CN111139255B

CN111139255B - 一种敌稗酰胺酶基因pamD及其编码蛋白质和应用

Info

Publication number: CN111139255B
Application number: CN201811317633.XA
Authority: CN
Inventors: 黄星; 於蝶; 卢家森; 成明根; 朱建春; 洪青; 何健; 蒋建东; 李顺鹏
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-11-06
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2038-11-06
Also published as: CN111139255A

Abstract

本发明公开了一种敌稗酰胺酶基因pamD及其编码蛋白质和应用，该基因pamD的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，该基因pamD编码的酰胺酶PamD的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明克隆到一种敌稗酰胺酶基因pamD，该基因为一种酰胺类除草剂敌稗酰胺酶基因，全长为1218bp，编码406个氨基酸；本发明敌稗酰胺酶基因pamD编码的酰胺酶PamD能够在不添加辅酶因子的条件下将敌稗结构式中的酰胺键断裂降解和转化敌稗，该敌稗酰胺酶PamD以及含有敌稗酰胺酶基因pamD的基因工程菌可用于污染农田和环境水体中酰胺类除草剂敌稗残留的降解和生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。

Description

一种敌稗酰胺酶基因pamD及其编码蛋白质和应用

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，具体涉及酰胺类除草剂敌稗酰胺酶基因pamD及其编码蛋白质和应用。

背景技术

敌稗(Propanil)，中文别名：3,4-二氯-N-丙酰苯胺，CAS号为709-98-8，是一种具有高度选择性的触杀型除草剂。主要用于秧田或直播田，在水稻体内被芳基羧基酰胺酶分解成3,4-二氯苯胺和丙酸而解毒。稗草等敏感植物由于缺乏这种解毒机能，导致水分代谢失调，生理机能严重受影响，叶片逐渐干枯，致使杂草快速失水枯死。因此敌稗可有效的防除稗草，也可用于防除其他多种禾本科和双子叶杂草，如鸭舌草、水芹、狗尾草等。敌稗的作用机制是多方面的，不仅破坏植物的光合作用，而且还抑制呼吸作用与氧化磷酸化作用，干扰核酸与蛋白质合成等。毒性分级为高毒，大白鼠急性口服LD50为1400毫克/公斤，急性经皮LD50＞1000毫克/公斤，对皮肤和眼睛有刺激作用，对鱼高毒，对人的皮肤和眼睛有刺激作用。对人的ADI为0.005mg/kg体重。敌稗主要投放于很多灌溉用水的稻田，因此易污染地表及地下水资源。灌概用水中能够检测到0.1-3600mg/L的敌稗残留，而水环境中允许的敌稗最大浓度为1mg/L。

微生物降解是降解土壤中敌稗的主要方式，以其廉价、无二次污染等优点为多数学者所提倡。而现阶段多数研究集中在筛选出可以降解某一种该类化合物的菌株及其降解特性上，对降解这一类化合物分子机制的研究较少。本发明酰胺酶PamD能够在不添加辅酶因子的条件下将敌稗结构式中的酰胺键断裂，获得敌稗的降解基因在治理环境中的敌稗残留的技术研发中具有以下作用和功能，(一)用于农田和地下水水体中敌稗的降解与去除，(二)用于化工产品合成的生物转化。因此该降解基因在消除敌稗残留危害的研究中具有非常重要的理论和应用价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种酰胺酶基因pamD，该基因为一种酰胺类除草剂敌稗酰胺酶基因，是一个全新的酰胺酶基因，该基因编码的酰胺酶蛋白质PamD能够在不添加辅酶因子的条件下将酰胺类除草剂敌稗结构式中的酰胺键断裂，将敌稗降解和转化。

本发明还提供该敌稗酰胺酶基因pamD编码的酰胺酶和应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种敌稗酰胺酶基因pamD，其特征在于，所述基因pamD的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明所述的敌稗酰胺酶基因pamD编码的酰胺酶PamD，所述酰胺酶PamD的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明所述的含有敌稗酰胺酶基因pamD的重组表达载体pET28a-pamD。

进一步地，所述的重组表达载体pET28a-pamD，由敌稗酰胺酶基因pamD插入pET-28a(+)的Nde I和Nhe I位点之间所得。

本发明所述的含有敌稗酰胺酶基因pamD的基因工程菌。

所述的基因工程菌是将重组载体pET28a-pamD导入大肠杆菌Rosseta(DE3)获得。

本发明所述的敌稗酰胺酶基因pamD在降解和转化敌稗中的应用。

本发明所述的酰胺酶PamD在降解和转化敌稗中的应用。

本发明所述的酰胺酶PamD在降解和转化农田和环境水体中敌稗中的应用。

本发明所述酰胺酶基因pamD在构建降解酰胺类除草剂的转基因作物中的应用。

本发明所述的基因工程菌高效表达敌稗酰胺酶，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物残留的酰胺类除草剂的降解或转化。

本发明酰胺酶基因pamD是在一株类诺卡氏菌LMS-CY(CCTCC NO:M2016591)中克隆得到，该菌株为发明人自行分离筛选得到，保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2016591，保藏日期为2016年10月24日。通过质谱分析结果表明菌株LMS-CY可以把敌稗转化为3，4-二氯苯胺，在此基础上，通过蛋白纯化分离从菌株LMS-CY(CCTCC NO:M 2016591)分泌型蛋白中分离出敌稗酰胺酶PamD。本发明克隆该基因采取的策略为蛋白纯化分离目的蛋白，通过MALDI-TOP-MS/MS肽指纹谱分析，和全基因组比对筛选出原始序列，设计引物，通过PCR扩增基因，胶回收试剂盒纯化后，采用双酶切获得目的片段。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明从一株类诺卡氏菌LMS-CY(CCTCC NO:M 2016591)中成功克隆到一种酰胺酶基因pamD，该基因为一种酰胺类除草剂敌稗酰胺酶基因，在GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)为1218bp，编码406个氨基酸。

2、本发明通过PCR技术扩增末端含NdeI和NheI位点的完整的酰胺类除草剂敌稗酰胺酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高效表达载体pET-28a(+)的NdeI和NheI位点酶切位点上，转化表达宿主菌Rosseta(DE3)，进行IPTG诱导后可以高效表达。

3、本发明酰胺酶基因pamD编码的酰胺酶PamD能够将敌稗结构式中的酰胺键断裂，酰胺酶PamD能够将敌稗降解转化，PamD酶的稳定性较高，对敌稗降解率大于80％。该酰胺酶PamD以及含有酰胺酶基因pamD的基因工程菌可用于农田土壤和环境水体中酰胺类除草剂敌稗残留的降解及生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。

4、通过本发明的基因构建的工程菌株能高效表达酰胺类除草剂敌稗酰胺酶，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物残留的酰胺类除草剂敌稗的降解或转化。

附图说明

图1敌稗酰胺酶PamD MALDI-TOP-MS/MS肽指纹谱；

图2敌稗酰胺酶基因pamD信号肽分析图；

图3为酰胺酶基因pamD的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4为敌稗酰胺酶基因pamD在Rosetta(pET-28a(+))中表达策略图；

图5为重组菌株Rosseta(DE3)/pET28a-pamD全菌表达鉴定SDS-PAGE蛋白电泳图；

图6为pET28a-pamD蛋白Ni-IDA纯化浓缩的蛋白电泳图谱；

图7为pamD编码酰胺酶PamD降解敌稗HPLC图；A:敌稗的高效液相色谱图；B：敌稗降解产物的高效液相色谱图；

图8敌稗的LC/MS/MS图谱；A：敌稗的总离子流图谱；B：保留时间为14.047min的物质一级质谱图；C：保留时间为14.047min的物质二级质谱图；

图9敌稗酰胺酶PamD催化降解敌稗的LC/MS/MS图谱；A：敌稗的酶降解产物总离子流图谱；B：保留时间为10.506min的物质一级质谱图；C：保留时间为10.506min的物质二级质谱图；

图10敌稗酰胺酶PamD降解敌稗的途径。

具体实施方式

以下结合附图和实施例作进一步说明。

实施例中使用的微生物来源如下：

NdeI、NheI购自TAKARA生物工程(南京)有限公司；

大肠杆菌DH5α购自南京百斯凯生物工程(南京)有限公司；

大肠杆菌高表达载体pET-28a(+)购自Novegen公司；

表达宿主菌大肠杆菌Rosseta(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司。

实施例1菌株LMS-CY的培养方法以及敌稗酰胺酶基因pamD的克隆

1、细菌基因组总DNA的提取

LB培养基配方(1L)为：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，pH7.2～7.5。

将菌株LMS-CY(CCTCC NO:M 2016591)在LB培养基中大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。

2、基因组草图测序及结果分析

细菌基因组测序要求样品OD值在1.8～2.0之间，浓度越高越好，将准备好的足量的菌株LMS-CY基因组总DNA，于干冰保温下寄送至北京奥维森生物科技公司测序。样品检测采用：1、琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA污染；2、NanoDrop检测DNA的纯度(OD_260/280比值)；3.Qubit对DNA浓度进行精确定量。其中OD值在1.8～2.0之间，含量在1.5μg以上的DNA样品被用来建库。

3、目的蛋白条带分析

大量培养菌体，收集培养液，抽滤除菌，超滤浓缩，通过硫酸铵沉淀，阴离子柱层析，疏水交换层析三步，推测可能目的条带，进行MALDI-TOP-MS/MS肽指纹谱分析，敌稗酰胺酶PamD肽指纹谱如图1所示。

在基因组预测分析结果中，以amidase(酰胺酶)为关键词进行检索，找到注释为酰胺酶的orf，预测信号肽，最后选取3个具有信号肽的的scaffold序列进行分析。与MALDI-TOP-MS/MS肽指纹谱结果进行本地比对，从而筛选出目的基因pamD，该序列信号肽分析如图2所示。

实施例2基因dnrA序列验证

将获得的酰胺酶基因pamD定向克隆到Rosseta(pET-28a(+))上，以敌稗为底物，验证序列是否有功能。

1、序列的PCR扩增

设计引物扩增目的基因：

正向引物SEQ ID NO.4：GGAATTCCATATGGGGCCGGCCGGCGCTG；

反向引物SEQ ID NO.5：CTAGCTAGCTCAGCCCGGCGCGATCG。

从菌株LMS-CY总DNA基因组中扩增出酰胺类除草剂敌稗酰胺酶基因片段。

PCR扩增体系(50μL)：

PCR扩增程序：

98℃变性3min；98℃变性10s；58℃退火10s；72℃延伸15s；进行再延伸10min，冷却至室温。

酰胺类除草剂敌稗酰胺酶基因pamD的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。

2、PCR产物回收

步骤1中PCR扩增片段通过胶回收试剂盒纯化后，采用双酶切获得目的片段，以下体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h后，胶回收获得载体片段和目的基因片段。载体pET-28a(+)采用NdeI/NheI双酶切线性化后通过胶回收获得载体片段。

目的基因酶切反应体系(50μL)如下：

载体的酶切体系(50μL)：

将上述回收纯化好的目的DNA片段和载体片段，进行酶连，按下述反应体系4℃过夜后得到重组表达载体pET28a-pamD，采用42℃热激法进行转化，感受态菌株为DH5α，转化取10μL酶连产物转化200μL感受态细胞，具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P 23，涂布于含50ppm卡那霉素的LB平板上，37℃培养箱，倒置过夜培养。

挑选上述过夜培养的单菌落在3mL LB试管中培养到对数期，提取质粒，提取质粒后送公司测序。

3、基因核苷酸序列测定

将步骤2获得的的阳性克隆子委托上海铂尚生物技术有限公司进行序列测定，测得敌稗酰胺酶基因pamD的核苷酸序列为SEQID NO.1，全长为1218bp。根据敌稗酰胺酶基因pamD核苷酸序列所推断的405个氨基酸(去掉终止密码子)，理论大小为40.6kda，敌稗酰胺酶基因pamD编码的酰胺酶PamD的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，实际该序列前段有信号肽，去掉信号肽后酰胺酶PamD大小为379个氨基酸(去掉终止密码子)序列为SEQ ID NO.3。

在NCBI数据库(the UniProt Knowledge Base/SwissProt databases)中将pamD核酸序列及其对应的去掉信号肽的氨基酸序列进行在线同源性比对，发现与该蛋白相似度较高的是自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis sub sp.subtilis str.168中发现的与孢子形成过程相关的蛋白(P07372.1)和酰胺水解酶的增强子序列编码蛋白(Q02113.1)，以及小鼠肌微管相关蛋白(Q91XS1.1)，相似度分别为50％，34％，34％，而GenBank比对结果表明该基因pamD为一个新的基因。

SEQ ID NO.1(pamD核酸序列):

atgcgtcgcagcaccgcgcccctgcgcgtcggcctcctggccggcgccctgacgctctcggcgacggtggcgtccgccgggccggccggcgctgccgccgagcgacgcgccggcggctgggacgtgccggccgcggcgcggatcaccatcagcggtcacggctacggccacggccacggcatgtcccagtacggcgccgagggggccgcgcgccagggcctcacctaccagcagatcaccgagttctactacccgggcacccagtggggcaccgccgccgggcgggtgtccgtgcagctcaccgccgacaccacgccgcgcgacctcgtggtccgcgcccgcgccggtctcacgatcaaggacacccaggtccgcgggcggaccctgttgcccgagaacggcgccaccgcctggcgggtggtcaccggccgggccggcgtcggccgggtctcctaccgcaccgaccgctggtacccctacacgaccctgcgcggcaccggcgagttcttcgcgggcggccggccgatcaccctggtgacgccgtcgggggagcgcgcctatcgcggccggctgcgcaccgggatcacctccaccggcacccgcgcgaccgtcaacgagctgcgcctcgagaagtacctgcgcggggtcgtcccgctcgagcttccggcgacgtggagtaccgaggcggtgcgtgcccaggcggtcgcggcgcgcacctacgcggcgtacgagcgcgcgcacccgcggtcctcggcgtaccagatctgcgacacgacctcctgccaggtctatggcggggtcgccgccgagcacccgagcgccaaccgggcgatccgggacacccggacccagatcctgaccagctccggcgagccggccttcacccagttcggctcgagcagcggcggctggacggccgcgggctcgatgccctacctgccggcgcgcgaggacccgtacgacggctgggcgggcaacccggtgcatgcctggaagatcgtgctcgccgacacccggctggagcaggcgtggccggccgtcggcgacctgcggcgcatcgagatcacctcgcgcgacggcaacggcgcctggggcggccgggtcggctcgatcaccctgaccggcagcgccggtcaggtgaccgtgagcggagacagcttccgctcggcgctcgggctgcgctcgacctggctgaccctcacgatcgcgccgggctga

SEQ ID NO.2(PamD氨基酸序列(包括信号肽)，MRRSTAPLRVGLLAGALTLSATVASA为信号肽)：

MRRSTAPLRVGLLAGALTLSATVASAGPAGAAAERRAGGWDVPAAARITISGHGYGHGHGMSQYGAEGAARQGLTYQQITEFYYPGTQWGTAAGRVSVQLTADTTPRDLVVRARAGLTIKDTQVRGRTLLPENGATAWRVVTGRAGVGRVSYRTDRWYPYTTLRGTGEFFAGGRPITLVTPSGERAYRGRLRTGITSTGTRATVNELRLEKYLRGVVPLELPATWSTEAVRAQAVAARTYAAYERAHPRSSAYQICDTTSCQVYGGVAAEHPSANRAIRDTRTQILTSSGEPAFTQFGSSSGGWTAAGSMPYLPAREDPYDGWAGNPVHAWKIVLADTRLEQAWPAVGDLRRIEITSRDGNGAWGGRVGSITLTGSAGQVTVSGDSFRSALGLRSTWLTLTIAPGEnd

SEQ ID NO.3(PamD氨基酸序列(去信号肽))：

GPAGAAAERRAGGWDVPAAARITISGHGYGHGHGMSQYGAEGAARQGLTYQQITEFYYPGTQWGTAAGRVSVQLTADTTPRDLVVRARAGLTIKDTQVRGRTLLPENGATAWRVVTGRAGVGRVSYRTDRWYPYTTLRGTGEFFAGGRPITLVTPSGERAYRGRLRTGITSTGTRATVNELRLEKYLRGVVPLELPATWSTEAVRAQAVAARTYAAYERAHPRSSAYQICDTTSCQVYGGVAAEHPSANRAIRDTRTQILTSSGEPAFTQFGSSSGGWTAAGSMPYLPAREDPYDGWAGNPVHAWKIVLADTRLEQAWPAVGDLRRIEITSRDGNGAWGGRVGSITLTGSAGQVTVSGDSFRSALGLRSTWLTLTIAPGEnd

实施例3敌稗酰胺酶基因pamD在大肠杆菌Rosetta(DE3)(pET-28a(+))中的高效表达

挑取实施例2中的阳性克隆子提取的质粒转化到表达宿主菌Rosseta(DE3)(转化方法参考实施例2)，将重组载体pET28a-pamD导入大肠杆菌Rosseta(DE3)中，获得重组的基因工程菌株，涂布于含有50mg/L卡那霉素的平板，37℃培养箱，倒置过夜培养，挑取阳性转化子(即过夜培养出的单菌落Rosseta(DE3)/pET28a-pamD)，敌稗酰胺酶基因pamD在Rosseta(DE3)中表达过程如图4所示。

挑取阳性转化子接种至新鲜的LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)37℃培养约4小时，OD₆₀₀为0.6左右，加入终浓度为0.35mM的IPTG诱导pET28a-pamD的表达。16℃诱导12小时后收集菌体，100mL菌液离心，用15mL(50mM,pH 7.4)PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎(AutoScience,UH-650BμLTrasonic processor,30％intensity)，20min离心，处理后的菌体蛋白样品进行4-20％SDS-PAGE电泳，电泳图如图5所示，图5表明大肠杆菌Rosseta(DE3)/pET28a-pamD菌株可以大量表达产生PamD蛋白。

PamD蛋白纯化具体步骤：挑取阳性转化子接种至新鲜的2L LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)37℃培养至OD₆₀₀为0.6左右2L菌液培养，加入终浓度为0.35mM的IPTG，16℃诱导12小时，收集培养液，并用35mL冰浴的BufferA(50mM PBS，300mM NaCl，1％Triton-100，pH7.4)重悬，超声裂解细胞，离心取上清过Ni-IDA柱。以50mM、100mM、150mM、200mM、250mM和300mM咪唑从低浓度到高浓度进行梯度洗涤Ni-IDA柱，分别收集洗脱液。将纯化得到的敌稗酰胺酶PamD超滤浓缩，PamD SDS聚丙烯酰胺电泳图谱见图6，图6表明纯化浓缩后的样品进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE电泳图片显示，在IPTG诱导后，出现了一条约为38kD的蛋白条带。

实施例4敌稗酰胺酶PamD对敌稗的降解和转化以及代谢产物的确定

20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，10mg/L底物敌稗、反应酶量(实施例3中纯化所得)150μL，30℃反应24h。每个反应以加入酶开始计时，用3mL二氯甲烷终止反应，分层后有机相经无水硫酸钠脱水，吸取2mL有机相吹干，用400μL甲醇溶解，用0.22μm有机相滤器过滤除去杂质，获得液相样品。利用LC/MS/MS测定反应液中的代谢产物。

高效液相色谱降解效果验证方法：在培养液中加入等体积的二氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取2mL下层二氯甲烷，挥发完全后，加入400μL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。采用紫外和高效液相色谱测定提取液中敌稗的含量，液相色谱条件：流动相乙腈：水(70：30，V/V)，Waters C18反相柱，柱温为40℃，紫外检测器，测定波长230nm、280nm，进样量25μL，流速为1.0mL·min^-1。外标法按峰面积定量。采用液质联用仪测定降解产物，方法如下：首先将上述酶反应液用等体积二氯甲烷萃取，样品吹干，然后加入400μL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。液相色谱条件：流动相为乙腈，色谱柱为Kinetex C18(2.6μm，2.1mm×100mm)，进样量2μL，流速为0.2mL·min^-1，温度40℃，最大温度85℃。采样速度：5.0ul/s。程序为梯度洗脱(0.5-3min 30％甲醇，3-15min 75％甲醇，15-30min 75％甲醇，30-30.10min 30％甲醇，35.00min Stop)。

质谱检测选用：AB Sciex高分辨串联质谱仪，Triple TOF 5600+LC/MS/MS系统，离子源为DuoSpray，正离子检测模式，质量扫描范围(m/z)：100-550。

pamD编码酰胺酶PamD降解敌稗HPLC结果如图7所示，图7表明酰胺酶基因pamD编码的酰胺酶PamD能够将敌稗结构式中的酰胺键断裂，同时酰胺酶PamD能够将敌稗降解转化，PamD酶的稳定性较高，对敌稗降解率大于80％。

同时选用敌稗(为99％分析纯级，原药对照中加入灭活的纯酶，其他条件与处理相同)采用上述相同的液质条件进行检测，敌稗原药的LC/MS/MS检测结果如图8所示；敌稗的酰胺酶PamD酶降解反应液的二氯甲烷提取物的LC/MS/MS图谱见图9，由图8和9的数据分析得出敌稗经PamD水解断裂酰胺键后生成3,4-二氯苯胺，降解反应途径见图10。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种敌稗酰胺酶基因pamD及其编码蛋白质和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1218

<212> DNA

<213> 敌稗酰胺酶基因pamD(pamD)

<400> 1

atgcgtcgca gcaccgcgcc cctgcgcgtc ggcctcctgg ccggcgccct gacgctctcg 60

gcgacggtgg cgtccgccgg gccggccggc gctgccgccg agcgacgcgc cggcggctgg 120

gacgtgccgg ccgcggcgcg gatcaccatc agcggtcacg gctacggcca cggccacggc 180

atgtcccagt acggcgccga gggggccgcg cgccagggcc tcacctacca gcagatcacc 240

gagttctact acccgggcac ccagtggggc accgccgccg ggcgggtgtc cgtgcagctc 300

accgccgaca ccacgccgcg cgacctcgtg gtccgcgccc gcgccggtct cacgatcaag 360

gacacccagg tccgcgggcg gaccctgttg cccgagaacg gcgccaccgc ctggcgggtg 420

gtcaccggcc gggccggcgt cggccgggtc tcctaccgca ccgaccgctg gtacccctac 480

acgaccctgc gcggcaccgg cgagttcttc gcgggcggcc ggccgatcac cctggtgacg 540

ccgtcggggg agcgcgccta tcgcggccgg ctgcgcaccg ggatcacctc caccggcacc 600

cgcgcgaccg tcaacgagct gcgcctcgag aagtacctgc gcggggtcgt cccgctcgag 660

cttccggcga cgtggagtac cgaggcggtg cgtgcccagg cggtcgcggc gcgcacctac 720

gcggcgtacg agcgcgcgca cccgcggtcc tcggcgtacc agatctgcga cacgacctcc 780

tgccaggtct atggcggggt cgccgccgag cacccgagcg ccaaccgggc gatccgggac 840

acccggaccc agatcctgac cagctccggc gagccggcct tcacccagtt cggctcgagc 900

agcggcggct ggacggccgc gggctcgatg ccctacctgc cggcgcgcga ggacccgtac 960

gacggctggg cgggcaaccc ggtgcatgcc tggaagatcg tgctcgccga cacccggctg 1020

gagcaggcgt ggccggccgt cggcgacctg cggcgcatcg agatcacctc gcgcgacggc 1080

aacggcgcct ggggcggccg ggtcggctcg atcaccctga ccggcagcgc cggtcaggtg 1140

accgtgagcg gagacagctt ccgctcggcg ctcgggctgc gctcgacctg gctgaccctc 1200

acgatcgcgc cgggctga 1218

<210> 2

<211> 405

<212> PRT

<213> 酰胺酶pamD(pamD)

<400> 2

Met Arg Arg Ser Thr Ala Pro Leu Arg Val Gly Leu Leu Ala Gly Ala

1 5 10 15

Leu Thr Leu Ser Ala Thr Val Ala Ser Ala Gly Pro Ala Gly Ala Ala

20 25 30

Ala Glu Arg Arg Ala Gly Gly Trp Asp Val Pro Ala Ala Ala Arg Ile

35 40 45

Thr Ile Ser Gly His Gly Tyr Gly His Gly His Gly Met Ser Gln Tyr

50 55 60

Gly Ala Glu Gly Ala Ala Arg Gln Gly Leu Thr Tyr Gln Gln Ile Thr

65 70 75 80

Glu Phe Tyr Tyr Pro Gly Thr Gln Trp Gly Thr Ala Ala Gly Arg Val

85 90 95

Ser Val Gln Leu Thr Ala Asp Thr Thr Pro Arg Asp Leu Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Ala Gly Leu Thr Ile Lys Asp Thr Gln Val Arg Gly Arg Thr

115 120 125

Leu Leu Pro Glu Asn Gly Ala Thr Ala Trp Arg Val Val Thr Gly Arg

130 135 140

Ala Gly Val Gly Arg Val Ser Tyr Arg Thr Asp Arg Trp Tyr Pro Tyr

145 150 155 160

Thr Thr Leu Arg Gly Thr Gly Glu Phe Phe Ala Gly Gly Arg Pro Ile

165 170 175

Thr Leu Val Thr Pro Ser Gly Glu Arg Ala Tyr Arg Gly Arg Leu Arg

180 185 190

Thr Gly Ile Thr Ser Thr Gly Thr Arg Ala Thr Val Asn Glu Leu Arg

195 200 205

Leu Glu Lys Tyr Leu Arg Gly Val Val Pro Leu Glu Leu Pro Ala Thr

210 215 220

Trp Ser Thr Glu Ala Val Arg Ala Gln Ala Val Ala Ala Arg Thr Tyr

225 230 235 240

Ala Ala Tyr Glu Arg Ala His Pro Arg Ser Ser Ala Tyr Gln Ile Cys

245 250 255

Asp Thr Thr Ser Cys Gln Val Tyr Gly Gly Val Ala Ala Glu His Pro

260 265 270

Ser Ala Asn Arg Ala Ile Arg Asp Thr Arg Thr Gln Ile Leu Thr Ser

275 280 285

Ser Gly Glu Pro Ala Phe Thr Gln Phe Gly Ser Ser Ser Gly Gly Trp

290 295 300

Thr Ala Ala Gly Ser Met Pro Tyr Leu Pro Ala Arg Glu Asp Pro Tyr

305 310 315 320

Asp Gly Trp Ala Gly Asn Pro Val His Ala Trp Lys Ile Val Leu Ala

325 330 335

Asp Thr Arg Leu Glu Gln Ala Trp Pro Ala Val Gly Asp Leu Arg Arg

340 345 350

Ile Glu Ile Thr Ser Arg Asp Gly Asn Gly Ala Trp Gly Gly Arg Val

355 360 365

Gly Ser Ile Thr Leu Thr Gly Ser Ala Gly Gln Val Thr Val Ser Gly

370 375 380

Asp Ser Phe Arg Ser Ala Leu Gly Leu Arg Ser Thr Trp Leu Thr Leu

385 390 395 400

Thr Ile Ala Pro Gly

405

<210> 3

<211> 379

<212> PRT

<213> 酰胺酶pamD(pamD)

<400> 3

Gly Pro Ala Gly Ala Ala Ala Glu Arg Arg Ala Gly Gly Trp Asp Val

1 5 10 15

Pro Ala Ala Ala Arg Ile Thr Ile Ser Gly His Gly Tyr Gly His Gly

20 25 30

His Gly Met Ser Gln Tyr Gly Ala Glu Gly Ala Ala Arg Gln Gly Leu

35 40 45

Thr Tyr Gln Gln Ile Thr Glu Phe Tyr Tyr Pro Gly Thr Gln Trp Gly

50 55 60

Thr Ala Ala Gly Arg Val Ser Val Gln Leu Thr Ala Asp Thr Thr Pro

65 70 75 80

Arg Asp Leu Val Val Arg Ala Arg Ala Gly Leu Thr Ile Lys Asp Thr

85 90 95

Gln Val Arg Gly Arg Thr Leu Leu Pro Glu Asn Gly Ala Thr Ala Trp

100 105 110

Arg Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Val Gly Arg Val Ser Tyr Arg Thr

115 120 125

Asp Arg Trp Tyr Pro Tyr Thr Thr Leu Arg Gly Thr Gly Glu Phe Phe

130 135 140

Ala Gly Gly Arg Pro Ile Thr Leu Val Thr Pro Ser Gly Glu Arg Ala

145 150 155 160

Tyr Arg Gly Arg Leu Arg Thr Gly Ile Thr Ser Thr Gly Thr Arg Ala

165 170 175

Thr Val Asn Glu Leu Arg Leu Glu Lys Tyr Leu Arg Gly Val Val Pro

180 185 190

Leu Glu Leu Pro Ala Thr Trp Ser Thr Glu Ala Val Arg Ala Gln Ala

195 200 205

Val Ala Ala Arg Thr Tyr Ala Ala Tyr Glu Arg Ala His Pro Arg Ser

210 215 220

Ser Ala Tyr Gln Ile Cys Asp Thr Thr Ser Cys Gln Val Tyr Gly Gly

225 230 235 240

Val Ala Ala Glu His Pro Ser Ala Asn Arg Ala Ile Arg Asp Thr Arg

245 250 255

Thr Gln Ile Leu Thr Ser Ser Gly Glu Pro Ala Phe Thr Gln Phe Gly

260 265 270

Ser Ser Ser Gly Gly Trp Thr Ala Ala Gly Ser Met Pro Tyr Leu Pro

275 280 285

Ala Arg Glu Asp Pro Tyr Asp Gly Trp Ala Gly Asn Pro Val His Ala

290 295 300

Trp Lys Ile Val Leu Ala Asp Thr Arg Leu Glu Gln Ala Trp Pro Ala

305 310 315 320

Val Gly Asp Leu Arg Arg Ile Glu Ile Thr Ser Arg Asp Gly Asn Gly

325 330 335

Ala Trp Gly Gly Arg Val Gly Ser Ile Thr Leu Thr Gly Ser Ala Gly

340 345 350

Gln Val Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Arg Ser Ala Leu Gly Leu Arg

355 360 365

Ser Thr Trp Leu Thr Leu Thr Ile Ala Pro Gly

370 375

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaattccat atggggccgg ccggcgctg 29

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctagctagct cagcccggcg cgatcg 26

Claims

1.一种敌稗酰胺酶基因pamD，其特征在于，所述基因pamD的核苷酸序列为 SEQ IDNO.1。

2.一种权利要求1所述的敌稗酰胺酶基因pamD编码的酰胺酶PamD，其特征在于，所述酰胺酶PamD的氨基酸序列为 SEQ ID NO.2。

3.一种含有权利要求 1 所述的敌稗酰胺酶基因pamD的重组表达载体pET28a- pamD。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体pET28a- pamD，其特征在于，所述重组表达载体pET28a- pamD由敌稗酰胺酶基因 pamD插入 pET-28a(+) 的Nde I 和Nhe I 位点之间所得。

5.一种含有权利要求 1 所述的敌稗酰胺酶基因pamD的基因工程菌。

6.根据权利要求5 所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是将重组载体pET28a- pamD导入大肠杆菌Rosseta(DE3)获得。

7.一种权利要求1所述的敌稗酰胺酶基因pamD在降解和转化敌稗中的应用。

8.一种权利要求2所述的酰胺酶PamD在降解和转化敌稗中的应用。

9.一种权利要求2所述的酰胺酶PamD在降解和转化农田和环境水体中敌稗中的应用。

10.一种权利要求1所述酰胺酶基因pamD在构建降解酰胺类除草剂的转基因作物中的应用。