CN114058633B

CN114058633B - 水解酶基因strH及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN114058633B
Application number: CN202010777275.1A
Authority: CN
Inventors: 洪青; 姜万奎; 高琴琴; 邱吉国; 闫新; 何健; 朱建春; 蒋建东
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-08-05
Filing date: 2020-08-05
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2040-08-05
Also published as: CN114058633A

Abstract

本发明公开了水解酶基因strH及其编码的蛋白和应用。本发明水解酶基因strH全长为1713bp，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物水解酶StrH含570个氨基酸，序列为SEQ ID NO.2。TriH能降解肟菌酯杀菌剂。水解酶StrH可用于降解土壤、水体中甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂的残留，具有非常重要的理论和应用价值。

Description

水解酶基因strH及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及水解酶基因strH及其编码的蛋白和应用，具体涉及降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂水解酶基因strH和其应用。

背景技术

甲氧基丙烯酸酯类(strobilurins)杀真菌剂是以天然化合物strobilurin A为先导化合物开发的一类新型杀真菌剂，对真菌(担子菌纲、子囊菌纲、卵菌纲和半知菌纲等)引起的病害均具有较好的活性，适用于防治大豆、谷物、马铃薯、蔬菜和果树等多种作物的病害。其具有广谱、高效、作用机制独特等优点，使其上市以年来发展迅速，在2009年成为全球销售量最大的一类杀菌剂。肟菌酯，啶氧菌酯，吡唑醚菌酯，嘧菌酯是甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂的代表且被广泛使用的种类，主要用于防治作物、蔬菜和水果等农产品的真菌病害。

获得甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂(肟菌酯，啶氧菌酯，吡唑醚菌酯，嘧菌酯)降解菌株和降解基因在治理环境中的氧基丙烯酸酯类杀真菌剂残留有以下作用：(1)用于土壤、水体中甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂残留的消除；(2)通过基因研究构建基因工程菌株，进而研究酶学特性，对氧基丙烯酸酯类杀真菌剂污染修复具有重要意义。因此降解基因在消除该甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂残留具有非常重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂水解酶基因strH。

本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白。

本发明的又一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一个水解酶基因strH，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

通过鸟枪法构建DNA文库的方法来寻找目的基因。首先采用高盐法提取菌株DY-1的基因组总DNA，用Sau3AI(TaKaRa)限制性内切酶部分酶切总DNA，回收1-6kb的酶切片段。回收片段与载体pUC118 BamHI/BAP用T₄连接酶16℃酶连，转化至高效感受态细胞E.coliDH5α中。通过平板影印从15,000个转化子中得到一个在含有100mg/L肟菌酯的LB平板上产生透明水解圈的阳性转化子。提质粒送于金斯瑞生物科技公司对其外源插入片段进行测序，氨基酸序列比对分析得到一水解酶基因strH。所述的水解酶基因strH编码的蛋白StrH，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

含有所述的水解酶基因strH的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选将所述的水解酶基因strH连接pET29a(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。

含有所述的水解酶基因strH的基因工程菌，所述的基因工程菌株优选以E.coliBL21(DE3)为出发菌株。

所述水解酶基因strH在降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂的应用；所述的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯。

所述的含有水解酶基因strH的重组表达载体在降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂中的应用；所述的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯。

所述水解酶蛋白StrH在降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂中的应用；所述的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯。

所述水解酶蛋白StrH在去除土壤、水体中甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂中的应用；所述的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯。

甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂降解菌株生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)DY-1，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏时间为2020年6月9号，保藏编号为：CCTCCNO:M2020190。

本发明所述的解菌株生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)DY-1在降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂中的应用；所述的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯。

本发明的有益效果如下：

1.本发明分离到一株Hyphomicrobium sp.DY-1液相质谱结果表明菌株DY-1降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为相应的母体酸。在此基础上，本发明用鸟枪法建库的方法成功从菌株DY-1中克隆出水解酶基因strH。在NCBI(the UniProtKnowledge Base/SwissProtdatabases)中进行blastp在线氨基酸序列分析和同源性比较，发现该基因为一个新基因，全长(从起始密码子到终止密码子)全长1713bp，可编码571个氨基酸。

2.本发明提供的水解酶基因strH能在1h内完全降解100mg/L的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂，此外strH还可用于构建降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂的基因工程菌株，用于去除土壤、水体中的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂残留，具有非常重要的理论和应用价值。

附图说明

图1菌株DY-1对肟菌酯，啶氧菌酯，吡唑醚菌酯，嘧菌酯的降解。

图2水解酶基因strH克隆的策略图。

图3水解酶基因strH在BL21(pET29a(+))中表达策略图。

图4水解酶StrH蛋白电泳图谱；

泳道M为蛋白质marker，泳道1为纯化的水解酶StrH蛋白。

图5水解酶StrH催化的降解肟菌酯的HPLC图谱及代谢产物MS图谱；

A：肟菌酯标准品及催化反应体系的液相图；B：肟菌酯MS图谱；C:肟菌酸的MS图谱。

图6水解酶StrH催化的降解啶氧菌酯的HPLC图谱及代谢产物MS图谱；

A：啶氧菌酯标准品及催化反应体系的液相图；B：啶氧菌酯MS图谱；C:啶氧菌酸的MS图谱。

图7水解酶StrH催化的降解吡唑醚菌酯的HPLC图谱及代谢产物MS图谱；

A：吡唑醚菌酯标准品及催化反应体系的液相图；B：吡唑醚菌酯MS图谱；C:吡唑醚菌酸的MS图谱。

图8水解酶StrH催化的降解嘧菌酯的HPLC图谱及代谢产物MS图谱；A：嘧菌酯标准品及催化反应体系的液相图；B：嘧菌酯MS图谱；C:嘧菌酸的MS图谱。

生物材料保藏信息

DY-1，分类命名为Hyphomicrobium sp.DY-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏时间为2019年6月9号，保藏编号为：CCTCCNO:M2020190。

具体实施方式

实施例1肟菌酯解菌株DY-1的分离筛选

1.1肟菌酯解菌株DY-1的富集驯化分离

土壤样品采自安徽省生产肟菌酯农药厂的废水处理池，经富集驯化来筛选肟菌酯降解菌株。取5.0g污泥样品加到含50mg/L肟菌酯的100mL MSM培养基中，放置在30℃、160rpm的摇床中培养7天。然后将5mL的富集液转接至新鲜的含50mg/L肟菌酯的100mL MSM培养基中，经连续3次转接。

MSM培养基配方(MSM)：1.5g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g KH₂PO₄，1.0gNH₄NO₃，0.5gNaCl，0.2g MgSO₄·7H₂O，加去离子水定容至1L。固体培养基中每升加入15.0g琼脂。

1.2降解菌株的纯化、筛选和鉴定

利用高效液相色谱仪检测第三次转接的富集液中肟菌酯的残留量以及是否生成新的代谢产物。对有降解效果的富集液进行梯度稀释，取10^-3至10^-6梯度稀释液各0.1ml，分别涂布于加有100mg/L肟菌酯的基础盐固体培养基上，30℃培养7天。挑取平板上的单菌落，进一步划线纯化，将得到的纯化单菌接种于加有100mg/L肟菌酯的MSM液体培养基中，30℃，180rpm/min培养3天，后验证各单菌落是否有肟菌酯降解功能。

通过富集驯化分离筛选得到一株肟菌酯降解菌，命名为DY-1。菌株DY-1在R2A固体平板上生长4天后，菌落呈乳白色、圆形、边缘整齐、表面凸起；菌株DY-1为革兰氏阴性细菌，电镜图显示该菌株为卵圆形，有鞭毛。菌株DY-1脲酶为阳性，脂肪酶、磷酸酶、α-葡糖苷酶和半乳糖苷酶为阴性。

16S rRNA基因序列系统发育分析：以菌株的总DNA为模板，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，正向引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为5′-TACCTTGTTACGACT T-3′。50μL PCR反应体系为：模板1.0μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，引物((25μM)各1.0μL，10×Taq缓冲液5.0μL，Mg²⁺(25mM)4.0μL，Taq酶(5.0U/L)0.5μL，超纯水33.5μL。聚合酶链式反应条件：95℃预变性5min；94℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，循环30次；72℃延伸10min。3.0μL PCR产物于0.75％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，PCR产物用回收试剂盒(Axygen公司)进行切胶回收，TA克隆后送于南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序。测序后获得的16S rRNA基因序列在EzTaxon-e server进行同源性比对，菌株DY-1与Hyphomicrobium.facile subsp.facile ATCC 27485^T(Genebank登录号为Y14309)的序列相似性为99.14％。另外，结合菌株的形态学和生理生化特征将DY-1鉴定为生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为保藏编号为CCTCC NO:M2020190。

1.3降解菌株DY-1的降解特性及降解产物分析

降解特性的研究：将DY-1接种至含有0.5％的甲醇的R2A液体培养基中，30℃培养至对数中期，低速离心收集菌体，菌体用新鲜、无菌基础盐培养基洗涤2遍，重悬于基础盐培养基中，调节细胞浓度约为1.0×10⁹cfu/ml，按2％(v/v)接种量，接种到100ml，含0.15mM甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂(肟菌酯，啶氧菌酯，吡唑醚菌酯，嘧菌酯)的基础盐培养基中，30℃培养，定时取样测定菌株的降解曲线。

定时取培养液样品1mL，加等体积的乙腈，12000rpm/s离心2min，用0.22μm有机相滤器过滤，处理好的样品用高效液相色谱(HPLC)进行检测农药甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂(肟菌酯，啶氧菌酯，吡唑醚菌酯，嘧菌酯)的含量。高效液相色谱条件：色谱分离柱为Kromasil 100-5C₁₈反相柱(4.6mm×250mm×5μm)；柱温40℃；乙腈/水/乙酸(75:25:0.5,v/v/v)为流动相，流速为1.0mL/min；紫外检测波长为220nm；进样量20μL。

实验结果表明菌株DY-1能够降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂肟菌酯，啶氧菌酯，吡唑醚菌酯，嘧菌酯(图1)。

实施例2甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂水解酶基因的克隆及功能验证(策略图见图2)

2.1细菌基因组总DNA的测序分析

2.1.1细菌基因组总DNA的提取

菌株DY-1基因组总DNA采用高盐结合CTAB法进行提取，基因组总DNA溶于TE缓冲液(pH 8.0)，-20℃保存。

2.1.2基因组总DNA的Sau3AI酶切与片段回收

用Sau3AI(TaKaRa)限制性内切酶部分酶切总DNA，DNA浓度为100μg·μL^-1，50μL酶切反应体系如下：

通过调整酶的反应时间，把总DNA完全切成弥散的条带。回收1-6kb的酶切片段。

2.1.3酶连及转化与阳性克隆的筛选

以pUC118 BamHI/BAP为克隆载体(TaKaRa，BamHI酶切，碱性磷酸酶(BAP)去磷酸化处理)。10μL酶连体系如下：

转化步骤：

(1)取100mL高效感受态细胞E.coli DH5α，置于冰上；

(2)取10μL酶连产物加入E.coli DH5α中，缓慢混匀，置于冰上冰浴30min，放置42℃水浴锅中热激60s，立即置冰上5min；

(3)加入500μL LB液体培养基，放置于37℃恒温摇床，180rpm温育45min；

(4)4,500rpm离心2min，弃上清，留约100μL液体重悬菌体，涂布在含有100mg L^- ¹Amp的LB培养基平板上，倒置于37℃培养10h；

(5)采用影印平板法分别挑取单菌落转移至含0.24mM肟菌酯LB固体平板上，37℃倒置培养12h，再将平板至于10℃培养48h；

(6)产生透明水解圈的克隆子，即为肟菌酯降解基因的阳性克隆子，作为后续实验研究对象。

2.1.4测序及基因序列分析

从约15,000个转化子中获得1个阳性克隆子E.coli pT1，对其外源插入片段进行测序。

用BioEdit、Omiga等软件分析核酸和氨基酸序列。

在线分析网站：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/核酸、蛋白序列集成的数据库。

2.1.5阳性克隆对肟菌酯的降解检测

采用静息细胞法进一步验证阳性克隆子E.coli pT1对肟菌酯的降解效果，并通过HPL分析鉴定其降解能力。试验表明阳性克隆子E.coli pT1具有肟菌酯降解能力。

2.1.6阳性克隆子测序和ORF分析

提取转化子质粒命名为pT1，测其外源插入片段序列。测得大小为3,879bp。经过ORF比对分析发现在3,879bp的插入片段上含有一个1,713bp的酯酶基因命名为strH。strH基因编码570个氨基酸，蛋白分子量为60.7kDa，基因strH的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，编码的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。

实施例3水解酶基因strH的异源表达及验证(策略图见图3)

3.1甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂水解酶基因strH的特异性扩增

设计strH基因的特异性同源重组引物strH-F：5′-AAGAAGGAGATATACATATGATGCAAAGTATCTTCAATCTCGGC-3′(SEQ ID NO.3，下划线碱基为NdeI酶切位点)，strH-R：5′-GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCACTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGTAGCCTGCAACCGGATC-3′(SEQ ID NO.4，下划线碱基为XhoI酶切位点)(strH基因3’端携带编码Strep II标签的核苷酸序列TGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAG)，以菌株DY-1的基因组DNA为模板进行特异性扩增。

特异性扩增反应体系(50μL)：

所用程序如下：

3.2质粒pET29a的双酶切

对质粒pET29a进行NdeI和XhoI双酶切，酶切体系如下：

于37℃水浴酶切过夜，3.0μL产物用0.75％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，剩余用Axygen公司的回收试剂盒进行割胶回收。

3.3表达菌株的构建及验证

于冰水域中配制如下反应体系(10μL)：

混匀后，在37℃水浴30min，但反应完成后立即置于冰水浴中冷却5min，将同源重组产物转入大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中。挑取转化子至50mg/L Km的3mL LB试管中37℃、180rpm摇床培养，提取质粒获得阳性转化子，分别进行PCR验证和送往金斯瑞生物科技有限公司进行测序，验证插入质粒pET29a的DNA片段序列是否正确，将获得的阳性克隆含有pET29a-strH的E.coli BL21(DE3)表达菌株命名为E.coli BL21(DE3)-strH。

3.4表达载体的诱导表达、纯化

重组表达菌株E.coli BL21(DE3)-strH在100mL LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD600为0.6～0.8时，加入0.15mM IPTG，16℃诱导培养8h；4℃、12000rpm离心5min，收集菌体，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)重悬菌体，超声破碎5min，离心，收集上清，用0.22μm的水相滤器过滤去除菌体与破碎残渣，即获得菌株E.coli BL21(DE3)-strH的粗酶液，可用Strep-Tactin琼脂糖凝胶FF进行纯化目的蛋白，收集洗脱液，在4℃、20mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中用透析袋(截留分子量10kDa)透析过夜。SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化效果，条带大小和理论预测的大小(60.7kDa)相一致(图4)

3.5StrH活力测定

酶活反应体系：20mM Tris-HCl(pH 7.4)，50mg/L甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂(肟菌酯，啶氧菌酯，吡唑醚菌酯，嘧菌酯)，反应酶量100μL，30℃反应20min。每个反应以加入酶开始计时，反应结束后加入等体积乙腈终止反应，用HPLC测肟菌酯的降解情况。酶活力单位(U)定义：本实验中1个酶活单位(U)定义为：在30℃条件下，每秒钟减少1μmol肟菌酯所需的酶量(mg)。酶学试验表明StrH对肟菌酯的比酶活为11.5U/mg，StrH对啶氧菌酯的比酶活为2.5U/mg，StrH对吡唑醚菌酯的比酶活为2.1U/mg，StrH对嘧菌酯的比酶活为0.32U/mg。

3.6代谢产物的确定

酶促反应后的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂(肟菌酯，啶氧菌酯，吡唑醚菌酯，嘧菌酯)降解产物采用HPLC-MS技术进行检测和鉴定分析。HPLC色谱条件：色谱分离柱为Kromasil 100-5C18反相柱(4.6mm×250mm×5μm)；柱温40℃；乙腈/水/乙酸(75:25:0.5,v/v/v)为流动相，流速为1.0mL/min；紫外检测波长为220nm；进样量20μL。LTQ Orbitrap XL质谱分析仪(Thermo Fisher Scientific)MS分析离子源为ESI，正离子检测模式。液质检测数据用Xcalibur软件处理分析。

HPLC-MSS检测结果分析指出StrH能水解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂(肟菌酯，啶氧菌酯，吡唑醚菌酯，嘧菌酯)，HPLC图谱上显示有水解产物生产，MS结果分析鉴定产物为甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂对应的母体酸(图5-图8)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 水解酶基因strH及其编码的蛋白和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1713

<212> DNA

<213> 生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)

<400> 1

atgcaaagta tcttcaatct cggcgctcga catagttcgt tgcgccaaag tcttcttgcg 60

tgttcaatgc ttgcagcagg actagcgata actcccgcaa ttgcccaaaa caacaacgac 120

aatagcggac cgaccgtcaa gacgaccgat ggaaagatac gcggatacac aaaggatggc 180

gtcaatatct tcctgggcat tccgtatgcc gctccgcccg tcggcaatct gcgctggcag 240

ccgccgcaac cagtcaaacg ctggaaaggc caactcgacg ccacgcacta tgcgaacacg 300

tgtccgcagg taacgaccct cggcgcattt gcaggtccga cgagtgcgaa cgaagactgc 360

ctttatctca acgtcttcac taccaacaag aataacaaca aaaagaagcc ggtcatcgtc 420

tggattcatg gcggtggaaa tttcgatggc gagtcgagcg actacgatgg cagcaagctg 480

gcgaccggcg gcccgaacgg taccccgacc gtcgttgtga cgatgaacta ccgcctaggc 540

ctgtttggct ttttttcaca ccctgcgata aataaggaag gccatctctg gggcaactac 600

ggcatcctcg atcagcaagc tgtgcttcgc tgggttcagc gcaacatttc agcgttcggt 660

ggtgatccgt cccgtgttgc gttgggcggc caatctgcag gcgcgctcga taccggactc 720

aacttgcttt cgccgttgag caatggcctg ttcaaccgag ccatcgcgca gagttcacca 780

gcatttttcg acacagccat tccagcagcc accgcgtcga gcaccggcaa gaactttgcg 840

actgcggccg gatgcaaggg atctgatgcg gccgccgcaa aatgcctgcg cgatctcaca 900

gcggcgcgca ttctgcaatt gcaaggcacg cccaacgcga acagtgcttt catcagttta 960

gcaattgccg atggcacaat catcccgacc aatccggcgc aagccttggc agccggcagg 1020

ttcaacaaga tgcccgtcat gggaggcgcg accaaagacg agggcacgtt ctttacaggt 1080

attactgaat atttctccgg cccgcctcag tcgccgatga tagcggatca gtatgcagcg 1140

gcgatcgcac aaggagcgct ttctcctttc cttggaacgc catttccggc cggaactgca 1200

gatcagtacc cgctctccaa ctatggcggc gatccgatgg ccgcttacga cagagcgacg 1260

acggatccga tcaagtgcaa ggatctccac gttctacaga cattggcgtc gcaggtgccg 1320

acctacgcct acgatttcac ctatcagaac agcccttact acttcccgaa gatgccgggc 1380

ttcaaaggtc tggcagcaca cacgattgac atccagttct tgttcaacaa ctggcatggc 1440

ggacaactcg gcgtgaatct cgaccaggag acgggtcagc cacgagagtt aaataacaag 1500

gaaacgaaac tatccgatca gctcgttgcc gcgtggacta acttcgcgaa gagcggcaat 1560

ccgaatggct cggggaattc accctggcca aagttcggcg ccggcaacag cgcgaagtac 1620

ttcgtccagg acatacctct ctcgacgacg actgtctcgc agtacagaag cgagtacaaa 1680

tgtgatttct gggatccggt tgcaggctac tga 1713

<210> 2

<211> 570

<212> PRT

<213> 生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)

<400> 2

Met Gln Ser Ile Phe Asn Leu Gly Ala Arg His Ser Ser Leu Arg Gln

1 5 10 15

Ser Leu Leu Ala Cys Ser Met Leu Ala Ala Gly Leu Ala Ile Thr Pro

20 25 30

Ala Ile Ala Gln Asn Asn Asn Asp Asn Ser Gly Pro Thr Val Lys Thr

35 40 45

Thr Asp Gly Lys Ile Arg Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Val Asn Ile Phe

50 55 60

Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Val Gly Asn Leu Arg Trp Gln

65 70 75 80

Pro Pro Gln Pro Val Lys Arg Trp Lys Gly Gln Leu Asp Ala Thr His

85 90 95

Tyr Ala Asn Thr Cys Pro Gln Val Thr Thr Leu Gly Ala Phe Ala Gly

100 105 110

Pro Thr Ser Ala Asn Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Phe Thr Thr

115 120 125

Asn Lys Asn Asn Asn Lys Lys Lys Pro Val Ile Val Trp Ile His Gly

130 135 140

Gly Gly Asn Phe Asp Gly Glu Ser Ser Asp Tyr Asp Gly Ser Lys Leu

145 150 155 160

Ala Thr Gly Gly Pro Asn Gly Thr Pro Thr Val Val Val Thr Met Asn

165 170 175

Tyr Arg Leu Gly Leu Phe Gly Phe Phe Ser His Pro Ala Ile Asn Lys

180 185 190

Glu Gly His Leu Trp Gly Asn Tyr Gly Ile Leu Asp Gln Gln Ala Val

195 200 205

Leu Arg Trp Val Gln Arg Asn Ile Ser Ala Phe Gly Gly Asp Pro Ser

210 215 220

Arg Val Ala Leu Gly Gly Gln Ser Ala Gly Ala Leu Asp Thr Gly Leu

225 230 235 240

Asn Leu Leu Ser Pro Leu Ser Asn Gly Leu Phe Asn Arg Ala Ile Ala

245 250 255

Gln Ser Ser Pro Ala Phe Phe Asp Thr Ala Ile Pro Ala Ala Thr Ala

260 265 270

Ser Ser Thr Gly Lys Asn Phe Ala Thr Ala Ala Gly Cys Lys Gly Ser

275 280 285

Asp Ala Ala Ala Ala Lys Cys Leu Arg Asp Leu Thr Ala Ala Arg Ile

290 295 300

Leu Gln Leu Gln Gly Thr Pro Asn Ala Asn Ser Ala Phe Ile Ser Leu

305 310 315 320

Ala Ile Ala Asp Gly Thr Ile Ile Pro Thr Asn Pro Ala Gln Ala Leu

325 330 335

Ala Ala Gly Arg Phe Asn Lys Met Pro Val Met Gly Gly Ala Thr Lys

340 345 350

Asp Glu Gly Thr Phe Phe Thr Gly Ile Thr Glu Tyr Phe Ser Gly Pro

355 360 365

Pro Gln Ser Pro Met Ile Ala Asp Gln Tyr Ala Ala Ala Ile Ala Gln

370 375 380

Gly Ala Leu Ser Pro Phe Leu Gly Thr Pro Phe Pro Ala Gly Thr Ala

385 390 395 400

Asp Gln Tyr Pro Leu Ser Asn Tyr Gly Gly Asp Pro Met Ala Ala Tyr

405 410 415

Asp Arg Ala Thr Thr Asp Pro Ile Lys Cys Lys Asp Leu His Val Leu

420 425 430

Gln Thr Leu Ala Ser Gln Val Pro Thr Tyr Ala Tyr Asp Phe Thr Tyr

435 440 445

Gln Asn Ser Pro Tyr Tyr Phe Pro Lys Met Pro Gly Phe Lys Gly Leu

450 455 460

Ala Ala His Thr Ile Asp Ile Gln Phe Leu Phe Asn Asn Trp His Gly

465 470 475 480

Gly Gln Leu Gly Val Asn Leu Asp Gln Glu Thr Gly Gln Pro Arg Glu

485 490 495

Leu Asn Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ser Asp Gln Leu Val Ala Ala Trp

500 505 510

Thr Asn Phe Ala Lys Ser Gly Asn Pro Asn Gly Ser Gly Asn Ser Pro

515 520 525

Trp Pro Lys Phe Gly Ala Gly Asn Ser Ala Lys Tyr Phe Val Gln Asp

530 535 540

Ile Pro Leu Ser Thr Thr Thr Val Ser Gln Tyr Arg Ser Glu Tyr Lys

545 550 555 560

Cys Asp Phe Trp Asp Pro Val Ala Gly Tyr

565 570

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagaaggaga tatacatatg atgcaaagta tcttcaatct cggc 44

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggtggtg gtgctcgagt cacttttcga actgcgggtg gctccagtag cctgcaaccg 60

gatc 64

Claims

1.一种水解酶基因strH，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的水解酶基因strH编码的蛋白质StrH，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.含有权利要求1所述的水解酶基因strH的重组表达载体。

4.含有权利要求1所述的水解酶基因strH的基因工程菌。

5.权利要求1所述水解酶基因strH在降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂中的应用；所述的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯。

6.权利要求2所述水解酶蛋白StrH在降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂中的应用；所述的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯。

7.权利要求2所述的水解酶蛋白StrH在去除土壤、水体中甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂中的应用；所述的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯。

8.权利要求3所述的含有水解酶基因strH的重组表达载体在降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂中的应用；所述的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯。

9.肟菌酯降解菌株Hyphomicrobium sp.DY-1，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏时间为2020年6月9号，保藏编号为：CCTCC NO:M2020190。

10.权利要求9所述的肟菌酯降解菌株Hyphomicrobium sp.DY-1在降解甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂中的应用；所述的甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂为肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯或嘧菌酯。