CN113896777A

CN113896777A - 一种喜温嗜酸硫杆菌来源EpsRAc转录调控因子及其在耐受铜氧化方面的应用

Info

Publication number: CN113896777A
Application number: CN202111230051.XA
Authority: CN
Inventors: 冯守帅; 杨海麟; 尹伊君; 仝艳军; 陆潇洋; 邱永康
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-10-18
Filing date: 2021-10-18
Publication date: 2022-01-07
Anticipated expiration: 2041-10-18
Also published as: CN113896777B

Abstract

本发明公开了一种喜温嗜酸硫杆菌来源EpsRAc转录调控因子及其在耐受铜氧化方面的应用，属于生物化学与分子生物学领域。本发明对来源于喜温嗜酸硫杆菌转录调控因子EpsR^Ac的启动子序列及参与转录调控因子EpsR^Ac调节的重金属特异性进行分析。通过在大肠杆菌中异源表达，证实了EpsR^Ac在耐受铜离子方面的作用。EpsR^Ac蛋白与铜离子的共纯化表明铜离子可能间接调控EpsR^Ac蛋白以达到转录调控的目的。本发明为后期通过转录调控等代谢手段提高喜温嗜酸硫杆菌耐铜性能，从而为提高铜矿石的重金属离子的生物浸出奠定了基础。

Description

一种喜温嗜酸硫杆菌来源EpsRAc转录调控因子及其在耐受铜氧化方面的应用

技术领域

本发明涉及一种喜温嗜酸硫杆菌来源EpsRAc转录调控因子及其在耐受铜氧化方面的应用，具体涉及从喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)中分离的MarR家族与EPS分泌有关的转录调控因子EpsR^Ac及其编码基因与应用，属于生物化学与分子生物学领域。

背景技术

目前，高品位铜资源的不断消耗导致铜矿石品位迅速下降。高能耗和环境问题对传统的火法冶金和湿法冶金提出了挑战。生物浸出具有工艺简单、能耗低、环境友好等优点，被广泛用于浸出低品位铜矿石和复杂矿石。生物浸出通过对矿石中存在的不溶性硫化铜进行微生物溶解而生成的含硫酸铜的母液经过溶剂萃取，从而获得高浓度的硫酸铜溶液，表明那些具有较高金属抗性的微生物可能对生物开采过程有利。喜温嗜酸硫杆菌(A.caldus)作为浸矿微生物优势菌株，利用各种硫化物进行自养生长，还可在含有机质的混合培养基中生长，能够耐受低酸度及高浓度重金属离子。

细胞外聚合物(EPS)主要包含多糖，蛋白质和脂质，是生物膜的主要成分(占干重生物量的90％)，对于细胞表面附着和微生境形成至关重要。研究发现普通细菌分泌的EPS可以通过所含的还原糖将银和金离子(Ag⁺、Au³⁺)还原为元素银和金纳米粒子(AgNPs、AuNPs)，从而起到作为这些有毒重金属的渗透屏障的作用。同时EPS表现出较强的络合重金属的能力，并且EPS对金属的吸附可能发生质子交换、全局电场或金属微沉淀等反应从而达到提高细菌金属离子耐受性的能力。

A.caldus拥有一系列通过调节自身基因的表达来提高机体的抗逆机制。在基因表达过程中，转录调控因子通过结合在特定的DNA区域调节特定基因的表达。MarR(多重抗生素抗性调节因子)转录调节因子家族以几乎完全表征的大肠杆菌MarR蛋白命名，该蛋白是调节多重抗生素抗性操纵子的基因阻遏物。MarR同源物广泛分布在细菌和古细菌中，控制着广泛的细胞活动，包括抗生素抗性、应激反应、毒力和芳香族化合物的分解代谢。A.caldus MarR家族与EPS分泌有关的转录调控因子基因的分离及其功能分析对于阐明微生物抗逆耐铜机制十分重要。

发明内容

发明人在A.caldus中发现一种MarR家族与EPS分泌有关的转录调控因子，命名为EpsR^Ac，它与菌株的耐铜性能存在着重要的联系。

本发明提供了一种提高微生物对金属离子耐受性的方法，所述方法是在菌株中过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的转录调控因子。

在一种实施方式中，所述转录调控因子的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，将基因序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接至表达载体，转入宿主菌株中。

在一种实施方式中，所述基因通过载体上的启动子启动表达，或是利用核苷酸序列如SEQ ID NO.3～5任一所示的启动子启动所述基因的表达。

优选的，所述启动子的序列如SEQ ID NO.3或5所示。

在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pUC19、pRSFDuet-1、pET28a和/或pET21a。

优选的，所述表达载体为pUC19或pRSFDuet-1。

在一种实施方式中，所述金属离子包括但不限于钴、铜、镉、铬、镍和/或锌。

在一种实施方式中，所述金属离子为锌、镍或铜。

在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或嗜酸性喜温硫杆菌。

优选的，所述微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌。

本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的转录调控因子在提高菌株耐铜性中的应用。

在一种实施方式中，将表达SEQ ID NO.2所示的转录因子的菌株加入到含有铜离子的体系中。

在一种实施方式中，所述体系中铜离子的浓度不低于2.0mM。

在一种实施方式中，铜离子浓度为2.0～3.4mM。

有益效果：

本发明通过将来源于Acidithiobacillus caldus ATCC 51756的转录因子EpsR^Ac连接至表达载体并导入大肠杆菌中进行过表达，验证转录调控因子EpsR^Ac在提高细菌耐铜方面的作用。并证明了所述来源于喜温嗜酸硫杆菌转录调控因子EpsR^Ac及其编码基因在细菌耐铜方面起重要作用。

附图说明

图1为epsR启动子预测结果及相邻基因簇结构图。

图2为重组质粒pJN19-EGFP、pJN19-PⅠ-EGFP、pJN19-PⅡ-EGFP和pJN19-PⅢ-EGFP的PCR扩增片段核酸凝胶电泳图；M，5kb DNAMarker；1，pJN19-PⅠ-EGFP片段；2，pJN19-PⅡ-EGFP片段；3，pJN19-PⅢ-EGFP片段；4，pJN19-EGFP片段。

图3为实施例1的E.coli DH5α中预测启动子EGFP荧光强度检测结果图。

图4为实施例2的重组质粒pJN19-ProⅠ-EGFP、pJN19-ProⅡ-EGFP和pJN19-ProⅢ-EGFP的PCR扩增片段核酸凝胶电泳图；M，5kb DNAMarker；1，pJN19-ProⅠ-EGFP片段；2，pJN19-ProⅡ-EGFP片段；3，pJN19-ProⅢ-EGFP片段。

图5为实施例2的不同重金属离子下E.coli DH5α中EGFP荧光强度检测结果。

图6为实施例3重组菌株和空白大肠杆菌菌株在不同铜离子浓度下的生长12h后的OD₆₀₀值。

图7为实施例4的镍柱亲和层析后洗脱液的SDS-PAGE蛋白胶图；1，100mM咪唑洗脱液；2，200mM咪唑洗脱液；3，300mM咪唑洗脱液；4，400mM咪唑洗脱液；5，500mM咪唑洗脱液；M，Protein Marker(Low)。

具体实施方式

1、荧光强度使用酶标仪检测

参数设置：激发波长485nm，发射波长528nm，增益值100；实验设置三组平行；在荧光强度测定结束后将菌体重悬液转移至透明96孔板测定OD₆₀₀，荧光强度＝荧光吸收值/OD₆₀₀。

实施例1：epsR启动子的确定

(1)启动子预测：为了确定epsR基因的启动子，以模式菌株Acidithiobacilluscaldus ATCC51756基因组DNA为参考(GenBank号：CP005986.1)，分析了A.caldus epsR基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)在内的上游序列，范围为基因组核苷酸251,431至258,533位。使用softberry BPROM网站对该区域可能的启动子进行了预测，预测结果如图1所示，各启动子均包含生物学意义上相对保守的-35区(TTGACA)和-10区(TATAAT)。

预测得到的启动子位于epsR基因和ACAty_RS01295之间，如图1，epsR基因邻近的基因也展示在图1中，此外还包含PⅠ启动子的-35区以及-10区等信息。

PⅠ(SEQ ID NO.3)：

TGTGTGCTCACACGATGAACATGGGCACGAGCATAGGGTGTCTGTTGCTGGAGTGTCAAGTTGCGGAGCTCTGGCGTTTATTACCCCAAGGGCAACATGCCGGATCTCCCGCATCAGATTCAAGCCGCCCTGTTCTCGCAGGGAGAATTCCAGTTCCAGGAAATCCCCTTTGGTTAATTCCCCCACGAGCCCCGACACCCGCAA

PⅡ(SEQ ID NO.4)：

GCCTCCTTCTCTGATGCTCCAGATTCTCCCGGCGTGCCAGTCTTCCTCCCGCAGGCCCCGCGCCCGGATTTCCAGCCTTTTCGACTGGCTCGGCCGCACGCGATAGTGCTCCCGGCCGCGGCCAAATGGGGAGGCAGGTAATGCGTGCTGGAGTACAACCGGTACCGAAGCAGTGCTGGAACGGGTGCGCGATACAAGCTGGTATCTTCGCCAGAAACCAGATTGGAGAGCATAGGGATCCCTCTTGGCAGTTATTTCGTTGGTCAGAAGTATGCGGGGTTTGTGGATAAGTCGGCGCCCGGCTACACTCTCCGGCATGGACGTTCAAGAAACCATCGACAGCCTGCGTAGGGTACTGGAGAG

PⅢ(SEQ ID NO.5)：PⅠ+PⅡ

TGTGTGCTCACACGATGAACATGGGCACGAGCATAGGGTGTCTGTTGCTGGAGTGTCAAGTTGCGGAGCTCTGGCGTTTATTACCCCAAGGGCAACATGCCGGATCTCCCGCATCAGATTCAAGCCGCCCTGTTCTCGCAGGGAGAATTCCAGTTCCAGGAAATCCCCTTTGGTTAATTCCCCCACGAGCCCCGACACCCGCAAGCCTCCTTCTCTGATGCTCCAGATTCTCCCGGCGTGCCAGTCTTCCTCCCGCAGGCCCCGCGCCCGGATTTCCAGCCTTTTCGACTGGCTCGGCCGCACGCGATAGTGCTCCCGGCCGCGGCCAAATGGGGAGGCAGGTAATGCGTGCTGGAGTACAACCGGTACCGAAGCAGTGCTGGAACGGGTGCGCGATACAAGCTGGTATCTTCGCCAGAAACCAGATTGGAGAGCATAGGGATCCCTCTTGGCAGTTATTTCGTTGGTCAGAAGTATGCGGGGTTTGTGGATAAGTCGGCGCCCGGCTACACTCTCCGGCATGGACGTTCAAGAAACCATCGACAGCCTGCGTAGGGTACTGGAGAG

(2)骨架pJN19质粒的构建：对pUC19质粒进行改造，使用引物JN19-F/JN19-R去除质粒上的lac操纵子和启动子区，命名为pJN19。

引物序列如下：

JN19F：GTTAGCTCACTCATTAGGCAACCATGATTACGCCAAGCT，

JN19R：TGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCG。

(3)以pJN19质粒为骨架构建对照质粒，以实验室保藏的pUC19-EGFP(将EGFP插入至pUC19载体的BamHⅠ和SalⅠ酶切位点间)为模板，使用引物JN19-F/JN19-R去除质粒上的lac操纵子和启动子区，得到对照质粒pJN19-EGFP。

(4)采用同源重组法将预测的启动子基因与报告基因egfp融合后插入质粒pJN19的SacⅠ和BamHⅠ酶切位点间，并设计引物检测构建得到的重组质粒是否插入了目的基因，核酸凝胶电泳图如图2。

(5)荧光强度的检测：将改造后的质粒和重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，在LB培养基37℃，200rpm培养16h，收集新鲜的菌体1mL，使用1×PBS(pH 7.4)重悬洗涤2～3次。取200μl重悬液置于96黑孔板中检测荧光强度。荧光强度使用酶标仪检测。

荧光强度检测结果如图3，利用启动子PⅠ和PⅢ启动的EGFP具有较高的荧光强度。

和对照菌株E.coli DH5α(pJN19-EGFP)对比，E.coli DH5α(pJN19-PⅡ-EGFP)检测的EGFP荧光强度甚至低于对照菌株，没有表现出启动子活性，而E.coli DH5α(pJN19-PⅠ-EGFP)和E.coli DH5α(pJN19-PⅢ-EGFP)均表现出一定的启动子活性；E.coli DH5α(pJN19-PⅠ-EGFP)启动子活性约为阴性对照的1.89倍，E.coli DH5α(pJN19-PⅢ-EGFP)启动子活性约为阴性对照的1.8倍，略低于E.coli DH5α(pJN19-PⅠ-EGFP)。

以上结果表明，预测的PⅠ启动子能够在E.coli DH5α中保持活性且可能控制epsR基因的转录表达。

实施例2：参与转录调控因子EpsR^Ac调节过程的重金属离子特异性

故构建pJN19-Pro-EGFP系列重组质粒，将启动子片段和epsR基因一起导入pJN19-EGFP质粒，通过EGFP荧光蛋白表达水平的变化研究参与转录调控因子EpsR^Ac调节过程的重金属离子特异性。包括以下步骤：

(1)pJN19-Pro-EGFP系列重组质粒的构建：采用同源重组法将预测的启动子基因和epsR基因融合后(启动子基因后直接连epsR基因)插入质粒pJN19-EGFP(将启动子基因和epsR基因插入至pJN19-EGFP载体的EGFP和PstⅠ酶切位点间)，构建得到重组质粒，将重组质粒转化至E.coli DH5α中，培养至长出单菌落，设计引物检测单菌落中是否转入了目的片段，核酸凝胶电泳图如图4；

(2)将转化有pJN19-Pro-EGFP重组质粒的E.coli DH5α在LB液体培养基中37℃，200rpm培养至对数生长期。

然后按最小抑制浓度添加不同的重金属离子(按照前期研究的结果，各重金属离子对E.coli DH5α的最小抑制浓度分别为：Co(Ⅱ)1.5mM、Cd(Ⅱ)0.9mM、Ni(Ⅱ)2.8mM、Zn(Ⅱ)1.4mM、Pb(Ⅱ)8.5mM、以及Cu(Ⅱ)3.2mM)，添加后继续培养14h、并收集菌液1mL，使用1×PBS(pH 7.4)重悬洗涤2～3次洗去菌体表面附着金属离子。实验设置三组平行，并检测EGFP荧光强度。

结果如图5所示，与对照组菌菌株相比，含有预测启动子片段的菌株的EGFP荧光强度明显发生变化，其中实验组菌株E.coli DH5α(pJN19-ProⅡ-EGFP)的EGFP荧光强度明显低于其他组，对包括铜在内的各种重金属离子响应程度很弱，说明预测的启动子PⅡ可信度较低，控制epsR基因的转录表达能力较弱。实验组菌株E.coli DH5α(pJN19-ProⅠ-EGFP)和E.coli DH5α(pJN19-ProⅢ-EGFP)的EGFP荧光强度变化趋势相同，说明预测的启动子PⅠ和PⅢ的可信度较高，且E.coli DH5α(pJN19-ProⅢ-EGFP)的EGFP荧光强度更高，对包括铜在内的各种重金属离子响应程度较强，可能说明预测的启动子PⅢ中可能含有PⅠ以外的重金属离子调控元件。实验菌株E.coli DH5α(pJN19-ProⅠ-EGFP)Co(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)实验组与阴性对照菌株相比变化很小，Ni(Ⅱ)实验组与阴性对照菌株相比分别提高了约3.17倍，其他金属离子实验组EGFP荧光强度略低于实验组。实验菌株E.coli DH5α(pJN19-ProⅢ-EGFP)Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)和Cu(Ⅱ)EGFP荧光强度与对照组相比增长较多，分别提高了2.65倍、4.38倍、1.39倍、1.69倍和1.38倍。

实施例3：转录调控因子EpsR^Ac对大肠杆菌铜耐受性的影响

为了探究EpsR^Ac在耐铜方面的应用，将epsR基因导入大肠杆菌，验证其功能，包括如下步骤：

(1)重组质粒pRSFDuet-1-epsR的构建：以模式菌株A.caldus ATCC 51756基因组DNA为参考，采用同源重组法将epsR基因导入质粒pRSFDuet-1的BamHⅠ和SalⅠ位点间，将重组质粒pRSFDuet-1-epsR导入大肠杆菌BL21中，命名为BL21-epsR，用引物UP-1和Down-1检测基因是否导入，核酸凝胶电泳图如图5，引物序列如下：

UP-1：GGATCTCGACGCTCTCCCT，

Down-1：GATTATGCGGCCGTGTACAA；

(2)EpsR^Ac对大肠杆菌铜耐受性的影响：以野生菌株大肠杆菌BL21作为对照，在不同铜离子浓度的LB培养基中于37℃，200rpm摇床培养12h，测定OD₆₀₀。比较重组菌株BL21-epsR和空白大肠杆菌菌株在不同铜离子浓度下的生长情况。结果如图6所示。

不同铜离子浓度下重组菌株和空白对照相比，当2mM≤C_(Cu ²⁺ ₎≤3.4mM，实验组的OD₆₀₀明显高于空白对照组，说明转录调控因子EpsR^Ac的外源导入能够明显提高大肠杆菌的铜耐受性，即具有耐铜作用。

实施例4：铜离子对转录调控因子EpsR^Ac的调节作用

一、EpsR^Ac的表达与纯化：

(1)按2％的接种量将实施例3构建的大肠杆菌BL21-epsR的菌液接种至含100μg·mL^-1卡那霉素的TB液体培养基中，37℃、200rpm培养3h至对数生长中期；加入终浓度0.4mM的IPTG诱导蛋白表达，空白对照组在25℃继续培养23h；实验组在加入IPTG后在25℃继续培养20h后加入终浓度为1mM的CuSO₄，继续培养3h。

(2)培养结束后将菌液在8000rpm、4℃离心10min收集诱导表达的菌体，用1×PBS溶液重悬洗涤2次，按照1g菌体，20mL PBS进行重悬。

(3)使用超声破碎仪破碎菌体，重悬液破碎时全程放置于冰上。参数：功率400w、破碎3s、停3s、时间30min。

(4)将破碎液在4℃，8000rpm离心15min，上清液过0.22μm微孔滤膜用于纯化。

(5)采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白，在300mM咪唑浓度下洗脱，蛋白胶图如图7所示，泳道3为利用300mM咪唑洗脱液洗脱得到的蛋白。

(6)纯化后的蛋白用G25脱盐柱脱盐，置换缓冲液为20mMTris-HCl溶液，脱盐后的蛋白用冷冻干燥机冻干后用少量20mMTris-HCl(pH8)，200mMNaCl溶液复溶，提高蛋白浓度，用Bradford法测定蛋白浓度后置4℃冰箱保存。

二、EpsR^Ac铜含量测定：

(1)样品预处理：蛋白样品用0.1M稀硝酸硝化，以防堵住机器，Tris-HCl溶液中可能含有微量铜离子，所以以未添加硫酸铜的纯化后蛋白作为空白对照。

(2)预先用稀硝酸溶解的铜元素标准品制作标曲，取1mL铜标准品(1000μg/mL)，加入9mL稀硝酸稀释10倍，浓度为100μg/mL。按照表1制备标准溶液。

表1铜离子标准溶液配制方法

(3)利用原子吸收分光光度计测定蛋白中的铜离子含量，根据机器自动绘制的标准曲线计算蛋白样品的铜离子浓度，根据测定的铜离子浓度及蛋白浓度计算蛋白中的铜含量，结果如表2所示。

表2实验组与空白组的蛋白含铜量

与添加铜离子的蛋白相比，实验组蛋白铜离子含量不高于对照组，甚至低于对照组，表明铜离子通过不直接与EpsR^Ac结合，即可能间接调控EpsR^Ac的表达从而达到转录调控的目的。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种喜温嗜酸硫杆菌来源EpsRAc转录调控因子及其在耐受铜氧化方面的应用

<130> BAA211360A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> Acidithiobacillus caldus

<400> 1

atgaaacttg ataatgcaac gcgctaccag ttgctcaaac tcatcgcgga acatccggga 60

tacacccagc gcgaactggc cgccgccatg ggtgtgagcg tggggaaaac caacttttgc 120

atcaaggccc tcatcagcaa gggcctgatc aaggctggga acttccggcg caatcgcgac 180

aaaagcgcct acgcctacct cctcaccccc aagggcatgg aacacaaggc catcgtcacc 240

gtccgattcc tccagcgcaa aatggccgag tatgacgccc tgcgggcgga gatcgccgct 300

ctgcgccggg aagtggacga tcttgccgca tcaggtcttg atgccggaag aggcgcggca 360

tga 363

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> Acidithiobacillus caldus

<400> 2

Met Lys Leu Asp Asn Ala Thr Arg Tyr Gln Leu Leu Lys Leu Ile Ala

1 5 10 15

Glu His Pro Gly Tyr Thr Gln Arg Glu Leu Ala Ala Ala Met Gly Val

20 25 30

Ser Val Gly Lys Thr Asn Phe Cys Ile Lys Ala Leu Ile Ser Lys Gly

35 40 45

Leu Ile Lys Ala Gly Asn Phe Arg Arg Asn Arg Asp Lys Ser Ala Tyr

50 55 60

Ala Tyr Leu Leu Thr Pro Lys Gly Met Glu His Lys Ala Ile Val Thr

65 70 75 80

Val Arg Phe Leu Gln Arg Lys Met Ala Glu Tyr Asp Ala Leu Arg Ala

85 90 95

Glu Ile Ala Ala Leu Arg Arg Glu Val Asp Asp Leu Ala Ala Ser Gly

100 105 110

Leu Asp Ala Gly Arg Gly Ala Ala

115 120

<210> 3

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtgtgctca cacgatgaac atgggcacga gcatagggtg tctgttgctg gagtgtcaag 60

ttgcggagct ctggcgttta ttaccccaag ggcaacatgc cggatctccc gcatcagatt 120

caagccgccc tgttctcgca gggagaattc cagttccagg aaatcccctt tggttaattc 180

ccccacgagc cccgacaccc gcaa 204

<210> 4

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcctccttct ctgatgctcc agattctccc ggcgtgccag tcttcctccc gcaggccccg 60

cgcccggatt tccagccttt tcgactggct cggccgcacg cgatagtgct cccggccgcg 120

gccaaatggg gaggcaggta atgcgtgctg gagtacaacc ggtaccgaag cagtgctgga 180

acgggtgcgc gatacaagct ggtatcttcg ccagaaacca gattggagag catagggatc 240

cctcttggca gttatttcgt tggtcagaag tatgcggggt ttgtggataa gtcggcgccc 300

ggctacactc tccggcatgg acgttcaaga aaccatcgac agcctgcgta gggtactgga 360

gag 363

<210> 5

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtgtgctca cacgatgaac atgggcacga gcatagggtg tctgttgctg gagtgtcaag 60

ttgcggagct ctggcgttta ttaccccaag ggcaacatgc cggatctccc gcatcagatt 120

caagccgccc tgttctcgca gggagaattc cagttccagg aaatcccctt tggttaattc 180

ccccacgagc cccgacaccc gcaagcctcc ttctctgatg ctccagattc tcccggcgtg 240

ccagtcttcc tcccgcaggc cccgcgcccg gatttccagc cttttcgact ggctcggccg 300

cacgcgatag tgctcccggc cgcggccaaa tggggaggca ggtaatgcgt gctggagtac 360

aaccggtacc gaagcagtgc tggaacgggt gcgcgataca agctggtatc ttcgccagaa 420

accagattgg agagcatagg gatccctctt ggcagttatt tcgttggtca gaagtatgcg 480

gggtttgtgg ataagtcggc gcccggctac actctccggc atggacgttc aagaaaccat 540

cgacagcctg cgtagggtac tggagag 567

Claims

1.一种提高微生物对金属离子耐受性的方法，其特征在于，在菌株中过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的转录调控因子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转录调控因子的基因序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将基因序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接至表达载体，转入宿主菌株中；所述基因通过载体上的启动子启动表达，或是利用核苷酸序列如SEQ ID NO.3～5任一所示的启动子启动所述基因的表达。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体包括但不限于pUC19、pRSFDuet-1、pET28a和/或pET21a。

5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述金属离子包括但不限于钴、铜、镉、铬、镍和/或锌。

6.根据权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述微生物包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或嗜酸性喜温硫杆菌。

7.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的转录调控因子在提高菌株耐铜性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将表达SEQ ID NO.2所示的转录因子的菌株加入到含有铜离子的体系中。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述体系中铜离子的浓度不低于2.0mM。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，铜离子浓度为2.0～3.4mM。