CN113461789A - 一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用。本发明经筛选得到了一个新的LysR家族转录调控基因BysR的框内缺失突变株，该突变株表现出明显降低的抑制纹枯病菌的活性，且JP2‑270发酵代谢物中吡咯菌素的合成也受到阻断，经进一步研究发现了一种调控吡咯菌素合成的LysR家族转录调控基因，所述LysR家族转录调控蛋白为BysR蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，对应基因命名为bysR基因，基因序列如SEQ ID No.1所示。本申请为进一步提高吡咯菌素的生物合成量提供遗传基础。

Description

一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因 及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用。

背景技术

伯克霍尔德氏菌是属于β-变形菌纲的革兰氏阴性细菌，被发现广泛存在于水、土壤、植物、动物和人等多种生态环境中。伯克霍尔德氏菌通常具有大而复杂的基因组，染色体拷贝一般为2-5个，其基因组上具有大量的次生代谢物合成基因簇，能够分泌多种次级代谢产物。伯克霍尔德氏菌基因组中聚酮合酶途径和非核糖体多肽途径的总量只低于放线菌，目前成为继放线菌之后的天然产物来源的第二大类细菌。然而其中大部分生物合成基因簇为未开发或者沉默的，要对这些未知基因簇加以开发和利用，则必须建立一套方便快速的遗传操作体系对这些未知基因簇进行挖掘和利用。然而，不同的伯克霍尔德氏菌株经常需要不同的遗传操作方法。例如：泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)它常处于一种自然感受态的状态，引入外源质粒进行遗传操作的最有效方法是通过接合转移(Garcia EC：Burkholderia thailandensis：Genetic Manipulation.Currentprotocols in microbiology 2017，45：4C 2 1-4C 2 15.)，而吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007则是采用改良的热激法实现高效的遗传转化。

申请人前期的专利申请，公开号为CN109234211A的发明申请公开了一株伯克霍尔德氏菌JP2-270(CCTCC NO：M 2018703)，是一株分离自水稻根系的革兰氏阴性生防细菌，对水稻纹枯病具有一定的防治效果。JP2-270属于洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderiacepacia Complex，Bcc)，该菌群是一组表型相近但基因型不同的复合物。伯克霍尔德氏菌通常都具有合成吡咯菌素(pyrrolnitrin)的能力，吡咯菌素表现出很好的抗真菌活性。本发明专利中的伯克霍尔德氏菌也能够产生吡咯菌素。而JP2-270用类似于泰国伯克霍尔德氏菌的遗传操作方法是无法成功实现外源质粒的导入，用普通或者改良的热激法也无法实现高效的遗传转化。为了实现对该菌株基因的编辑，进一步阐明生防菌Burkholderiasp.JP2-270抗真菌的分子机理，我们需要建立一种适合于伯克霍尔德氏菌JP2-270的遗传转化体系。

发明内容

本申请提供了一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用，通过一种高效、快速实现伯克霍尔德氏菌JP2-270遗传物质重组和基因编辑的操作方法，成功获得一个新的LysR家族转录调控基因BysR的框内缺失突变株，该突变株表现出明显降低的抑制纹枯病菌的活性，且JP2-270发酵代谢物中吡咯菌素的合成也受到阻断。

一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白，所述LysR家族转录调控蛋白为BysR蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明又提供了编码所述LysR家族转录调控蛋白的基因。优选的，所述基因命名为bysR基因，基因序列如SEQ ID No.1所示。

本发明又提供了所述的基因在调控吡咯菌素合成中的应用。过表达bysR基因后的伯克霍尔德氏菌抑制纹枯病菌活性明显高于野生型菌株。

优选的，所述的应用，筛选bysR基因高表达的伯克霍尔德氏菌来获得高产吡咯菌素的伯克霍尔德氏菌。

优选的，所述的应用，将bysR基因导入伯克霍尔德氏菌中进行过表达，从而获得高产吡咯菌素的重组伯克霍尔德氏菌。

优选的，所述的应用，将bysR基因序列克隆到表达载体中获得重组表达载体，再将重组表达载体通过电转化法导入伯克霍尔德氏菌感受态细胞中获得重组伯克霍尔德氏菌。

优选的，所述的应用，将重组表达载体通过电转化法导入伯克霍尔德氏菌感受态细胞中的步骤包括：

(1)制备伯克霍尔德氏菌感受态细胞，制备时先将伯克霍尔德氏菌活化培养，然后将培养的伯克霍尔德氏菌使用体积浓度为10％的甘油水溶液洗涤，

(2)将洗涤后的伯克霍尔德氏菌在体积浓度为10％的甘油水溶液保护下液氮冷冻30秒钟，制备得到伯克霍尔德氏菌感受态细胞，

(3)将重组表达载体加入伯克霍尔德氏菌感受态细胞中，然后进行电转化，电转化后进行抗性筛选，获得转入有重组表达载体的伯克霍尔德氏菌。

本发明经筛选得到了一个新的LysR家族转录调控基因BysR的框内缺失突变株，该突变株表现出明显降低的抑制纹枯病菌的活性，且JP2-270发酵代谢物中吡咯菌素的合成也受到阻断，经进一步研究发现了一种调控吡咯菌素合成的LysR家族转录调控基因，所述LysR家族转录调控蛋白为BysR蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，对应基因命名为bysR基因，基因序列如SEQ ID No.1所示。本申请为进一步提高吡咯菌素的生物合成量提供遗传基础。

附图说明

图1为PCR验证bysR成功缺失的突变株检测结果图，其中，M：marker；+：阳性对照，质粒pK18-bysR；-：阴性对照，M 2018703基因组DNA；7-12：随机挑选的6株待检测双交换突变株基因组DNA。其中，泳道11与重组质粒pK18-bysR对照一致，为正确双交换突变株。

图2为化学转化法和改良电转化法克隆效率比较结果图，其中，A：化学转化法；B：改良电转化法。

图3为JP2-270各个衍生菌株抑制纹枯病菌活性检测结果图，其中，WT：JP2-270；ΔbysR：JP2-270ΔbysR；ΔbysR+pBBR2-bysR：JP2-270ΔbysR回补菌株；ΔbysR+pBBR2：JP2-270ΔbysR含空载体对照菌株。

图4为JP2-270及JP2-270ΔbysR发酵产物HPLC分析结果图，其中，WT：JP2-270；ΔbysR：JP2-270ΔbysR；Prn标样：pyrrolnitrin标准品。

图5为JP2-270及ΔbysR中回补bysR基因菌株发酵产物HPLC分析结果图，其中，WT：JP2-270。

图6为JP2-270及JP2-270+pBBR-bysR抑制纹枯病菌活性检测结果图，其中，WT：JP2-270；WT+pBBR-bysR：JP2-270+pBBR-bysR，JP2-270中过表达bysR基因工程菌。

具体实施方式

1.菌株的保藏和培养

伯克霍尔德氏菌JP2-270及其衍生菌株最适生长条件为：Luria-Bertani培养基(LB培养基)，28℃。LB液体培养基配方：胰蛋白胨10克，酵母粉5克，NaCl 10克，蒸馏水1000ml，pH 7.2。常规灭菌后使用。若为固体培养基，在灭菌前向其中添加琼脂15克/升。接一新鲜单克隆JP2-270于3ml LB液体中过夜培养，菌悬浮液保藏于20％甘油中，于-80℃冰箱冻存。每次活化JP2-270均从-80℃冰箱中取出，用无菌接种环挑取适量于LB固体培养基表面划线。

大肠杆菌E.coli DH5α的培养条件为：Luria-Bertani培养基，37℃。E.coli DH5α感受态购于上海碧云天生物技术有限公司。

伯克霍尔德氏菌JP2-270产生pyrrolnitrin培养基：NBY培养基，条件为28℃，震荡培养72小时。

培养基中抗生素使用量为氨苄青霉素100μg/ml，硫酸卡那霉素50μg/ml。抗生素购于上海生工生物科技有限公司。

2.材料

质粒：实验用的质粒有pK18mobsacB，pBBR1MCS-2(本课题组保藏)。

酶：高保真PCR扩增用酶为KOD One PCR Master Mix(KMM-101)购于东洋纺(上海)生物科技有限公司。限制性内切酶Fermentas FastDigest EcoRI和SalI购于Thermo。

引物、测序：引物和测序均由杭州擎科梓熙生物技术有限公司负责完成。

试剂盒：ClonExpress(C112-01)一步法快速克隆试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司。Axygen质粒提取试剂盒(AP-MN-P-250)，Axygen DNA凝胶回收试剂盒(AP-GX-50)。

3.仪器

PCR仪(Bio-rad)，电泳仪(六一)，凝胶成像仪(Bio-rad)，离心机(Eppendorf)，电转仪(Bio-rad)，恒温培养箱(一恒)，超净工作台(苏净)。

4.引物

用到的引物序列如表1所示。

表1引物列表

实施例1

1重组质粒构建

1.1质粒提取

将含有pK18mobsacB质粒的E.coli DH5α菌株划线接种至LB固体平板上(含Km)，于37℃培养箱中培养12h。从平板上挑取单菌落接种至20mL灭菌的LB液体培养基中(含Km)，37℃，200rpm，摇培过夜。然后收集菌体，用质粒提取试剂盒Axygen(AP-MN-P-250)提取质粒，具体操作步骤按说明书操作。

1.2线性化载体制备

提取的pK18mobsacB质粒按照(10×buffer：10μl，质粒：10μl-20μl，酶1(EcoRI)：1μl，酶2(XbaI)：1μl，ddH₂O补足100μl)配制双酶切反应体系，将配制好的酶切反应体系于37℃恒温静置30min进行酶切反应。酶切反应结束后，将酶切反应混合液在0.8％的琼脂糖凝胶电泳上分离，用Axgen DNA胶回收试剂盒(AP-GX-50)对大片段(5.7bp)进行回收，立即使用或于-20℃保存备用。

1.3LysR转录调控蛋白BysR的上下游同源臂基因克隆和纯化

BysR蛋白属于LysR家族转录调控蛋白。我们通过转座子随机突变筛选到一个基因(命名为bysR)，基因克隆和序列比对发现该基因编码的蛋白属于LysR家族转录调控蛋白，但是该基因具体的功能目前没有相关研究报道，其DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。使用在线引物设计软件primer3，根据JP2-270基因组中BysR基因及其上下游序列，设计BysR框内基因缺失引物，为了不引起下游基因的移码突变，上游臂扩增引物反向引物序列的3’端最后一个碱基应位于BysR起始密码ATG开始的3n处(n为自然数，3n代表碱基数量)。同理，下游臂扩增引物正向引物序列的5’端最后一个碱基应位于BysR终止密码子TAA上游3n处。使用引物bysRupF和bysRupR扩增BysR基因上游序列，使用引物bysRdwF和bysRdwR扩增BysR基因下游序列。

PCR反应体系：2×KOD One PCR Master Mix 25μL，正向引物(10mM)：1μL，反向引物(10mM)：1μL，模板0.5μL(约50ng DNA)，ddH₂O补足50μL。

PCR反应程序如下：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸5sec，此过程进行35个循环；之后终延伸10min。

PCR反应结束后，将PCR产物分别经1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，在紫外光下分别切下所扩增的838bp的目的条带，用Axgen DNA xgen DNA胶回收试剂盒(AP-GX-50)进行胶回收处理，纯化后的基因片段(片段BysRup(序列如SEQ ID No.3所示)、BysRdw(序列如SEQ ID No.4所示))可以立即使用或于-20℃保存备用。

1.4重组质粒的构建

根据同源重组的原理，用ClonExpress(C112-01)一步法快速克隆试剂盒，将纯化后的BysRup和BysRdw两个插入片段同时连接至制备的线性化pK18mobsacB载体上。按照说明书配制连接反应体系，将配好的连接反应体系轻轻混匀，37℃反应30min。反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒。之后可将重组产物保存于-20℃备用或直接用于转化。

上述重组反应产物转化E.coli DH5α感受态细胞，采用热激法转化，从转化筛选平板上随机挑取若干单菌落作为模板，以载体上的引物对M13F和M13R进行菌落PCR，验证两个插入片段是否同时插入到线性化的pK18mobSacB载体中。将PCR扩增结果为阳性的单菌落接种至含Km抗生素的LB液体培养基中，于37℃摇床中200rpm培养过夜，提取质粒送测序公司测序，将序列完全正确的克隆定名为pK18-bysR保存进行下一步操作。

2改良快速电转化感受态细胞的制备及转化

(1)从-80℃冰箱中取出JP2-270菌株进行活化培养，在LB固体平板上划线。28℃恒温培养箱中倒置培养48h左右；

(2)挑取单菌落在LB固体平板上划线，28℃过夜培养；

(3)次日，按1％接菌量转接入50ml SOB液体培养基中，继续培养至OD600到0.4-0.6之间；

(4)离心收集沉淀，沉淀用20ml冰预冷的无菌10％甘油溶液(体积浓度)悬浮；

(5)离心收集沉淀，再次用10ml冰预冷的无菌10％甘油溶液(体积浓度)悬浮；

(6)离心去上清，留取约200μl10％甘油溶液溶解沉淀，取50μl加入到冰预冷的1.5mL离心管中，后放入液氮中急速冷冻30秒。然后加入1μL重组载体pK18-BysR，混匀，置于冰上静置10min，然后将其加入预冷的电转杯中，并确定电击杯中无气泡；

(7)将电转化仪(electroporator2510)电压调至1.8kv，电击；

(8)电击后立即加950μL室温SOC培养液至电击杯中，轻轻混匀；

(9)然后转移到一个无菌1.5mL离心管中，在28℃ 100rpm下振荡培养1h，使细胞复苏并表达抗生素抗性。

(10)用1∶100的比例稀释细胞后，取稀释液100μL涂到含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板上，28℃培养48h，以筛选具有卡那霉素抗性的转化子。

此时获得的转化子为单交换突变株，经再次抗性验证后保存进行下一步操作。

3JP2-270同源重组双交换突变株的获得

将上述单交换突变株接种于无抗性LB液体培养基中松弛培养，吸取传6-8代后的菌液100μl，加入到900μl的LB液体培养基中稀释，连续稀释至10^-8，后涂铺于无抗生素的LB平板上。待单克隆长出后，用牙签挑取单克隆同时划线接种于含Km抗性的LB平板和无抗性平板上(两个板上的克隆要一一对应)。28℃培养48h，挑取在Km平板上不生长而无抗性平板上生长的菌落进行菌落PCR验证，引物使用bysRupF/bysRdwR。以重组质粒载体和JP2-270基因组分别为阳性和阴性对照，扩增片段大小与重组质粒载体扩增片段大小一致的为正确的双交换突变株，而扩增片段大小与JP2-270基因组大小一致的为回复突变株(见图1)。获得的双交换突变株定名为JP2-270ΔbysR。

采用常规的接合转移，我们没有成功获得转化子。使用化学转化法，能够将外源质粒转入伯克霍尔德氏菌JP2-270中，但是效率比较低(图2A)，而采用上述改良快速电转化法能够高效地将外源质粒导入JP2-270基因组中，如图2B所示。因此，该方法适合伯克霍尔德氏菌JP2-270的遗传操作。

4JP2-270ΔbysR中bysR基因回补菌株的构建

选择载体pBBR1MCS-2，使用C-bysRF和C-bysRR引物(见表1)扩增bysR完整基因及其上游700bp的区域(含bysR启动子区)，按照上述重组载体的构建方法，构建回补bysR的重组载体pBBR2-bysR，制备JP2-270ΔbysR电转化感受态并转化，得到的含Km抗性的克隆子即为bysR回补成功的菌株。

5JP2-270中过表达bysR基因工程菌构建

操作步骤同4，用改良电转化法将构建得到的pBBR2-bysR质粒转入JP2-270中，得到的含Km抗性的克隆子即为bysR过表达基因工程菌。

6JP2-270ΔbysR与JP2-270表型差异比较

6.1抑制真菌活性差异

对纹枯病菌抑制活性的变化，采用平板对峙双向培养测定法，将活化好的纹枯病菌用打孔器沿菌丝边缘打菌饼，取一菌饼置PDA培养基中间，在两侧等距离处接种供试菌，2-3天观察记录。

JP2-270ΔbysR与JP2-270在抑制纹枯病菌活性方面具有显著差异，表现为JP2-270ΔbysR抗纹枯病菌活性降低，而回补bysR基因能够恢复JP2-270ΔbysR的抗纹枯病菌活性(图3)。

野生型菌株JP2-270和bysR过表达基因工程菌在抑制纹枯病菌活性方面具有明显差异，表型为过表达bysR基因工程菌抑制纹枯病菌活性明显高于野生型菌株(图6)。

6.2次生代谢物合成差异

使用NBY(Nutrient broth yeast extract)对供试菌进行发酵，发酵液采用乙酸乙酯抽提，抽提液进行旋转蒸发，沉淀物用甲醇溶液溶解后进行高效液相色谱分析。色谱条件：安捷伦色谱柱Agilent Zorbax SB-C18，250×9.2mm，5μm，流动相从90％水和10％甲醇开始，30分钟内流动相梯度升至100％甲醇，检测波长220nm左右。

次生代谢物差异比较发现，JP2-270ΔbysR和JP2-270的代谢物谱也具有明显不同，根据标准品pyrrolnitrin的出峰时间，JP2-270ΔbysR在22.2min左右没有峰，而JP2-270和pyrrolnitrin标准品(购自sigma)在22.2min左右有共同的峰(见图4)，表明bysR基因的缺失导致了JP2-270中pyrrolnitrin代谢物合成的阻断，且bysR基因的回补能够恢复JP2-270ΔbysR pyrrolnitrin的合成(见图5，23.3min左右的峰)。

综上所述：我们发明了一种能够高效稳定地将外源质粒转入伯克霍尔德氏菌JP2-270中的遗传转化操作体系，且利用该方法成功敲除了一个新的LysR家族转录调控蛋白BysR，这个新的转录调控蛋白在JP2-270中负责调控pyrrolnitrin的合成，参与JP2-270的抗真菌活性。BysR转录调控蛋白的功能在此之前并未有研究报道，且BysR转录调控蛋白能够调控pyrrolnitrin的合成，这个是首次发现的，具有独创性。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 984

<212> DNA

<213> 伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )

<400> 1

atgaaccaga ttcagaccat gcgtgtattc gtctgcgtcg ccgagcagca gagcttccgg 60

cgcgcagcgc accatctcgg cgtgtccaat gcgctcgtca cacgttcgat cgcgatgctc 120

gagggtcacc tgaacacacg gctgatccac cgcaccacgc gcaacctgtc gctcaccgag 180

gccggcgtgc gctacctcga cggttgccgc gcgctgctcg aggaattcga ccacctcgag 240

tcgtccgtcg cgcatgccgt gcgcgaaccg gccggcacgc tgcgcgtcgt cgcgtcgggc 300

ctgctgtcgc cgctcgcgct gacgccgctc gtcagcagct tccggcaccg ctaccccgag 360

ctgcgcgtgc agctgaccgt cgccgacggg ccgctcgacg tgctcgaatc gggctacgac 420

gtcggtatcg tcacgggcaa ccggctcgac ggcaacccga cgctgatcgg ccatgcgctc 480

gcgccgaacc cgttcgtcgc atgcgcggcg ccggcctatc tcgaccggcg cggcgagccg 540

cgcgcacccg acgacctgcc gggccacgac tgggtcacgc tcgcgccgca ccagcatgcg 600

cccgcgtggc agctggtcgg ccacgacggc gtcgcgcatt cggtcacggt gcgcccggcc 660

tgcacgctca accagctcgc gctcgtgcag gcggccgcca ttgccggcgc cggcatcgcg 720

gtgctgcccg agccgtgcgt cgccgacgcg ctcaacagcg gcacgctcgt gcggctgctg 780

cccggctacc ggatcgacga cccggacgcg cagctgtcgc tcgtctatcc gaaccgccag 840

tacgtgccgg cccgcacgcg cagcttcgtc gagcacgcgc tcgaccactt cagcgagcag 900

acggcccgcg agcggaagga ttacggcttc ctgcgtccgt cgcgcggccc cgaccgctcc 960

gacatcgtca cgggcctgca gtaa 984

<210> 2

<211> 327

<212> PRT

<213> 伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )

<400> 2

Met Asn Gln Ile Gln Thr Met Arg Val Phe Val Cys Val Ala Glu Gln

1 5 10 15

Gln Ser Phe Arg Arg Ala Ala His His Leu Gly Val Ser Asn Ala Leu

20 25 30

Val Thr Arg Ser Ile Ala Met Leu Glu Gly His Leu Asn Thr Arg Leu

35 40 45

Ile His Arg Thr Thr Arg Asn Leu Ser Leu Thr Glu Ala Gly Val Arg

50 55 60

Tyr Leu Asp Gly Cys Arg Ala Leu Leu Glu Glu Phe Asp His Leu Glu

65 70 75 80

Ser Ser Val Ala His Ala Val Arg Glu Pro Ala Gly Thr Leu Arg Val

85 90 95

Val Ala Ser Gly Leu Leu Ser Pro Leu Ala Leu Thr Pro Leu Val Ser

100 105 110

Ser Phe Arg His Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Val Gln Leu Thr Val Ala

115 120 125

Asp Gly Pro Leu Asp Val Leu Glu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Ile Val

130 135 140

Thr Gly Asn Arg Leu Asp Gly Asn Pro Thr Leu Ile Gly His Ala Leu

145 150 155 160

Ala Pro Asn Pro Phe Val Ala Cys Ala Ala Pro Ala Tyr Leu Asp Arg

165 170 175

Arg Gly Glu Pro Arg Ala Pro Asp Asp Leu Pro Gly His Asp Trp Val

180 185 190

Thr Leu Ala Pro His Gln His Ala Pro Ala Trp Gln Leu Val Gly His

195 200 205

Asp Gly Val Ala His Ser Val Thr Val Arg Pro Ala Cys Thr Leu Asn

210 215 220

Gln Leu Ala Leu Val Gln Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ala Gly Ile Ala

225 230 235 240

Val Leu Pro Glu Pro Cys Val Ala Asp Ala Leu Asn Ser Gly Thr Leu

245 250 255

Val Arg Leu Leu Pro Gly Tyr Arg Ile Asp Asp Pro Asp Ala Gln Leu

260 265 270

Ser Leu Val Tyr Pro Asn Arg Gln Tyr Val Pro Ala Arg Thr Arg Ser

275 280 285

Phe Val Glu His Ala Leu Asp His Phe Ser Glu Gln Thr Ala Arg Glu

290 295 300

Arg Lys Asp Tyr Gly Phe Leu Arg Pro Ser Arg Gly Pro Asp Arg Ser

305 310 315 320

Asp Ile Val Thr Gly Leu Gln

325

<210> 3

<211> 850

<212> DNA

<213> 伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )

<400> 3

atcatcagca gcggttcttc gggcaggatc gcgtcgagcg gcacgacgac gggacaggga 60

atcggcgagt aatcgatgga catggctggc aataggtgag gaagggaaat acacggacgc 120

ccgccaaacc aactgcatgg cgaactgatc gatcattccg cgttccgcgg cctcgcgcaa 180

gaggcacgcg cggccggaca gcgcgacggt ggcccggtcg ccggaccggg ccagccggcc 240

gcccaggcat cgcgcgccgg cgttccggat tggaatggca ttgccggccg gttgcgaaac 300

ggttccatgc gcgcgatttt ctccgccaat atcgccgtgt ttcatcgatg ccgacggttc 360

agcgcgactt gcgtatcgaa cggaatagac cggatgttcg ataaaaatcg ccgcgcggaa 420

tgcgatacgc aaaatccgcg cacgggtaaa aacatccatt attgcagcat gtattagggc 480

gcgattcccc aatttaccgg agcaaatctg accgaatcac gaacaaccaa ttgattaaca 540

tacgaattat tcgccgccac gatgcatatt ccaataccct gccgcctttg aacggcaggc 600

acgcgggaca gcccgacatt taaccggtac tcgcgatttc gattttccgc aacccgcccg 660

ttttctcagg ttgacggata tcgcaactgt atttaacaat cgtctgcgga atcgaaaaac 720

gatttttcga tacgagggag aactgggtgc cgtgcgatgc gtttcgaggt tgcgcggcga 780

aaaatcacaa ccataatcaa tcaaccgggc cagaaataca caagccatga accagattca 840

gaccatgcgt 850

<210> 4

<211> 1012

<212> DNA

<213> 伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )

<400> 4

gtctatccga accgccagta cgtgccggcc cgcacgcgca gcttcgtcga gcacgcgctc 60

gaccacttca gcgagcagac ggcccgcgag cggaaggatt acggcttcct gcgtccgtcg 120

cgcggccccg accgctccga catcgtcacg ggcctgcagt aaactgcgcg cgtcagccat 180

cggaggtgca gcgtgcgcgt gatcctgttc agcagccggc agtacgacga cgattcgttt 240

accgccgcca accggcagtt cggctatcgg ctgcacttcc agccgtcgca cctcgacgcg 300

gaaaccgcga tcctcgcgca cggctatgac gtcgtctgcc cgttcgtcaa cgacaccgtc 360

gacgcagccg tgctcgaacg gctggcggac ggcggcacgc gtctgatcgc gctgcgctcg 420

gcgggcttca accacgtcga cctggccgcc gccgagcggc tcggcatcgc ggtcgtgcgc 480

gtgcccgcgt attcgccgca cgcggtcgcc gagcacgcgg tcgcgctgat cctcgcgctc 540

aaccgccgcc tgccgcgtgc cgtcgcgcgc acccgcgaag gcgacttctc gctgaacggc 600

ctgctcggct tcgacctgca cggcaagacc gtcggcgtga tcggcaccgg catcatcggc 660

agcgtgttcg cgaagatcat gatgggattc gggatgcatg tgctcgcgca ctcggtgccg 720

ccgtacaacg acgagctgat cgcgttcggt gcgcgctatg tcgagctcga cgcgttgctg 780

caccaggccg acatcgtcag cctgcactgt ccgttgctgc cgtcgacgca ccatctgatc 840

aacgcgcaga cgctcgcgcg gatgaagcac ggcgcgatgc tgatcaacac cggccgcggc 900

ggcctcgtcg atgcgcaggc gctgatcgac gcgctcaaga gcggccagct cggccatctc 960

gggctcgacg tgtacgagga ggaaagcggg ctcttcttcg aggatcactc cg 1012

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctatgacatg attacgaatt catcatcagc agcggttctt cg 42

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcggataga cacgcatggt ctgaatctgg ttc 33

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accatgcgtg tctatccgaa ccgccagtac g 31

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caggtcgact ctagaggatc ccggagtgat cctcgaagaa gag 43

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaagggaaat acacggacgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtttactgc aggcccgtga 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agcggataac aatttcacac agga 24

Claims (8)

1.一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白，其特征在于，所述LysR家族转录调控蛋白为BysR蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码如权利要求1所述LysR家族转录调控蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因为bysR基因，基因序列如SEQ IDNo.1所示。

4.如权利要求3所述的基因在调控吡咯菌素合成中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，筛选bysR基因高表达的伯克霍尔德氏菌来获得高产吡咯菌素的伯克霍尔德氏菌。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将bysR基因导入伯克霍尔德氏菌中进行过表达，从而获得高产吡咯菌素的重组伯克霍尔德氏菌。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，将bysR基因序列克隆到表达载体中获得重组表达载体，再将重组表达载体通过电转化法导入伯克霍尔德氏菌感受态细胞中获得重组伯克霍尔德氏菌。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将重组表达载体通过电转化法导入伯克霍尔德氏菌感受态细胞中的步骤包括：

(1)制备伯克霍尔德氏菌感受态细胞，制备时先将伯克霍尔德氏菌活化培养，然后将培养的伯克霍尔德氏菌使用体积浓度为10％的甘油水溶液洗涤，

(2)将洗涤后的伯克霍尔德氏菌在体积浓度为10％的甘油水溶液保护下液氮冷冻30秒钟，制备得到伯克霍尔德氏菌感受态细胞，

(3)将重组表达载体加入伯克霍尔德氏菌感受态细胞中，然后进行电转化，电转化后进行抗性筛选，获得转入有重组表达载体的伯克霍尔德氏菌。

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