再加入20μl的IPTG(终浓度0.1mmol/mL)，25℃诱导6个h。将发酵液于8000g离心10min，弃上清，沉淀用10mL的PBS洗3次，然后超声破碎菌体10min，将破碎后的菌体转移到50mL离心管，12000rpm离心20min，收集上清液，沉淀用PBS重悬，取适量的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析(参见图1)。
实施例4嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶的分离与纯化
1)处理GST(Glutathione Sepharose 4Fast Flow)介质，装柱并平衡柱子；
2)取2ml实施例3中得到的上清液加入到介质中，4℃结合2h；
3)用5～10个柱体积的PBS洗去杂蛋白，至无杂蛋白；
4)用蛋白洗脱缓冲液(10mmol/L还原型谷胱甘肽、50mmol/L Tris-HCl pH＝8.0)洗下结合蛋白，即得嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶。取20μl进行电泳检测(参见图1)，余下-80℃冷冻保藏。
Claims (8)
1.嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶基因，其特征在于其序列为：
atgccaacgg aacaggtaat cattctcggt accggtccgg ccggctatac ggccgcaatc 60
tatgccgcgc gggccaactt gtcgccctta gtgattgaag gcgaagaacc cggtgggcaa 120
ctgttgctca cgacagaggt ggaaaatttt ccgggattcc cggaaggcat tttaggcccg 180
gacttgatgg aaaacatgaa aaaacaggcc gaaaagttcg gggcccgctt tgaatacgga 240
cgcgcttcga gcgttgactt gtctcaacgc ccctttcggg tggtggtgga cgaaagcacc 300
gaatatacca ccgaagcgct cattattgcc accggggcca gtgccaaatt actagaaatt 360
cccggtgaag ccgagctcat tggccgtggg gtctccacct gtgccacctg tgacgggttt 420
tttttccaaa acaaacccat catcgtggtg ggaggcggcg attccgccat ggaagaagcc 480
ctgttcttga ccaaatatgc gtccgaagtg accatcgtcc accggcggga tactctacgg 540
gcatccaaag tcatgcaaga acgcgcccac cagaacccca agattcggtg gcaaatgaat 600
cgcacgcccg ttgaagtgct ggcgcaaaac ggcaaagtca gcgggcttcg cgtacggaat 660
aacgaaacgg gagcgctcga agatttgcct gccggcggca ttttcgtatc gataggccac 720
cggcccaata ccgaatttct cggaggccaa ttggcgcttg atccggtggg ttatattcag 780
gtggacgggg tcagcaccta caccagtgtc gaaggggtat tcgcgtgcgg cgacgtggcc 840
gatccgcgct accgccaagc tattaccgcc gccggcagcg gctgtcgggc tgccatggat 900
gtggaacgct ggctggaatc gatccaccat caggcgggtc agttgaccca ttcctaa 957。
2.嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶，其特征在于，其氨基酸序列为：
Met Pro Thr Glu Gln Val Ile Ile Leu Gly Thr Gly Pro Ala Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Ala Ala Ile Tyr Ala Ala Arg Ala Asn Leu Ser Pro Leu Val Ile
20 25 30
Glu Gly Glu Glu Pro Gly Gly Gln Leu Leu Leu Thr Thr Glu Val Glu
35 40 45
Asn Phe Pro Gly Phe Pro Glu Gly Ile Leu Gly Pro Asp Leu Met Glu
50 55 60
Asn Met Lys Lys Gln Ala Glu Lys Phe Gly Ala Arg Phe Glu Tyr Gly
65 70 75 80
Arg Ala Ser Ser Val Asp Leu Ser Gln Arg Pro Phe Arg Val Val Val
85 90 95
Asp Glu Ser Thr Glu Tyr Thr Thr Glu Ala Leu Ile Ile Ala Thr Gly
100 105 110
Ala Ser Ala Lys Leu Leu Glu Ile Pro Gly Glu Ala Glu Leu Ile Gly
115 120 125
Arg Gly Val Ser Thr Cys Ala Thr Cys Asp Gly Phe Phe Phe Gln Asn
130 135 140
Lys Pro Ile Ile Val Val Gly Gly Gly Asp Ser Ala Met Glu Glu Ala
145 150 155 160
Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Ser Glu Val Thr Ile Val His Arg Arg
165 170 175
Asp Thr Leu Arg Ala Ser Lys Val Met Gln Glu Arg Ala His Gln Asn
180 185 190
Pro Lys Ile Arg Trp Gln Met Asn Arg Thr Pro Val Glu Val Leu Ala
195 200 205
Gln Asn Gly Lys Val Ser Gly Leu Arg Val Arg Asn Asn Glu Thr Gly
210 215 220
Ala Leu Glu Asp Leu Pro Ala Gly Gly Ile Phe Val Ser Ile Gly His
225 230 235 240
Arg Pro Asn Thr Glu Phe Leu Gly Gly Gln Leu Ala Leu Asp Pro Val
245 250 255
Gly Tyr Ile Gln Val Asp Gly Val Ser Thr Tyr Thr Ser Val Glu Gly
260 265 270
Val Phe Ala Cys Gly Asp Val Ala Asp Pro Arg Tyr Arg Gln Ala Ile
275 280 285
Thr Ala Ala Gly Ser Gly Cys Arg Ala Ala Met Asp Val Glu Arg Trp
290 295 300
Leu Glu Ser Ile His His Gln Ala Gly Gln Leu Thr His Ser
305 310 315。
3.如权利要求2所述的嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)PCR扩增嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶基因，并将其导入载体，构建重组载体；
2)将重组载体导入宿主细菌，构建表达嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶的重组工程菌；
3)将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得嗜酸硫化芽胞杆菌硫氧还蛋白还原酶。
4.如权利要求3所述的嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述PCR扩增中所用的正向引物和反向引物分别为：
正向引物：5′-GC GGATCC ATGCCAACGGAAC-3′；
反向引物：5′-GC AAGCTT TTAGGAATGGGTC-3′。
5.如权利要求3所述的嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述PCR扩增中所用模板为嗜酸硫化芽孢杆菌基因组，所述嗜酸硫化芽孢杆菌TPY已于2010年08月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010203，中国典型培养物保藏中心的地址为：中国，武汉，武汉大学。
6.如权利要求3所述的嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述载体为pET-GST。
7.如权利要求3所述的嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述宿主细菌为E.coli BL21(DE3)。
8.如权利要求3所述的嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述分离纯化采用GST融合蛋白纯化。
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2011
- 2011-01-25 CN CN 201110026855 patent/CN102154336A/zh active Pending
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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