CN109762800A - 一种啶虫脒酰胺酶基因aceAB及其编码蛋白质及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种啶虫脒酰胺酶基因aceAB及其编码蛋白质及其应用，该基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1，包括α亚基和β亚基，该基因编码的酰胺酶AceAB的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明成功克隆到一种酰胺酶基因aceAB，为一种可降解新烟碱类杀虫剂啶虫脒的酰胺酶基因，可以通过人工方式合成，α亚基的基因全长372bp，编码123aa，分子量为14560Da；β亚基的基因全长2295bp，编码764aa，分子量为84231Da。本发明的酰胺酶AceAB能够将啶虫脒转化成产物1‑(6‑氯吡啶基‑3‑甲基)‑N‑甲基甲胺，可用于土壤、水体和农作物残留的新烟碱类杀虫剂啶虫脒的降解或转化。

Description

一种啶虫脒酰胺酶基因aceAB及其编码蛋白质及其应用

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，具体涉及一种啶虫脒酰胺酶基因 aceAB及其编码蛋白质及其应用。

背景技术

啶虫脒是一种高效、低毒、广谱的氯代烟碱类杀虫剂，属于新烟碱类杀虫剂。 啶虫脒(acetamipid)，化学名称为N-[(6-氯-3-吡啶基)]-N²-氰基-N-甲基乙酰胺(结 构式见图3)。分子式是C₁₀H₁₁ClN₄，分子量为222.68，CAS登记号为135410-20-7。 1995年由日本曹达株式会社开发，是继吡虫啉后又一种高效、广谱、低毒的氯 代烟碱类杀虫剂。啶虫脒纯品外观为白色晶体，熔点为101.0～103.3℃，蒸汽压 ＜0.33×10^-6Pa(25℃)。在25℃时，其在水中的溶解度为4250mg·L^-1，能溶于丙 酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙腈、氯仿、四氢呋喃等有机溶剂中。在日光下稳 定；在pH值为5和7的水中，在45℃以下稳定；pH≥9时，在22℃以下的水中稳定；常温存储稳定性为2年。

目前，新烟碱类杀虫剂已成为世界第一大杀虫剂，而啶虫脒又是其中重要种 类，被广泛用于防治水稻、蔬菜、棉花、果树和茶叶上的蚜虫、蓟马、飞虱以及 部分鳞翅目害虫等。由于啶虫脒的广泛使用，并且其水溶性高，极易通过土壤进 入地表水和地下水。此外，啶虫脒对蜜蜂等的急性毒性以及在茶叶、棉花上的残 留均有报道，因此关于啶虫脒造成的环境污染的修复是科研工作者关注的研究方 向。啶虫脒可以通过物理方法等来降解，然而这些方法成本较高、不适合于大面 积污染的修复。微生物降解是环境中污染物降解的主要途径，利用微生物或酶制 剂进行污染环境修复是一种有效、安全、廉价和无二次污染的方法，具有广阔的 应用前景。因此，从环境中筛选获得啶虫脒的高效降解菌株具有重要意义。

微生物参与的代谢是啶虫脒在环境中消除的主要途径。近年来，已有一些关 于啶虫脒微生物降解的报道，但其研究内容多集中于降解菌株的分离和代谢途径 的研究，对于啶虫脒降解基因研究较少，仅有一个腈水合酶的报道(Zhou et al., 2014)。H.Yang etal./International Biodeterioration&Biodegradation 85(2013) 95-102，Biodegradation of acetamiprid by Pigmentiphaga sp.D-2and the degradationpathway文献中筛选到一株啶虫脒高效降解菌Pigmentiphaga sp.D-2，菌株D-2 可以将啶虫脒降解生成IM1-4。因此，克隆菌株D-2降解啶虫脒途径中的关键酶 基因，研究其酶学特性，对污染物的降解、修复以及基因工程菌的构建有重要的 意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种啶虫脒酰胺酶基因 aceAB，该基因为一种新烟碱类杀虫剂啶虫脒酰胺酶基因，是一个全新的酰胺酶 基因，该基因编码的酰胺酶AceAB能够在将新烟碱类杀虫剂结构式中的酰胺键 断裂，使得啶虫脒(ACE)水解成IM1-4(1-(6-氯吡啶基-3-甲基)-N-甲基甲胺)。

本发明还提供该啶虫脒酰胺酶基因aceAB编码的酰胺酶及其应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种啶虫脒酰胺酶基因aceAB， 所述酰胺酶基因aceAB的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述酰胺酶基因aceAB包括α亚基aceA和β亚基aceB，核苷酸 序列SEQID NO.1的1-372位为aceA的核苷酸序列，419-2713位为aceB的核苷 酸序列。

本发明所述的啶虫脒酰胺酶基因aceAB编码的酰胺酶AceAB，所述酰胺酶 AceAB的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

进一步地，所述酰胺酶AceAB包括蛋白AceA和蛋白AceB，蛋白AceA由 基因aceA编码，蛋白AceB由基因aceB编码，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4。

本发明所述的啶虫脒酰胺酶基因aceAB的重组表达载体pET-29a-aceAB。

进一步地，所述的重组表达载体pET-29a-aceAB，所述重组表达载体 pET-29a-aceAB由啶虫脒酰胺酶基因aceAB插入pET-29a(+)的Nde I和Xho I 位点之间所得。

本发明所述的含有啶虫脒酰胺酶基因aceAB的基因工程菌。

其中，所述的基因工程菌是将权利要求3所述的重组载体pET-29a-aceAB 导入大肠杆菌BL21(DE3)获得。

本发明所述的啶虫脒酰胺酶基因aceAB在降解和转化啶虫脒中的应用。

本发明所述的酰胺酶AceAB在降解和转化啶虫脒中的应用。

本发明所述的酰胺酶AceAB在降解和转化农田和环境水体中啶虫脒中的应 用。

本发明所述的基因工程菌高效表达啶虫脒酰胺酶，生产的酶制剂可用于土 壤、水体和农作物残留的啶虫脒的降解或转化。

本发明酰胺酶基因aceAB是降解啶虫脒的关键酶基因，是在菌株 Pigmentiphagasp.D-2中克隆得到，所用菌株Pigmentiphaga sp.D-2已保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.16707， 保藏日期2018年11月5日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所，邮编：100101，该菌株Pigmentiphaga sp.D-2可以将啶虫脒 C-N键断裂生成1-(6-氯吡啶基-3-甲基)-N-甲基甲胺(IM1-4)。

本发明采用蛋白纯化结合基因组学的方法克隆降解啶虫脒的关键酶基因，首 先对菌株Pigmentiphaga sp.D-2(简称D-2)进行基因组测序，对菌株D-2的粗 酶液通过硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose FF离子柱层析和Superdex-200凝胶层析 进行纯化得到目的蛋白，再通过肽指纹图谱鉴定结合菌株基因组测序结果对目的 蛋白序列进行确定，对关键酶基因进行克隆、表达和纯化，研究其酶学特性。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明从一株啶虫脒降解菌株中成功克隆到一种酰胺酶基因aceAB，该 基因为一种新烟碱类杀虫剂啶虫脒酰胺酶基因，可以通过人工方式合成，在 GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因，通过ORF分析发现基因aceAB 包含α亚基(aceA)和β亚基(aceB)两个亚基，α亚基的基因全长372bp，编 码123aa，分子量为14560Da；β亚基的基因全长2295bp，编码764aa，分子 量为84231Da。

2、本发明通过PCR技术扩增末端含NdeI和XhoI位点的完整的新烟碱类 杀虫剂啶虫脒酰胺酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高效表达载体pET-29a(+) 的NdeI和XhoI位点酶切位点上，转化表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，进行 IPTG诱导后可以高效表达。

3、本发明酰胺酶基因aceAB编码的酰胺酶AceAB能够将啶虫脒转化成 IM1-4。该酰胺酶AceAB可用于土壤、水体和农作物残留的新烟碱类杀虫剂啶虫 脒的降解或转化，具有非常重要的理论和应用价值。

4、通过本发明的基因构建的工程菌株含有酰胺酶基因aceAB可以高效表达 啶虫脒酰胺酶，生产的酶制剂可用于农田土壤和环境水体中啶虫脒残留的降解及 生物转化。

附图说明

图1为Pigmentiphaga sp.D-2染色体总DNA的电泳图谱；

图2为硫酸铵分级沉淀结果分析图；

图3为酶液经Q-Sepharose FF离子柱纯化后的SDS-PAGE图谱(M，即用型 蛋白分子量标准(低)；1，穿过液；2，0M NaCl洗脱酶液；3，0.2M NaCl洗 脱酶液；4，0.4M NaCl洗脱酶液；5，0.6M NaCl洗脱酶液；6，0.8M NaCl洗 脱酶液；7，1M NaCl洗脱酶液；8、9，浓缩后的0.6M NaCl洗脱酶液)；

图4为酶液经AKTA purifier层析仪的结果图；

图5为酶液经Superdex-200凝胶层析后的SDS-PAGE图谱(M：即用型蛋 白分子量标准(低)；1：纯化后的酶液)；

图6为目的条带的串联质谱鉴定结果肽指纹谱示意图(注：带下划线的肽 段与串联质谱结果一致)；

图7为片段Scaffold26的ORF分析示意图；

图8(a)为酰胺酶基因aceAB的PCR产物电泳图；图8(b)为重组质粒 pET-29a-aceAB的电泳图(M，1kb DNA Ladder；1和2，aceAB的PCR产物；3， 重组质粒pET-29a-aceAB；4，质粒pET-29a(+))；

图9为酰胺酶AceAB纯化的SDS-PAGE电泳图谱(M，即用型蛋白分子量 标准(低)；1，0mM咪唑洗脱液；2，50mM咪唑洗脱液；3，100mM咪唑 洗脱液；4，150mM咪唑洗脱液；5，200mM咪唑洗脱液；6，250mM咪唑 洗脱液；7，300mM咪唑洗脱液；8，重组菌株BL-29-ama表达后的总蛋白；9， 纯化后的AceAB)；

图10为酰胺酶AceAB降解啶虫脒的液相色谱图；a：啶虫脒标样；b：Ama 酰胺酶AceAB降解啶虫脒；

图11为酰胺酶AceAB降解啶虫脒的产物的MS-MS图；a：样品的一级质 谱图；b和c分别是物质ACE和IM1-4的二级质谱图；

图12为酰胺酶AceAB降解啶虫脒的降解反应途径示意图；

图13为实施例3纯化后的酰胺酶AceAB SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例作进一步说明。

实施例中使用的生物来源如下：

NdeI、XhoI购自TAKARA生物工程(南京)有限公司；

大肠杆菌DH5α购自南京百斯凯生物工程(南京)有限公司；

大肠杆菌高表达载体pET-29a(+)购自Novegen公司；

表达宿主菌大肠杆菌(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司。

实施例1

菌株Pigmentiphaga sp.D-2的培养方法以及啶虫脒酰胺酶基因aceAB的克隆

1、细菌基因组总DNA的提取

LB培养基配方(1L)为：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，pH7.2～7.5。

采用高盐法(Miller et al.,1988)提取菌株D-2的总DNA。(1)将-70℃甘 油保存的降解菌株D-2在LB固体平板上划线，置于30℃培养箱中至菌落可见； (2)挑取单菌落接种至3mL液体LB试管中，30℃，160rpm摇床振荡培养至 菌体的对数生长期，12000rpm离心10min，弃上清收集菌体，用等体积的TE 在相同条件下洗涤菌体两次，最后用1mL的TE重悬菌体；(3)加入50μL的 质量分数10％SDS溶液和20μL的蛋白酶K(20mg·mL^-1)，温和颠倒数次至液 体均匀；(4)37℃水浴过夜，待液体变澄清后，加入600μL的饱和NaCl溶液 震荡均匀，12000rpm离心15min，小心吸取上清液，以体积比1∶1比例加入 酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)，温和地上下颠倒混匀，静置5min后， 12000rpm离心15min；(5)将上清液小心吸取至干净的离心管中，继续加入 等体积的酚∶氯仿∶异戊醇进行抽提，重复此操作2～4次，直至中间界面无白色 物质为止；(6)吸取上清液移至干净的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇沉 淀DNA；(7)用熔封的毛细管挑取沉淀后的总DNA，用70％乙醇洗涤数次， 待乙醇挥发完全后溶于50μL TE缓冲液(pH8.0)中，-20℃保存。D-2的总DNA 电泳如图1所示。

2、基因组草图测序及结果分析

细菌基因组测序要求样品OD值在1.8～2.0之间，浓度不低于50ng·μL^-1， 总量不低于5μg，才能符合Illumina PE文库的测序要求，于干冰保温下寄送至 上海美吉生物科技有限公司。样品检测采用：1、琼脂糖凝胶电泳分析DNA降 解程度以及是否有RNA污染；2、NanoDrop检测DNA的纯度(OD_260/280比值)； 3.Qubit对DNA浓度进行精确定量。其中OD值在1.8～2.0之间，含量在 1.5μg以上的DNA样品被用来建库。

Illumina Miseq测序流程：基因组DNA；片段化(约300～500bp)；文库构 建；桥式PCR；Illumina Miseq测序。采用Illumina Miseq测序技术完成菌株的 基因组扫描测序，构建了Illumina PE文库(～500bp文库)，对获得的测序数据 进行质控后利用生物信息学分析手段完成菌株的全基因组扫描。

基因组装：对原始测序数据质控和质量剪切后，利用拼接软件SOAPdenovo v2.04(http://soap.genomics.org.cn/)对优化后的序列测试不同的Kmer值，根据 N50的结果，选择最优Kmer值进行拼接。并使用GapCloser v1.12软件进行内 部填充和碱基校正得到最终拼接结果。

基因预测与功能注释：细菌的基因预测用Glimmer 3.02 (http://www.cbcb.umd.edu/software/glimmer/)软件进行，将预测基因的蛋白序列分 别与不同的数据库(Nr、genes、string和GO)进行Blastp比对，获得预测基 因的注释信息。并进行COG功能分析、KEGG通路分析和GO注释统计。

3、目的蛋白条带分析

菌株D-2的培养和粗酶液的制备：

将菌株D-2从-70℃冰箱中取出，接种于加入200mg·L^-1啶虫脒的LB固体 平板上划线活化。挑取单菌落接种于加入10mg·L^-1啶虫脒的100mL LB液体培 养基中，30℃，160rpm振荡培养至对数生长期；4℃，12000g离心10min收集 菌体；用预冷的20mM Tris-HCl(pH7.5)重悬菌体，4℃，12000g离心10min 收集菌体，重复此步骤两次；用10mL预冷的20mMTris-HCl重悬菌体。用超 声波破碎菌体5min，整个过程均在冰浴下进行，4℃，12000g离心30min，所 得上清即为粗酶液。

硫酸铵分级沉淀：

按0～20％，20～40％，40～50％，50～60％，60～80％和80～100％的硫酸铵饱和梯度对粗酶液进行沉淀。步骤为：将100mL的粗酶液加入三角烧瓶中，三角烧 瓶内放置磁性转子，将三角烧瓶置于含有冰的烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器上， 打开磁力搅拌器。按粗酶液的体积称好硫酸铵，向粗酶液中缓缓加入硫酸铵，使 饱和度达到20％，此过程约为30min，然后4℃，12000g离心20min，沉淀用 2mL Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 7.5)重悬，用于后续测定蛋白含量和酶活力； 向上清中继续添加硫酸铵，使饱和度达到40％，按上述步骤，直至硫酸铵的饱和 度达到100％。将各级沉淀的蛋白用2mL Tris-HCl缓冲液(20mM，pH7.5)重 悬，4℃，20mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中透析过夜，透析袋截留分子量为 10kDa。透析好的各级酶液即可测定蛋白和酶活力。

粗酶液经硫酸铵分级沉淀后，进行酶活力回收(％)和蛋白含量(％)的测 定，结果见图2。可以看出除40～50％和50～60％的分级沉淀有酶活力，其余组份 的分级沉淀基本没有酶活力。40～50％分级沉淀的蛋白量为51.2％，酶活力回收 为56.4％；50～60％分级沉淀的蛋白量为10.4％，酶活力回收为43.6％。因此选取 硫酸铵饱和度为50～60％的进行下一步纯化，经过此初步纯化(即硫酸铵分级沉 淀)去除了89.6％的蛋白，酶活力回收43.6％。

Q-Sepharose FF离子柱层析：

将初步纯化并透析后的酶液过平衡好的Q-Sepharose FF阴离子柱，用含有0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 7.5)进行梯度洗脱， 将每个梯度收集的酶液集中在一起，进行酶活力测定。

经测活后得出0.6M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 7.5)洗脱组份有酶活，其 余组分均无酶活。将所有组分取适量酶液进行SDS-PAGE电泳，可以初步得出 各组分的蛋白含量(图3)。将0.6M NaCl洗脱组分的酶液进行超滤浓缩为2mL， 以继续后续纯化。

Superdex-200凝胶层析：

将经过Q-Sepharose FF阴离子柱层析后有效果的酶液透析并超滤后得到的 浓缩酶液，加入Superdex-200凝胶层析柱(每次上样约500μL，将浓缩酶液全 部上完)，用含有0.1M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 7.5)进行洗脱，用AKTA purifier全自动层析仪(AKTApurifier 10UPC)自动收集，流速为0.4mL·min^-1 (1mL·管^-1)。当有蛋白出现时则会在紫外280nm扫描时出现蛋白吸收峰(图4)。 将有蛋白吸收峰出现的离心管中的酶液取适量进行酶活力测定，发现第10、11 管有酶活，将两管酶液合并，超滤浓缩至50μL，并进行SDS-PAGE电泳(图5)， 其中a为将进行肽指纹图谱分析的条带。

肽指纹图谱鉴定：

将浓缩后的50μL酶液进行SDS-PAGE电泳，切割目的条带a送至上海博苑 科技有限公司进行肽指纹图谱分析，再结合菌株D-2的基因组框架图测序结果进 行分析。如图6显示，图6中下划线标出的肽段就是该蛋白条带经过酶解后的串 联质谱鉴定数据，经过Mascot搜索软件在基因组框架图测序结果中比对，结果 与orf05630所编码的蛋白序列相吻合，覆盖率达35％。将orf05630的序列结果 在NCBI上进行blastx比对，其与Paracoccusaminophilus的 N,N-dimethylformamidaseβ亚基相似性为56％，蛋白分子量为84.2kDa，与a条 带蛋白大小一致。所以将该蛋白命名为AceAB(Acetamiprid amidase)。

结合菌株D-2基因组框架图测序结果进行Blast比对(NCBI)，编码啶虫脒 酰胺酶基因aceAB的orf05630位于scaffold26上。aceA与菌株Paracoccus aminophilus中的N,N-dimethylformamidaseα亚基的相似度为35％；aceB与菌株 Paracoccus aminophilus中的N,N-dimethylformamidaseβ亚基的相似度为56％ (表2)。

表2片段Scaffold 26的ORF进行blastX比对分析

通过blastX比对结果可知，AceAB与N,N-dimethylformamidase(DMFase) 有最高的相似性。

实施例2

啶虫脒酰胺酶基因aceAB序列验证

将获得的啶虫脒酰胺酶基因aceAB定向克隆到pET-29a(+)上，以啶虫脒为底 物，验证序列是否有功能。

1、序列的PCR扩增

设计引物扩增目的基因：

正向引物aceAB-F SEQ ID NO.5：

5’-TAAGAAGGAGATATACATATGTCGTGCCGATGCGCACGC-3’(NdeI)；

反向引物aceAB-R SEQ ID NO.6：

5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGCCGATGATCTCGTCCATGG-3’

(XhoI)。

从菌株Pigmentiphaga sp.D-2总DNA基因组中扩增出啶虫脒酰胺酶基因片 段。

PCR扩增体系：

PCR反应条件：

取2μL PCR产物在0.75％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，用凝胶回收试剂 盒(Axygen)进行切胶回收，-20℃保存。

啶虫脒酰胺酶基因aceAB的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图如图8(a) 所示。

2、PCR产物回收

步骤1中PCR扩增片段通过胶回收试剂盒纯化后，采用双酶切获得目的片 段，以下体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h后，胶回收获得载体片段和目的基 因片段。载体pET-29a(+)采用NdeI和XhoI双酶切线性化后通过胶回收获得载体 片段。

将载体pET-29a(+)经NdeI和XhoI双酶切，酶切体系为(100μL)：

37℃酶切过夜，切胶回收相应的pET-29a(+)片段，用切胶回收试剂盒(Axygen) 进行切胶回收后，储存于-20℃。

将双酶切后切胶回收的pET-29a(+)片段(5.23kb)和目的基因片段aceAB(2842bp)按照同源重组一步克隆试剂盒(II One Step Cloning Kit)的 操作说明进行同源重组得到重组质粒pET-29a-aceAB，37℃反应30min。

同源重组体系如下(20μL)：

将上述同源重组好的重组质粒pET-29a-aceAB转化到E.coli BL21(DE3)感受 态细胞中，转化具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P 23， 涂布于含有50mg·L^-1Km(卡那霉素)的LB平板上，37℃培养12～16h。挑取阳 性克隆子于50mg·L^-1Km的LB试管中扩大培养，提取质粒进行PCR，验证目 的片段成功导入载体中，重组质粒pET-29a-aceAB的电泳图如图8(b)所示， 证明重组载体构建成功。将插入正确目的片段的阳性克隆子的菌液送至南京金斯 瑞生物科技有限公司进行测序，验证没有碱基突变，证明连接到表达载体上的片 段是aceAB基因。

3、基因核苷酸序列测定

将步骤2获得的阳性克隆子委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测 定，测得啶虫脒酰胺酶基因aceAB核苷酸序列为SEQ ID NO.1。酰胺酶基因 aceAB包括α亚基aceA和β亚基aceB，核苷酸序列SEQ ID NO.1的1-372位为aceA的核苷酸序列，419-2713位为aceB的核苷酸序列，α亚基全长372bp，编 码123aa，分子量为14560Da；β亚基全长2295bp，编码764aa，分子量为84231 Da。

基因aceAB编码的酰胺酶AceAB(Acetamiprid amidase)，酰胺酶AceAB的氨 基酸序列为SEQ ID NO.2。酰胺酶AceAB包括蛋白AceA和蛋白AceB，蛋白 AceA由基因aceA编码，蛋白AceB由基因aceB编码，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

在NCBI数据库进行blastn和blastp比对，其中核苷酸序列SEQ ID NO.1为 全新的基因序列，氨基酸序列SEQ ID NO.2与菌株Paracoccus aminophilus中的 N,N-dimethylformamidase subunit beta的相似度为56％。将基因aceAB包含α亚 基(aceA)和β亚基(aceB)核酸序列及其对应的氨基酸序列进行在线blastx同 源性比对，发现α亚基与菌株Paracoccus aminophilus中的 N,N-dimethylformamidaseα亚基的相似度为35％；β亚基与菌株Paracoccus aminophilus中的N,N-dimethylformamidaseβ亚基的相似度为56％；同时blastn 比对发现α亚基(aceA)和β亚基(aceB)的核苷酸也是全新的基因。

SEQ ID NO.1:

ATGATCACTTCTCCATACCAGTGTCGAGACCACTCAACCGACTGGCTGGAC TACTTCTACGATCGGCGCGGTGCTGAGATCGCGTCCATGGTCACCCCGGAG CTCCTCGAAGAACACCGGCGAAACAGCGATCAGAGCAAGGGGCACCATAG CCCAGAGCTCCATATCATCCTCAACTTCTTTCGGATGGCGCCGATCATCGGC AAGGAATTCGTCTATGCGGAGACGCCCTACGACACCTACCGGATCGGCCGG GTCACTGCTCGATACACGGAGCCAGAGGTCATCAGCGACGAGCAGTACCC CTCTGAGCAGGACGCCATCCACCAGGTTTTCCTGAAGCGCCTGCGGAAGA TCGGCGTGGCCGTCTGAGGCCTCTCCCGGATTCTCTCAAAGACTCGATTTT AAGGATTTAAACATGAACTATATTCCGGTCAAGGGCTATTGCGACCGCCCC AACGTCTTTCCCGGGGACACCCTCGATTTCCATGTCTCGAGCGATCTGCCC GGGATGTATCGGGCCGAACTCGTGCGTCTGTTCAACGGCGATCTGAACCCC GCGGGTCCGGGCGCGGCTGAAGTCAGCGTTCCCTCGAACGTCGAGGGCGA GTATCCAGCACGCCAGCAGCGCACTCAAGTCGGCGGTTACATCAGCATTCC CGACGGAGCATCGAACCTCGCGGGGCTGGAGAGCATGACCGTTCACGCTT TCATCAGCGCGATGATCCCCGGCGGCGGTGTGCAGACGGTGATCTCCCGTT GGGACGATGCTCGGCAGGAGGGCTGGGCTCTGGTGGTGAACGCCGACGGC AATCTCGAGTTTCGCGTCGGAGACGGGGATGGAGAGGTCGACGTGGTGGT CTCCGACCGGCCGCTCTTCCCGGACACCTTCTACTCCGTGACGGCGGTGAT CGATCGCGAGGGCGGCGAACTGAGACTCGCGCAGTCCTCGGTTGTCAACAGCACCAACAGCCGCTTCGGCAAGGTCGTTCCGATCGACTCCGATTTCCGCG GATCCTCACGTATTCTCCTGCCTGCGAAGGCGTCTCGGGTACCGGTGATCAT CGCAGGTATGGCCGAGAGCGCTTCCTCCGACCGGACCTGGGTGGTGAACA ACTTCAACGGCAAGATCGACGCGCCGGCCGTGTACCGTGGCGCAGCGACC GACGAGGACCTGCTGCTCCTCGACGAGGGCGCTCAGCCGAGGCATCTCCC TGCGCTCGCTCGTTGGGACTTCTCGCACGGATTCACCAAGCGCGGCATTCC GACAGATCGCATCGAGGACGTCTCCGGTCGCGGCATGCACGGATCCTGCGT CAACCAGCCGGATCTCGGCATGACCGGCTGGAACTGGCGCGGAACAGAGG AGGTCTTCAAGTACTGTCCGGAGGAATACGGTGCGATCTGGTTCCACTCCG ACTCTCTGGACGACAGCAGGTGGGATCGCGACTTCACCTTGAACATTCCAG AGGATCTTCCGAGCGGCTGCTACGCGGTGAAGGTCACCCAGGGTGAGTTC AGCGATTACATCCCGTTCTTCTCCCGTCCTCCGAGGGGAACCGCGACTTCG AAGGCTCTGCTGCTGATCCCGACGATGAGCTACCTTGCATATGCGAACACG CAGGTGATGCAGAATGCGCCGTCGGCGCAGGCGGTCAAGGGCCATGTCGC CGTGCTCGAGGCCACCGACCTCGAGCTCAACCTCAACACGCAGATCTACG GTCTATCCACCTACGACTACCATGTGGACGGGCGCGGTTGCCAGTACACCT CGTGGCGACGGCCGATCCTCAATATGCGTCCTCGATACCGTCACGAGTTCG GGTCGGTCTGGCAGTTTCCGGCTGATCTCCATCTCGTGGACTGGATGCACG CGCAGGGCATCGACGTCGACATCGCCACGGACCACGATCTCGCGGCCGAG GGGGAAGATCTGCTCTCGCGATACAACGTGGTCGTGACGGGCACGCACCC GGAGTACTACACGCGCGAGATGATCGACGCATGGGAGGACTACCTCTCGCA CGGCGGACGCGGTATGTACCTGGCAGGGAACGGAATGTACTGGATCGCCTC CGTGCACCCGGAGAAGCCGTGGCTTGCGGAGATCCGCAAGGGCGAGGTCG GAGATCAACCGTGGCGTGCGCGGCCCGGTGAGATGTACCACAGCACCAGC GGCGAGCGAGGCGGCCTCTGGCGGATGCGGGCTCGCTCGACGGCCAAGGT GTGGGGCGTGGTCTACACGTCGCACGGCATGGATGCCTCCACCGGGTTCAA TCAGCTGCCGGACTCCCGTCAGCCCGAGCTCGCCTGGATGTTCGAGGGCAT CGGCGCAGACGAGGTGATCGGCGACTTCGGTCTGGTCGGTGGTGGTGCGGCCGGCCTTGAGGTGGATCGCTACGACCAGTCTCTCGGCACGCCCCCGCACA CGCAGCTGCTCGCCAGCTCGTACGGTCATACCCCGAACTGGGCCCTCGTGC CGGAGGATCAGTACTGCGCGCATTCGGGCATGAACGGGCCGGAGCATCCG CTCGTCCGCGGGGACATCACGTACTTCACGACGGCGGAGGGCGGTGCGAT GTTCGCCGCACCGTCGATGTCGTGGTGCGCGAGCCTGTCCTGGAACGACTA CCAGAACAACGTCTCTCGGCTCACGGCCAATGTGCTGAAGCGCTTCGCCC GGGACGAGCCCATGGACGAGATCATCGGCTGA SEQ ID NO.2(其中斜体部分为蛋白AceA和蛋白AceB中间序列)

MITSPYQCRDHSTDWLDYFYDRRGAEIASMVTPELLEEHRRNSDQSKGHHSP ELHIILNFFRMAPIIGKEFVYAETPYDTYRIGRVTARYTEPEVISDEQYPSEQDAI HQVFLKRLRKIGVAV*GLSRILSKTRF*GFK*MNYIPVKGYCDRPNVFPGDTLD FHVSSDLPGMYRAELVRLFNGDLNPAGPGAAEVSVPSNVEGEYPARQQRTQVGGYISIPDGASNLAGLESMTVHAFISAMIPGGGVQTVISRWDDARQEGWALV VNADGNLEFRVGDGDGEVDVVVSDRPLFPDTFYSVTAVIDREGGELRLAQSS VVNSTNSRFGKVVPIDSDFRGSSRILLPAKASRVPVIIAGMAESASSDRTWVVN NFNGKIDAPAVYRGAATDEDLLLLDEGAQPRHLPALARWDFSHGFTKRGIPTD RIEDVSGRGMHGSCVNQPDLGMTGWNWRGTEEVFKYCPEEYGAIWFHSDSL DDSRWDRDFTLNIPEDLPSGCYAVKVTQGEFSDYIPFFSRPPRGTATSKALLLIP TMSYLAYANTQVMQNAPSAQAVKGHVAVLEATDLELNLNTQIYGLSTYDYH VDGRGCQYTSWRRPILNMRPRYRHEFGSVWQFPADLHLVDWMHAQGIDVDI ATDHDLAAEGEDLLSRYNVVVTGTHPEYYTREMIDAWEDYLSHGGRGMYLA GNGMYWIASVHPEKPWLAEIRKGEVGDQPWRARPGEMYHSTSGERGGLWR MRARSTAKVWGVVYTSHGMDASTGFNQLPDSRQPELAWMFEGIGADEVIGD FGLVGGGAAGLEVDRYDQSLGTPPHTQLLASSYGHTPNWALVPEDQYCAHSG MNGPEHPLVRGDITYFTTAEGGAMFAAPSMSWCASLSWNDYQNNVSRLTAN VLKRFARDEPMDEIIG*

SEQ ID NO.3

MITSPYQCRDHSTDWLDYFYDRRGAEIASMVTPELLEEHRRNSDQSKGHHSP ELHIILNFFRMAPIIGKEFVYAETPYDTYRIGRVTARYTEPEVISDEQYPSEQDAI HQVFLKRLRKIGVAV*

SEQ ID NO.4

MNYIPVKGYCDRPNVFPGDTLDFHVSSDLPGMYRAELVRLFNGDLNPAGPGA AEVSVPSNVEGEYPARQQRTQVGGYISIPDGASNLAGLESMTVHAFISAMIPG GGVQTVISRWDDARQEGWALVVNADGNLEFRVGDGDGEVDVVVSDRPLFPD TFYSVTAVIDREGGELRLAQSSVVNSTNSRFGKVVPIDSDFRGSSRILLPAKASR VPVIIAGMAESASSDRTWVVNNFNGKIDAPAVYRGAATDEDLLLLDEGAQPR HLPALARWDFSHGFTKRGIPTDRIEDVSGRGMHGSCVNQPDLGMTGWNWRG TEEVFKYCPEEYGAIWFHSDSLDDSRWDRDFTLNIPEDLPSGCYAVKVTQGEFSDYIPFFSRPPRGTATSKALLLIPTMSYLAYANTQVMQNAPSAQAVKGHVAVLE ATDLELNLNTQIYGLSTYDYHVDGRGCQYTSWRRPILNMRPRYRHEFGSVW QFPADLHLVDWMHAQGIDVDIATDHDLAAEGEDLLSRYNVVVTGTHPEYYT REMIDAWEDYLSHGGRGMYLAGNGMYWIASVHPEKPWLAEIRKGEVGDQP WRARPGEMYHSTSGERGGLWRMRARSTAKVWGVVYTSHGMDASTGFNQLP DSRQPELAWMFEGIGADEVIGDFGLVGGGAAGLEVDRYDQSLGTPPHTQLLA SSYGHTPNWALVPEDQYCAHSGMNGPEHPLVRGDITYFTTAEGGAMFAAPSM SWCASLSWNDYQNNVSRLTANVLKRFARDEPMDEIIG*

实施例3

啶虫脒酰胺酶基因aceAB在大肠杆菌(DE3)(pET-29a(+))中的高效表达

挑取实施例2中的阳性克隆子提取的质粒转化到表达宿主菌(DE3)，将重组 质粒pET-29a-aceAB导入大肠杆菌(DE3)中，获得重组的基因工程菌株 BL-29-aceAB，将重组的基因工程菌株在含有50mg·L^-1Km的LB平板上划线， 37℃培养，挑取单菌落接种于LB试管中(50mg·L^-1Km)，37℃，180rpm振荡培 养16h。然后按体积比1％的接种量接种于100mL的LB培养基中(50mg·L^-1 Km)，37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。吸取1mL未经诱导的菌液，离心收集菌体，存于-20℃冰箱待用。向剩余菌液中加入IPTG至终浓度为1 mmol·L^-1，于16℃，150rpm低温诱导10h。每隔2h吸取1mL菌液，离心收集 菌体，-20℃保存待用。所有样品经后续处理后，用SDS-PAGE电泳检测诱导出 蛋白。

重组菌株BL-29-aceAB经IPTG诱导表达啶虫脒酰胺酶AceAB，经多次试 验发现IPTG浓度为0.5mM，16℃诱导10h时效果最好。诱导后收集菌体进行 破碎得粗酶液，利用Ni-NTA柱纯化粗酶液(咪唑浓度依次为50、100、150、 200、250、300、350、400、450和500mM)进行梯度洗脱，收集洗脱液)，纯 化后蛋白的SDS-PAGE如图9所示，图9中1～7条带是用不同浓度的咪唑进行 洗脱，在300mM的咪唑洗脱液中，目的条带单一且浓度较高，说明AceAB与 Ni-NTA柱结合较好，所得的目的蛋白纯度很高。将300mM咪唑的洗脱液收集， 在4℃，20mM PBS(pH 7.4)缓冲液中透析过夜以去除咪唑。

实施例4

酰胺酶AceAB对啶虫脒的降解和转化以及代谢产物的确定

20mL含26.94μmol啶虫脒的20mM PBS(pH 7.4)缓冲液中，反应酶量(实 施例3中300mM咪唑洗脱液透析纯化所得)1mL，于37℃反应30h，高效液 相色谱检测降解情况，并通过MS-MS测定反应液中的代谢产物。

高效液相色谱法(HPLC)检测方法：将待测的液体中加入等体积的二氯甲 烷，剧烈震荡5～10min，静置分层，吸取下层有机相，加入过量的无水硫酸钠去 除残余水分。制备的样品吸取1.0mL至干净的1.5mL离心管中，放置于通风橱 中待溶剂挥发。加入1.0mL甲醇进行溶解，用0.22μm的有机相滤器进行杂质 过滤，获得液相样品。液相色谱条件：液相色谱仪型号为岛津RID-10A；液相色 谱柱为C18反相柱，规格为250mm×4.6mm×5μm；流动相为甲醇∶H₂O(60∶ 40)；柱温为40℃；流速为1.0mL·min^-1；检测波长为235nm和260nm。

MS-MS检测方法：检测仪器为Finnigan TSQ Quantum Ultra AM(Thermal，U.S.A.)，采用电喷雾形式离子化，阴离子质谱检测，质量扫描范围(m/z)：30～400， 通过二级质谱检测特征碎片峰。

高效液相色谱检测结果如图10所示，啶虫脒降解率达99％以上，说明酰胺 酶AceAB能够降解啶虫脒。

MS-MS鉴定结果如图11所示，说明酰胺酶AceAB可以将啶虫脒转化成 IM1-4，代谢途径为啶虫脒C-N键断裂生成1-(6-氯吡啶基-3-甲基)-N-甲基甲胺 (IM1-4)，降解反应途径见图12。

此外，对实施例3纯化后的酰胺酶AceAB重新进行SDS-PAGE电泳，从电 泳图谱中(图13)可以观察到，纯化后的AceAB包含两个条带，一个为aceA 编码的蛋白，大小约为14.5kDa；另一条为aceB编码的蛋白，大小约为84kDa。 并且对的α和β亚基分别表达和纯化，并按照本实施例上述方法测定其对啶虫脒 的降解情况，结果表明当α和β亚基分别表达时，两个亚基表达的蛋白都是没有 啶虫脒降解活性的，即使将两个亚基表达后的蛋白混合在一起也还是没有啶虫脒 降解活性，必须α和β亚基一起表达后的蛋白才具有降解活性。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种啶虫脒酰胺酶基因aceAB及其编码蛋白质及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2713

<212> DNA

<213> Pigmentiphaga(Pigmentiphaga)

<400> 1

atgatcactt ctccatacca gtgtcgagac cactcaaccg actggctgga ctacttctac 60

gatcggcgcg gtgctgagat cgcgtccatg gtcaccccgg agctcctcga agaacaccgg 120

cgaaacagcg atcagagcaa ggggcaccat agcccagagc tccatatcat cctcaacttc 180

tttcggatgg cgccgatcat cggcaaggaa ttcgtctatg cggagacgcc ctacgacacc 240

taccggatcg gccgggtcac tgctcgatac acggagccag aggtcatcag cgacgagcag 300

tacccctctg agcaggacgc catccaccag gttttcctga agcgcctgcg gaagatcggc 360

gtggccgtct gaggcctctc ccggattctc tcaaagactc gattttaagg atttaaacat 420

gaactatatt ccggtcaagg gctattgcga ccgccccaac gtctttcccg gggacaccct 480

cgatttccat gtctcgagcg atctgcccgg gatgtatcgg gccgaactcg tgcgtctgtt 540

caacggcgat ctgaaccccg cgggtccggg cgcggctgaa gtcagcgttc cctcgaacgt 600

cgagggcgag tatccagcac gccagcagcg cactcaagtc ggcggttaca tcagcattcc 660

cgacggagca tcgaacctcg cggggctgga gagcatgacc gttcacgctt tcatcagcgc 720

gatgatcccc ggcggcggtg tgcagacggt gatctcccgt tgggacgatg ctcggcagga 780

gggctgggct ctggtggtga acgccgacgg caatctcgag tttcgcgtcg gagacgggga 840

tggagaggtc gacgtggtgg tctccgaccg gccgctcttc ccggacacct tctactccgt 900

gacggcggtg atcgatcgcg agggcggcga actgagactc gcgcagtcct cggttgtcaa 960

cagcaccaac agccgcttcg gcaaggtcgt tccgatcgac tccgatttcc gcggatcctc 1020

acgtattctc ctgcctgcga aggcgtctcg ggtaccggtg atcatcgcag gtatggccga 1080

gagcgcttcc tccgaccgga cctgggtggt gaacaacttc aacggcaaga tcgacgcgcc 1140

ggccgtgtac cgtggcgcag cgaccgacga ggacctgctg ctcctcgacg agggcgctca 1200

gccgaggcat ctccctgcgc tcgctcgttg ggacttctcg cacggattca ccaagcgcgg 1260

cattccgaca gatcgcatcg aggacgtctc cggtcgcggc atgcacggat cctgcgtcaa 1320

ccagccggat ctcggcatga ccggctggaa ctggcgcgga acagaggagg tcttcaagta 1380

ctgtccggag gaatacggtg cgatctggtt ccactccgac tctctggacg acagcaggtg 1440

ggatcgcgac ttcaccttga acattccaga ggatcttccg agcggctgct acgcggtgaa 1500

ggtcacccag ggtgagttca gcgattacat cccgttcttc tcccgtcctc cgaggggaac 1560

cgcgacttcg aaggctctgc tgctgatccc gacgatgagc taccttgcat atgcgaacac 1620

gcaggtgatg cagaatgcgc cgtcggcgca ggcggtcaag ggccatgtcg ccgtgctcga 1680

ggccaccgac ctcgagctca acctcaacac gcagatctac ggtctatcca cctacgacta 1740

ccatgtggac gggcgcggtt gccagtacac ctcgtggcga cggccgatcc tcaatatgcg 1800

tcctcgatac cgtcacgagt tcgggtcggt ctggcagttt ccggctgatc tccatctcgt 1860

ggactggatg cacgcgcagg gcatcgacgt cgacatcgcc acggaccacg atctcgcggc 1920

cgagggggaa gatctgctct cgcgatacaa cgtggtcgtg acgggcacgc acccggagta 1980

ctacacgcgc gagatgatcg acgcatggga ggactacctc tcgcacggcg gacgcggtat 2040

gtacctggca gggaacggaa tgtactggat cgcctccgtg cacccggaga agccgtggct 2100

tgcggagatc cgcaagggcg aggtcggaga tcaaccgtgg cgtgcgcggc ccggtgagat 2160

gtaccacagc accagcggcg agcgaggcgg cctctggcgg atgcgggctc gctcgacggc 2220

caaggtgtgg ggcgtggtct acacgtcgca cggcatggat gcctccaccg ggttcaatca 2280

gctgccggac tcccgtcagc ccgagctcgc ctggatgttc gagggcatcg gcgcagacga 2340

ggtgatcggc gacttcggtc tggtcggtgg tggtgcggcc ggccttgagg tggatcgcta 2400

cgaccagtct ctcggcacgc ccccgcacac gcagctgctc gccagctcgt acggtcatac 2460

cccgaactgg gccctcgtgc cggaggatca gtactgcgcg cattcgggca tgaacgggcc 2520

ggagcatccg ctcgtccgcg gggacatcac gtacttcacg acggcggagg gcggtgcgat 2580

gttcgccgca ccgtcgatgt cgtggtgcgc gagcctgtcc tggaacgact accagaacaa 2640

cgtctctcgg ctcacggcca atgtgctgaa gcgcttcgcc cgggacgagc ccatggacga 2700

gatcatcggc tga 2713

<210> 2

<211> 901

<212> PRT

<213> Pigmentiphaga(Pigmentiphaga)

<400> 2

Met Ile Thr Ser Pro Tyr Gln Cys Arg Asp His Ser Thr Asp Trp Leu

1 5 10 15

Asp Tyr Phe Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Glu Ile Ala Ser Met Val Thr

20 25 30

Pro Glu Leu Leu Glu Glu His Arg Arg Asn Ser Asp Gln Ser Lys Gly

35 40 45

His His Ser Pro Glu Leu His Ile Ile Leu Asn Phe Phe Arg Met Ala

50 55 60

Pro Ile Ile Gly Lys Glu Phe Val Tyr Ala Glu Thr Pro Tyr Asp Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Ile Gly Arg Val Thr Ala Arg Tyr Thr Glu Pro Glu Val Ile

85 90 95

Ser Asp Glu Gln Tyr Pro Ser Glu Gln Asp Ala Ile His Gln Val Phe

100 105 110

Leu Lys Arg Leu Arg Lys Ile Gly Val Ala Val Gly Leu Ser Arg Ile

115 120 125

Leu Ser Lys Thr Arg Phe Gly Phe Lys Met Asn Tyr Ile Pro Val Lys

130 135 140

Gly Tyr Cys Asp Arg Pro Asn Val Phe Pro Gly Asp Thr Leu Asp Phe

145 150 155 160

His Val Ser Ser Asp Leu Pro Gly Met Tyr Arg Ala Glu Leu Val Arg

165 170 175

Leu Phe Asn Gly Asp Leu Asn Pro Ala Gly Pro Gly Ala Ala Glu Val

180 185 190

Ser Val Pro Ser Asn Val Glu Gly Glu Tyr Pro Ala Arg Gln Gln Arg

195 200 205

Thr Gln Val Gly Gly Tyr Ile Ser Ile Pro Asp Gly Ala Ser Asn Leu

210 215 220

Ala Gly Leu Glu Ser Met Thr Val His Ala Phe Ile Ser Ala Met Ile

225 230 235 240

Pro Gly Gly Gly Val Gln Thr Val Ile Ser Arg Trp Asp Asp Ala Arg

245 250 255

Gln Glu Gly Trp Ala Leu Val Val Asn Ala Asp Gly Asn Leu Glu Phe

260 265 270

Arg Val Gly Asp Gly Asp Gly Glu Val Asp Val Val Val Ser Asp Arg

275 280 285

Pro Leu Phe Pro Asp Thr Phe Tyr Ser Val Thr Ala Val Ile Asp Arg

290 295 300

Glu Gly Gly Glu Leu Arg Leu Ala Gln Ser Ser Val Val Asn Ser Thr

305 310 315 320

Asn Ser Arg Phe Gly Lys Val Val Pro Ile Asp Ser Asp Phe Arg Gly

325 330 335

Ser Ser Arg Ile Leu Leu Pro Ala Lys Ala Ser Arg Val Pro Val Ile

340 345 350

Ile Ala Gly Met Ala Glu Ser Ala Ser Ser Asp Arg Thr Trp Val Val

355 360 365

Asn Asn Phe Asn Gly Lys Ile Asp Ala Pro Ala Val Tyr Arg Gly Ala

370 375 380

Ala Thr Asp Glu Asp Leu Leu Leu Leu Asp Glu Gly Ala Gln Pro Arg

385 390 395 400

His Leu Pro Ala Leu Ala Arg Trp Asp Phe Ser His Gly Phe Thr Lys

405 410 415

Arg Gly Ile Pro Thr Asp Arg Ile Glu Asp Val Ser Gly Arg Gly Met

420 425 430

His Gly Ser Cys Val Asn Gln Pro Asp Leu Gly Met Thr Gly Trp Asn

435 440 445

Trp Arg Gly Thr Glu Glu Val Phe Lys Tyr Cys Pro Glu Glu Tyr Gly

450 455 460

Ala Ile Trp Phe His Ser Asp Ser Leu Asp Asp Ser Arg Trp Asp Arg

465 470 475 480

Asp Phe Thr Leu Asn Ile Pro Glu Asp Leu Pro Ser Gly Cys Tyr Ala

485 490 495

Val Lys Val Thr Gln Gly Glu Phe Ser Asp Tyr Ile Pro Phe Phe Ser

500 505 510

Arg Pro Pro Arg Gly Thr Ala Thr Ser Lys Ala Leu Leu Leu Ile Pro

515 520 525

Thr Met Ser Tyr Leu Ala Tyr Ala Asn Thr Gln Val Met Gln Asn Ala

530 535 540

Pro Ser Ala Gln Ala Val Lys Gly His Val Ala Val Leu Glu Ala Thr

545 550 555 560

Asp Leu Glu Leu Asn Leu Asn Thr Gln Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Tyr

565 570 575

Asp Tyr His Val Asp Gly Arg Gly Cys Gln Tyr Thr Ser Trp Arg Arg

580 585 590

Pro Ile Leu Asn Met Arg Pro Arg Tyr Arg His Glu Phe Gly Ser Val

595 600 605

Trp Gln Phe Pro Ala Asp Leu His Leu Val Asp Trp Met His Ala Gln

610 615 620

Gly Ile Asp Val Asp Ile Ala Thr Asp His Asp Leu Ala Ala Glu Gly

625 630 635 640

Glu Asp Leu Leu Ser Arg Tyr Asn Val Val Val Thr Gly Thr His Pro

645 650 655

Glu Tyr Tyr Thr Arg Glu Met Ile Asp Ala Trp Glu Asp Tyr Leu Ser

660 665 670

His Gly Gly Arg Gly Met Tyr Leu Ala Gly Asn Gly Met Tyr Trp Ile

675 680 685

Ala Ser Val His Pro Glu Lys Pro Trp Leu Ala Glu Ile Arg Lys Gly

690 695 700

Glu Val Gly Asp Gln Pro Trp Arg Ala Arg Pro Gly Glu Met Tyr His

705 710 715 720

Ser Thr Ser Gly Glu Arg Gly Gly Leu Trp Arg Met Arg Ala Arg Ser

725 730 735

Thr Ala Lys Val Trp Gly Val Val Tyr Thr Ser His Gly Met Asp Ala

740 745 750

Ser Thr Gly Phe Asn Gln Leu Pro Asp Ser Arg Gln Pro Glu Leu Ala

755 760 765

Trp Met Phe Glu Gly Ile Gly Ala Asp Glu Val Ile Gly Asp Phe Gly

770 775 780

Leu Val Gly Gly Gly Ala Ala Gly Leu Glu Val Asp Arg Tyr Asp Gln

785 790 795 800

Ser Leu Gly Thr Pro Pro His Thr Gln Leu Leu Ala Ser Ser Tyr Gly

805 810 815

His Thr Pro Asn Trp Ala Leu Val Pro Glu Asp Gln Tyr Cys Ala His

820 825 830

Ser Gly Met Asn Gly Pro Glu His Pro Leu Val Arg Gly Asp Ile Thr

835 840 845

Tyr Phe Thr Thr Ala Glu Gly Gly Ala Met Phe Ala Ala Pro Ser Met

850 855 860

Ser Trp Cys Ala Ser Leu Ser Trp Asn Asp Tyr Gln Asn Asn Val Ser

865 870 875 880

Arg Leu Thr Ala Asn Val Leu Lys Arg Phe Ala Arg Asp Glu Pro Met

885 890 895

Asp Glu Ile Ile Gly

900

<210> 3

<211> 123

<212> PRT

<213> Pigmentiphaga(Pigmentiphaga)

<400> 3

Met Ile Thr Ser Pro Tyr Gln Cys Arg Asp His Ser Thr Asp Trp Leu

1 5 10 15

Asp Tyr Phe Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Glu Ile Ala Ser Met Val Thr

20 25 30

Pro Glu Leu Leu Glu Glu His Arg Arg Asn Ser Asp Gln Ser Lys Gly

35 40 45

His His Ser Pro Glu Leu His Ile Ile Leu Asn Phe Phe Arg Met Ala

50 55 60

Pro Ile Ile Gly Lys Glu Phe Val Tyr Ala Glu Thr Pro Tyr Asp Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Ile Gly Arg Val Thr Ala Arg Tyr Thr Glu Pro Glu Val Ile

85 90 95

Ser Asp Glu Gln Tyr Pro Ser Glu Gln Asp Ala Ile His Gln Val Phe

100 105 110

Leu Lys Arg Leu Arg Lys Ile Gly Val Ala Val

115 120

<210> 4

<211> 764

<212> PRT

<213> Pigmentiphaga(Pigmentiphaga)

<400> 4

Met Asn Tyr Ile Pro Val Lys Gly Tyr Cys Asp Arg Pro Asn Val Phe

1 5 10 15

Pro Gly Asp Thr Leu Asp Phe His Val Ser Ser Asp Leu Pro Gly Met

20 25 30

Tyr Arg Ala Glu Leu Val Arg Leu Phe Asn Gly Asp Leu Asn Pro Ala

35 40 45

Gly Pro Gly Ala Ala Glu Val Ser Val Pro Ser Asn Val Glu Gly Glu

50 55 60

Tyr Pro Ala Arg Gln Gln Arg Thr Gln Val Gly Gly Tyr Ile Ser Ile

65 70 75 80

Pro Asp Gly Ala Ser Asn Leu Ala Gly Leu Glu Ser Met Thr Val His

85 90 95

Ala Phe Ile Ser Ala Met Ile Pro Gly Gly Gly Val Gln Thr Val Ile

100 105 110

Ser Arg Trp Asp Asp Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ala Leu Val Val Asn

115 120 125

Ala Asp Gly Asn Leu Glu Phe Arg Val Gly Asp Gly Asp Gly Glu Val

130 135 140

Asp Val Val Val Ser Asp Arg Pro Leu Phe Pro Asp Thr Phe Tyr Ser

145 150 155 160

Val Thr Ala Val Ile Asp Arg Glu Gly Gly Glu Leu Arg Leu Ala Gln

165 170 175

Ser Ser Val Val Asn Ser Thr Asn Ser Arg Phe Gly Lys Val Val Pro

180 185 190

Ile Asp Ser Asp Phe Arg Gly Ser Ser Arg Ile Leu Leu Pro Ala Lys

195 200 205

Ala Ser Arg Val Pro Val Ile Ile Ala Gly Met Ala Glu Ser Ala Ser

210 215 220

Ser Asp Arg Thr Trp Val Val Asn Asn Phe Asn Gly Lys Ile Asp Ala

225 230 235 240

Pro Ala Val Tyr Arg Gly Ala Ala Thr Asp Glu Asp Leu Leu Leu Leu

245 250 255

Asp Glu Gly Ala Gln Pro Arg His Leu Pro Ala Leu Ala Arg Trp Asp

260 265 270

Phe Ser His Gly Phe Thr Lys Arg Gly Ile Pro Thr Asp Arg Ile Glu

275 280 285

Asp Val Ser Gly Arg Gly Met His Gly Ser Cys Val Asn Gln Pro Asp

290 295 300

Leu Gly Met Thr Gly Trp Asn Trp Arg Gly Thr Glu Glu Val Phe Lys

305 310 315 320

Tyr Cys Pro Glu Glu Tyr Gly Ala Ile Trp Phe His Ser Asp Ser Leu

325 330 335

Asp Asp Ser Arg Trp Asp Arg Asp Phe Thr Leu Asn Ile Pro Glu Asp

340 345 350

Leu Pro Ser Gly Cys Tyr Ala Val Lys Val Thr Gln Gly Glu Phe Ser

355 360 365

Asp Tyr Ile Pro Phe Phe Ser Arg Pro Pro Arg Gly Thr Ala Thr Ser

370 375 380

Lys Ala Leu Leu Leu Ile Pro Thr Met Ser Tyr Leu Ala Tyr Ala Asn

385 390 395 400

Thr Gln Val Met Gln Asn Ala Pro Ser Ala Gln Ala Val Lys Gly His

405 410 415

Val Ala Val Leu Glu Ala Thr Asp Leu Glu Leu Asn Leu Asn Thr Gln

420 425 430

Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Tyr Asp Tyr His Val Asp Gly Arg Gly Cys

435 440 445

Gln Tyr Thr Ser Trp Arg Arg Pro Ile Leu Asn Met Arg Pro Arg Tyr

450 455 460

Arg His Glu Phe Gly Ser Val Trp Gln Phe Pro Ala Asp Leu His Leu

465 470 475 480

Val Asp Trp Met His Ala Gln Gly Ile Asp Val Asp Ile Ala Thr Asp

485 490 495

His Asp Leu Ala Ala Glu Gly Glu Asp Leu Leu Ser Arg Tyr Asn Val

500 505 510

Val Val Thr Gly Thr His Pro Glu Tyr Tyr Thr Arg Glu Met Ile Asp

515 520 525

Ala Trp Glu Asp Tyr Leu Ser His Gly Gly Arg Gly Met Tyr Leu Ala

530 535 540

Gly Asn Gly Met Tyr Trp Ile Ala Ser Val His Pro Glu Lys Pro Trp

545 550 555 560

Leu Ala Glu Ile Arg Lys Gly Glu Val Gly Asp Gln Pro Trp Arg Ala

565 570 575

Arg Pro Gly Glu Met Tyr His Ser Thr Ser Gly Glu Arg Gly Gly Leu

580 585 590

Trp Arg Met Arg Ala Arg Ser Thr Ala Lys Val Trp Gly Val Val Tyr

595 600 605

Thr Ser His Gly Met Asp Ala Ser Thr Gly Phe Asn Gln Leu Pro Asp

610 615 620

Ser Arg Gln Pro Glu Leu Ala Trp Met Phe Glu Gly Ile Gly Ala Asp

625 630 635 640

Glu Val Ile Gly Asp Phe Gly Leu Val Gly Gly Gly Ala Ala Gly Leu

645 650 655

Glu Val Asp Arg Tyr Asp Gln Ser Leu Gly Thr Pro Pro His Thr Gln

660 665 670

Leu Leu Ala Ser Ser Tyr Gly His Thr Pro Asn Trp Ala Leu Val Pro

675 680 685

Glu Asp Gln Tyr Cys Ala His Ser Gly Met Asn Gly Pro Glu His Pro

690 695 700

Leu Val Arg Gly Asp Ile Thr Tyr Phe Thr Thr Ala Glu Gly Gly Ala

705 710 715 720

Met Phe Ala Ala Pro Ser Met Ser Trp Cys Ala Ser Leu Ser Trp Asn

725 730 735

Asp Tyr Gln Asn Asn Val Ser Arg Leu Thr Ala Asn Val Leu Lys Arg

740 745 750

Phe Ala Arg Asp Glu Pro Met Asp Glu Ile Ile Gly

755 760

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taagaaggag atatacatat gtcgtgccga tgcgcacgc 39

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtggtggtgg tggtgctcga ggccgatgat ctcgtccatg g 41

Claims (10)

1.一种啶虫脒酰胺酶基因aceAB，其特征在于，所述酰胺酶基因aceAB的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的啶虫脒酰胺酶基因aceAB，其特征在于，所述酰胺酶基因aceAB包括α亚基aceA和β亚基aceB，核苷酸序列SEQ ID NO.1的1-372位为aceA的核苷酸序列，419-2713位为aceB的核苷酸序列。

3.一种权利要求1或2所述的啶虫脒酰胺酶基因aceAB编码的酰胺酶AceAB，其特征在于，所述酰胺酶AceAB的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

4.根据权利要求3所述的酰胺酶AceAB，其特征在于，所述酰胺酶AceAB包括蛋白AceA和蛋白AceB，蛋白AceA由基因aceA编码，蛋白AceB由基因aceB编码，其氨基酸序列分别为SEQID NO.3和SEQ ID NO.4。

5.一种含有权利要求1所述的啶虫脒酰胺酶基因aceAB的重组表达载体pET-29a-aceAB。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体pET-29a-aceAB，其特征在于，所述重组表达载体pET-29a-aceAB由啶虫脒酰胺酶基因aceAB插入pET-29a(+)的Nde I和Xho I位点之间所得。

7.一种含有权利要求1所述的啶虫脒酰胺酶基因aceAB的基因工程菌。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是将权利要求5所述的重组载体pET-29a-aceAB导入大肠杆菌BL21(DE3)获得。

9.一种权利要求1所述的啶虫脒酰胺酶基因aceAB在降解和转化啶虫脒中的应用。

10.一种权利要求2所述的酰胺酶AceAB在降解和转化啶虫脒中的应用。