CN116144561B - 一种降解n,n-二甲基甲酰胺的大肠杆菌工程菌及其应用 - Google Patents

一种降解n,n-二甲基甲酰胺的大肠杆菌工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种降解N,N‑二甲基甲酰胺的大肠杆菌工程菌及其应用，属于生物工程领域，所述工程菌以大肠杆菌为出发菌株经过基因改造导入如SEQ ID NO.1所示的二甲基甲酰胺酶基因DMFase、如SEQ ID NO.4所示的二甲胺脱氢酶基因DMAase和如SEQ ID NO.7所示的甲胺脱氢酶基因MAase，同时敲除大肠杆菌的内源基因iclR和sdhAB，使不具备降解N,N‑二甲基甲酰胺的所述出发菌株能够降解N,N‑二甲基甲酰胺，同时生产琥珀酸。本发明提供的大肠杆菌工程菌能够以葡萄糖、甘油、木糖、纤维素水解液等常见碳源生长，为相关行业的N,N‑二甲基甲酰胺废水处理提供了新的方法。

Description

一种降解N,N-二甲基甲酰胺的大肠杆菌工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种降解N,N-二甲基甲酰胺的大肠杆菌工程菌及其应用。
背景技术
N,N-二甲基甲酰胺(简称DMF)是一种在自然界中不存在的人工化学品，于1893年首次合成。随后，由于N,N-二甲基甲酰胺与大多数有机液体和水都具有良好的混溶性，被誉为“万能溶剂”，被广泛应用于各种化学、制造和制药行业。2001年，全球N,N-二甲基甲酰胺消费量约为285,000公吨，且N,N-二甲基甲酰胺的需求还以3.5％的速率逐年增加。N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，在工业生产中被反复回收利用；其作为溶剂在生产和处理过程中几乎无化学消耗，最终成为了废弃物，进入废水。由于N,N-二甲基甲酰胺的化学结构稳定，难以被普通的生物淤泥降解；因此，相关行业排放的工业废水中仍含有N,N-二甲基甲酰胺，对环境产生一定危害。
N,N-二甲基甲酰胺经口腔、皮肤或吸入接触后很容易被吸收，对人类有肝毒性和致癌性。鉴于N,N-二甲基甲酰胺的广泛应用和毒性作用的严重程度，从工业废水中降解N,N-二甲基甲酰胺就显得十分必要。科研工作者探索了从废水中去除N,N-二甲基甲酰胺的物理和化学方法，包括蒸馏、吸收和吸附。然而，这些物理化学过程不仅不可持续、效率低下，还会产生二次污染。因此，提供一种能够持续、高效地降解N,N-二甲基甲酰胺，并且不会产生二次污染的新方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种降解N,N-二甲基甲酰胺的大肠杆菌工程菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明利用基因编辑技术，外源基因整合到大肠杆菌基因组，替换原来位置处的内源基因，获得的大肠杆菌工程菌能够表达异源的二甲基甲酰胺酶、二甲胺脱氢酶、甲胺脱氢酶，能以葡萄糖、甘油、木糖、纤维素水解液等常见碳源生长，降解N,N-二甲基甲酰胺，同时还可以发酵生产琥珀酸。本发明为相关行业的N,N-二甲基甲酰胺废水处理提供了新的方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种大肠杆菌工程菌，以大肠杆菌为出发菌株经过基因改造导入外源基因，使不具备降解N,N-二甲基甲酰胺的所述出发菌株能够降解N,N-二甲基甲酰胺；所述外源基因包括二甲基甲酰胺酶基因DMFase、二甲胺脱氢酶基因DMAase和甲胺脱氢酶基因MAase。
进一步地，所述二甲基甲酰胺酶基因DMFase的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述二甲胺脱氢酶基因DMAase的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述甲胺脱氢酶基因MAase的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述经过基因改造导入外源基因还包括敲除所述大肠杆菌的内源基因；所述内源基因包括乙醛酸途径抑制因子基因iclR和琥珀酸脱氢酶基因sdhAB。
本发明还提供一种所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)利用基因编辑技术，将包含二甲基甲酰胺酶基因的载体转入大肠杆菌，替换乙醛酸途径抑制因子基因iclR，构建大肠杆菌一代工程菌株EcEng1-DMF；
(2)利用基因编辑技术，将包含二甲胺脱氢酶基因的载体转入所述大肠杆菌一代工程菌株EcEng1-DMF，替换琥珀酸脱氢酶基因sdhAB，构建大肠杆菌二代工程菌株EcEng2-DMA；
(3)将包含甲胺脱氢酶基因的载体转入所述大肠杆菌二代工程菌株EcEng2-DMA，构建大肠杆菌三代工程菌株EcEng3-MA，获得大肠杆菌工程菌。
进一步地，在步骤(1)中，所述替换乙醛酸途径抑制因子基因iclR具体包括利用如SEQ ID NO.2所示的iclR左同源臂序列和如SEQ ID NO.3所示的iclR右同源臂序列，将包含二甲基甲酰胺酶基因的载体插入到乙醛酸途径抑制因子iclR的位置，同时敲除乙醛酸途径抑制因子iclR。
进一步地，在步骤(2)中，所述替换琥珀酸脱氢酶基因sdhAB具体包括利用如SEQID NO.5所示的sdhAB左同源臂序列和如SEQ ID NO.6所示的sdhAB右同源臂序列，将包含二甲胺脱氢酶基因的载体插入到琥珀酸脱氢酶基因sdhAB的位置，同时敲除琥珀酸脱氢酶基因sdhAB。
本发明还提供一种所述的大肠杆菌工程菌在降解N,N-二甲基甲酰胺中的应用。
进一步地，所述大肠杆菌工程菌在降解N,N-二甲基甲酰胺的同时生产琥珀酸。
本发明还提供一种降解N,N-二甲基甲酰胺同时生产琥珀酸的方法，将所述的大肠杆菌工程菌或其发酵液投入到含有N,N-二甲基甲酰胺的液体中，在30-37℃条件下发酵，降解N,N-二甲基甲酰胺同时生产琥珀酸。
进一步地，用于获得所述发酵液的培养基中包括甘油、葡萄糖、木糖或纤维素水解液。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以大肠杆菌为出发菌株，利用基因编辑CRISPR/Cas9技术介导的基因敲除及克隆筛选，将来源于嗜氨副球菌Paracoccus aminophilus JCM 7686的二甲基甲酰胺酶基因DMFase、二甲胺脱氢酶基因DMAase和甲胺脱氢酶基因MAase整合到大肠杆菌基因组，同时敲除大肠杆菌乙醛酸途径抑制因子基因iclR和琥珀酸脱氢酶基因sdhAB，以此构建大肠杆菌工程菌。经过基因改造，使改造后的菌株能够表达异源的二甲基甲酰胺酶、二甲胺脱氢酶、甲胺脱氢酶，使原先不具备N,N-二甲基甲酰胺降解能力的大肠杆菌，改造为可以高效降解N,N-二甲基甲酰胺的工程菌株。本发明获得的工程菌株能以葡萄糖、甘油、木糖、纤维素水解液等常见碳源生长，降解N,N-二甲基甲酰胺，同时还可以发酵生产琥珀酸。本发明为相关行业的N,N-二甲基甲酰胺废水处理提供了新的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中基因工程改造和菌株构建的流程图，其中A为N,N-二甲基甲酰胺的降解途径和降解步骤，B为琥珀酸生产的基因工程改造流程图；
图2为本发明实施例1-3中工程菌株BL-DMF、BL-DMA和BL-MA在以葡萄糖为碳源时，96小时内对应降解N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲胺(DMA)和甲胺(MA)的情况，从左到右不同颜色依次为：工程菌株BL-DMF发酵液中96小时内N,N-二甲基甲酰胺的浓度，工程菌株BL-DMA发酵液中96小时内二甲胺的浓度，工程菌株BL-MA发酵液中96小时内甲胺的浓度；
图3为本发明实施例3中大肠杆菌三代工程菌株EcEng3-MA在不同碳源下96小时内发酵情况；其中，A-D分别为以葡萄糖、甘油、木糖和纤维素水解酶为碳源时，发酵液中N,N-二甲基甲酰胺、二甲胺和甲胺的浓度，E为在不同碳源下96小时后发酵液中琥珀酸的含量(E)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
N,N-二甲基甲酰胺与大多数有机液体和水都具有良好的混溶性，被广泛用于化学工业中。因此，这些相关行业会产生大量的N,N-二甲基甲酰胺污水。N,N-二甲基甲酰胺对人类有肝毒性。由于其广泛应用，其毒性作用就变得严重。大肠杆菌作为重要的工业生产菌株，已被广泛应用于发酵行业和生物催化领域，生产各种生物酶，以及替代化学催化生产各种天然的或人工的化学品。然而由于大肠杆菌菌株不能降解N,N-二甲基甲酰胺，因此，本发明通过合成生物学和代谢工程改造，构建大肠杆菌工程菌，利用生物法降解N,N-二甲基甲酰胺，同时产生琥珀酸。具体的基因工程改造和菌株构建的流程如图1所示。
本发明是利用基因编辑CRISPR/Cas9技术介导的基因敲除及克隆筛选(Jiang etal.Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.2014,81:2506-2514.)，将外源基因整合到大肠杆菌基因组，同时敲除大肠杆菌乙醛酸途径抑制因子基因iclR和琥珀酸脱氢酶基因sdhAB，以此构建大肠杆菌工程菌。
本发明实施例中所述的二甲基甲酰胺酶基因DMFase、二甲胺脱氢酶基因DMAase和甲胺脱氢酶基因MAase均来源于嗜氨副球菌Paracoccus aminophilus JCM 7686。
实施例1在大肠杆菌中表达二甲基甲酰胺酶基因DMFase
1.DMFase基因表达载体pET22b-DMFase的构建
1)利用引物DMFase-F和DMFase-R，以嗜氨副球菌Paracoccus aminophilusJCM7686基因组为模板进行PCR扩增反应，扩增DMFase基因序列。
扩增引物：
DMFase-F(SEQ ID NO.8)：
5’-AAGGAGATATACATATGAATCAACGAAGAGAAAACTATG-3’；
DMFase-R(SEQ ID NO.9)：
5’-GGTGGTGGTGCTCGAGTGACCAGCGGCGCAGGTTC-3’。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；上下游引物(10μM each)各1.5μL；基因组模板(200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃60sec，运行30个循环；68℃5min。
扩增产物DMFase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2)以质粒pET22b(Novagen)为骨架构建表达载体，在已有质粒pET22b上，以限制性内切酶NdeI/XhoI进行双酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，将DMFase基因片段连入质粒，得到pET22b-DMFase表达载体。
2.转化大肠杆菌感受态
将表达载体pET22b-DMFase转化入大肠杆菌感受态BL21(DE3)，获得DMFase基因表达菌株BL-DMF。
3.构建插入质粒pTargetF-iclR-DMF，以及将DMFase表达框插入大肠杆菌基因组
1)靶向乙醛酸途径抑制因子基因iclR的gRNA的靶向位点(N20)的选择及其表达质粒的构建
通过在线工具(http://crispr.mit.edu/)，在乙醛酸途径抑制因子基因iclR序列中选择合适的N20序列，作为gRNA的位点。依据此N20序列和gRNA表达质粒pTargetF的序列，设计引物iclR-N20-F；依据质粒pTargetF的序列，设计引物TargetF-R，以原始质粒pTargetF为模板进行PCR扩增反应，扩增含有靶向iclR的新质粒的线性DNA片段。
扩增引物：
iclR-N20-F(SEQ ID NO.10)：
5’-AGCCCAACTGAGCGAAGAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’；
TargetF-R(SEQ ID NO.11)：
5’-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAG-3’。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；上下游引物(10μM each)各1.5μL；基因组模板(200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃60sec，运行30个循环；68℃5min。
将PCR扩增获得的线性DNA片段首尾自连，构建靶向iclR的gRNA的环形表达质粒pTargetF-iclR。
2)构建DMFase表达框
利用引物T7P-F和T7P-R，以pET22b-DMFase为模板，扩增包含T7启动子和终止子的完整的DMFase表达框。
T7P-F(SEQ ID NO.12)：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGTT-3’；
T7P-R(SEQ ID NO.13)：5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCC-3’。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；上下游引物(10μM each)各1.5μL；基因组模板(200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃90sec，运行30个循环；68℃5min。
3)扩增同源臂序列
以大肠杆菌基因组为模板，以引物对iclR-1/iclR-2和iclR-3/iclR-4依次扩增基因插入到乙醛酸途径抑制因子位置使用的iclR左同源臂序列和右同源臂。
扩增引物：
iclR-1(SEQ ID NO.14)：
5’-gagtcgacctgcagaagcttCCGACAGGGATTCCATCTGG-3’；
iclR-2(SEQ ID NO.15)：
5’-TATAGTGAGTCGTATTACAGTCTCTTTTTTCTGTATCGTGG-3’；
iclR-3(SEQ ID NO.16)：
5’-CTTGAGGGGTTTTTTGAGGCAATATTCTGCCCATCA-3’；
iclR-4(SEQ ID NO.17)：
5’-TGGAGCTGCACATGAACTCGAGTATGACGACCATTTTGTCTACAG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；上下游引物(10μM each)各1.5μL；基因组模板(200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
iclR左同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，iclR右同源臂核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
构建插入质粒pTargetF-iclR-DMF
以pTargetF-iclR为骨架构建插入质粒，在已有质粒pTargetF-iclR上，用限制性内切酶HindIII/XhoI进行双酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，将iclR左同源臂、DMFase表达框和iclR右同源臂三个DNA片段，顺序连入质粒pTargetF-iclR，得到插入质粒pTargetF-iclR-DMF。
5)构建大肠杆菌一代工程菌株
按照实验技术方案(Jiang et al.Multigene editing in the Escherichiacoli genome via the CRISPR-Cas9 system.2014,81:2506-2514.)，将插入质粒pTargetF-iclR-DMF转化大肠杆菌MG1655(DE3)，完成菌株筛选工作；最终获得无质粒、无抗性标记的、可表达DMFase，同时敲除乙醛酸途径抑制因子基因iclR的大肠杆菌一代工程菌株EcEng1-DMF。
实施例2在大肠杆菌中表达二甲胺脱氢酶基因DMAase
1.DMAase基因表达载体pET22b-DMAase的构建
1)DMAase序列较长，利用引物对DMAase-1/DMAase-2和DMAase-3/DMAase-4，以嗜氨副球菌Paracoccus aminophilus JCM 7686基因组为模板进行PCR扩增反应，将DMAase序列分成两个DNA片段进行扩增。
扩增引物：
DMAase-1(SEQ ID NO.18)：
5’-AAGGAGATATACATATGGCGAATTCGTGGCGCA-3’；
DMAase-2(SEQ ID NO.19)：
5’-CTCGACGACGATATGGCTGCC-3’；
DMAase-3(SEQ ID NO.20)：
5’-CATATCGTCGTCGAGATGAATGAC-3’；
DMAase-4(SEQ ID NO.21)：
5’-GGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTCTTCGGCCCACCAG-3’。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；上下游引物(10μM each)各1.5μL；基因组模板(200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃60sec，运行30个循环；68℃5min。
2)以质粒pET22b(Novagen)为骨架构建表达载体，在已有质粒pET22b上，以限制性内切酶NdeI/XhoI进行双酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，将扩增出来的DMFase序列的两个片段，顺序连入质粒，得到pET22b-DMAase表达载体。其中，DMAase的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.转化大肠杆菌感受态
将表达载体pET22b-DMAase转化入大肠杆菌感受态BL21(DE3)，获得DMAase基因表达菌株BL-DMA。
3.构建插入质粒pTargetF-sdhAB-DMA，以及将DMAase表达框插入大肠杆菌基因组
1)靶向琥珀酸脱氢酶基因sdhAB的gRNA的靶向位点(N20)的选择及其表达质粒的构建
通过在线工具(http://crispr.mit.edu/)，在琥珀酸脱氢酶基因sdhAB序列中选择合适的N20序列，作为gRNA的位点。依据此N20序列和gRNA表达质粒pTargetF的序列，设计引物sdhAB-N20-F，结合实施例1中的引物TargetF-R，以原始质粒pTargetF为模板，扩增含有靶向sdhAB的新质粒的线性DNA片段。
扩增引物：
sdhAB-N20-F(SEQ ID NO.22)：
5’-ACTCTGGCAGATACAGGGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’；
TargetF-R(SEQ ID NO.23)：
5’-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAG-3’。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；上下游引物(10μM each)各1.5μL；基因组模板(200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃60sec，运行30个循环；68℃5min。
将PCR扩增获得的线性DNA片段首尾自连，构建靶向sdhAB的gRNA的环形表达质粒pTargetF-sdhAB。
2)构建DMAase表达框
利用实施例1中的引物T7P-F和T7P-R，以pET22b-DMAase为模板扩增包含T7启动子和终止子的完整的DMAase表达框。扩增反应程序和反应体系与实施例1中构建DMFase表达框相同。
3)扩增同源臂序列
以大肠杆菌基因组为模板，以引物对sdhAB-1/sdhAB-2和sdhAB-3/sdhAB-4依次扩增基因插入到琥珀酸脱氢酶基因位置使用的sdhAB左同源臂和右同源臂。
扩增引物：
sdhAB-1(SEQ ID NO.24)：
5’-gagtcgacctgcagaagcttATCACGTCGTCGTAGGTATTCG-3’；
sdhAB-2(SEQ ID NO.25)：
5’-TATAGTGAGTCGTATTAACTGGCAATTTCATCACACACC-3’；
sdhAB-3(SEQ ID NO.26)：
5’-CTTGAGGGGTTTTTTGGCCTGATAAGACGCGCAAGC-3’；
sdhAB-4(SEQ ID NO.27)：
5’-TGGAGCTGCACATGAACTCGAGAGGTAACTGCTGGAACGTCGAA-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；上下游引物(10μM each)各1.5μL；基因组模板(200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
sdhAB左同源臂序列如SEQ ID NO.5所示，sdhAB右同源臂序列如SEQ ID NO.6所示。
4)构建插入质粒pTargetF-sdhAB-DMA
以pTargetF-sdhAB为骨架构建插入质粒，在已有质粒pTargetF-sdhAB上，用限制性内切酶HindIII/XhoI进行双酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，将sdhAB左同源臂、DMAase表达框和sdhAB右同源臂三个DNA片段，顺序连入质粒，得到插入质粒pTargetF-sdhAB-DMA。
5)构建大肠杆菌二代工程菌株
按照上实施例1的实验技术方案，将质粒pTargetF-sdhAB-DMA转化上述大肠杆菌一代工程菌株EcEng1-DMF，完成菌株筛选工作；最终获得无质粒、无抗性标记的、可表达DMFase和DMAase，同时敲除乙醛酸途径抑制因子基因iclR和琥珀酸脱氢酶基因sdhAB的大肠杆菌二代工程菌株EcEng2-DMA。
实施例3在大肠杆菌中表达甲胺脱氢酶基因MAase
1.MAase基因表达载体pET22b-MAase的构建
1)由于MAase基因序列较长，利用引物对MAase-1/MAase-2、MAase-3/MAase-4、MAase-5/MAase-6和MAase-7/MAase-8，以嗜氨副球菌Paracoccus aminophilus JCM7686基因组为模板，将DMFase序列分成四个片段扩增出来。
扩增引物：
MAase-1(SEQ ID NO.28)：
5’-AAGGAGATATACATATGGCATCCATCGATGAAGCC-3’；
MAase-2(SEQ ID NO.29)：5’-CCATTCTTCGCGCTTGTCGG-3’；
MAase-3(SEQ ID NO.30)：5’-GACAAGCGCGAAGAATGGACC-3’；
MAase-4(SEQ ID NO.31)：5’-TCATCGCGTCATCTTCTGCG-3’；
MAase-5(SEQ ID NO.32)：5’-CAGAAGATGACGCGATGACCT-3’；
MAase-6(SEQ ID NO.33)：5’-TTCCGGCGTGCTTTGATAGG-3’；
MAase-7(SEQ ID NO.34)：5’-TATCAAAGCACGCCGGAATTCTCG-3’；
MAase-8(SEQ ID NO.35)：
5’-GGTGGTGGTGCTCGAGTCAGGGGCGCACCCGCGT-3’。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；上下游引物(10μM each)各1.5μL；基因组模板(200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃60sec，运行30个循环；68℃5min。
2)以质粒pET22b(Novagen)为骨架构建表达载体，在已有质粒pET22b上，以限制性内切酶NdeI/XhoI进行双酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，将扩增的MAase序列的四个片段，顺序连入质粒，得到pET22b-MAase表达载体。其中，MAase的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.转化大肠杆菌感受态
将表达载体pET22b-MAase转化入大肠杆菌感受态BL21(DE3)，获得MAase基因表达的菌株BL-MA。
3.构建大肠杆菌三代工程菌株
将表达载体pET22b-MAase转化入大肠杆菌二代工程菌株EcEng2-DMA，最终获得可表达DMFase、DMAase和MAase，同时敲除乙醛酸途径抑制因子基因iclR和琥珀酸脱氢酶基因sdhAB的大肠杆菌三代工程菌株EcEng3-MA。
实施例4大肠杆菌基因工程菌的发酵
1.将实施例1-3获得的目的基因表达菌株BL-DMF、BL-DMA和BL-MA以及实施例3获得的大肠杆菌三代工程菌株EcEng3-MA，分别接种至LB培养基中，30-37℃、150-250rpm培养，至OD600处于0.2-1.0之间时，加入0.1-10mM诱导剂IPTG，继续培养12-48小时。
2.培养结束后，分别取出发酵液，以0.1％至5％的接种比例，转接到新鲜的基础培养基(M9培养基)中，进行二次培养。二次培养是以葡萄糖(浓度为4g/L)为碳源，在对实施例1-3不同目的基因表达菌株的发酵液二次培养时，对应添加等量的N,N-二甲基甲酰胺、二甲胺和甲胺(添加浓度均为125mM)，在30℃-37℃、150-250rpm条件下进行培养，每隔48小时取样一次，用于后续检测。
3.取步骤1中实施例3获得的大肠杆菌基因工程菌株EcEng3-MA发酵液，按照步骤2的方法，转接后分别以甘油、葡萄糖、木糖、纤维素水解液(具体参照Qiu etal.Constructing xylose-assimilating pathways in Pediococcus acidilactici forhigh titer D-lactic acid fermentation from corn stover feedstock.Bioresour.Technol.2017,245:1369–1376.)为碳源(碳源浓度为4g/L)，添加含有N,N-二甲基甲酰胺的皮革工业废水(使得发酵液中N,N-二甲基甲酰胺的最终浓度为50mM)进行二次培养，培养方法同步骤2。每隔24小时取样一次，用于后续检测。
实施例5大肠杆菌基因工程菌发酵液对N,N-二甲基甲酰胺的降解作用
1.N,N-二甲基甲酰胺及其降解产物的浓度测定
分别取实施例1中步骤2和步骤3获得的样品于离心管中，14000×g离心30min，吸取上清，测定N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲胺(DMA)和甲胺(MA)的含量。
采用Agilent ZORBAX SB-C18柱和紫外检测器的高效液相色谱法测定N,N-二甲基甲酰胺的浓度。流动相为15％甲醇水溶液，流速为1.0mL/min，检测波长为205nm，高效液相色谱柱工作在35℃。
二甲胺和甲胺使用丹酰氯进行衍生，衍生后再采用液相检测。在试管中加入0.5mL离心后的上清，1.5mL饱和碳酸氢钠溶液和1.0mL丙酮丹酰氯(5mg/mL)。混匀后，60℃孵育30分钟。接着，加入0.1mL谷氨酸钠溶液(50mg/mL)。再次混匀后，60℃孵育15分钟。然后用3.0mL乙醚提取混合物三次。每次提取时，向试管中加入3mL乙醚，震荡30秒，再3,600×g离心10分钟，抽吸醚层，将三次的醚提取物合并，置于抽风柜中蒸发至完全干燥(约12小时)。将干燥后的残渣溶解于1mL甲醇中，用ZORBAX SB-C18色谱柱和紫外检测器进行高效液相色谱分析。流动相为甲醇和去离子水，甲醇浓度在20分钟内从55％线性增加到100％，流速为1mL/min，检测波长为350nm，高效液相色谱柱工作在35℃。
2.琥珀酸浓度测定
取实施例1中步骤3获得的样品于离心管中，14000×g离心30min，吸取上清，测定琥珀酸的含量。
采用AmineX HPX-87X，(300mm×7.8mm)柱和示差检测器的高效液相色谱法测定琥珀酸的浓度。流动相：5mM H2SO4；流速：0.6mL/min；柱温：65℃。
3.结果
目的基因表达菌株BL-DMF、BL-DMA和BL-MA在96小时内对应降解N,N-二甲基甲酰胺、二甲胺和甲胺的情况如图2所示，检测96小时内不同目的基因菌株发酵液中N,N-二甲基甲酰胺、二甲胺和甲胺的浓度可知，二次培养48小时以后，菌株BL-DMF、BL-DMA和BL-MA发酵液中各有害底物的浓度均降低50％以上，96小时以后，各发酵液中有害底物几乎完全降解。
在以葡萄糖、甘油、木糖、纤维素水解液为碳源时，大肠杆菌三代工程菌株EcEng3-MA降解N,N-二甲基甲酰胺的情况，如图3中的A(葡萄糖)、B(甘油)、C(木糖)、D(纤维素水解液)所示；其琥珀酸产量如图3中的E所示。由图3中的A-D可知，工程菌株EcEng3-MA能以葡萄糖、甘油、木糖或纤维素水解液等常见碳源，直接发酵生长96小时，可以完全降解50mM的N,N-二甲基甲酰胺，无中间降解产物二甲胺和甲胺的残留；由图3中的E可知，工程菌株EcEng3-MA在以葡萄糖、甘油、木糖或纤维素水解液为碳源时，在有效降解N,N-二甲基甲酰胺的同时，还能够积累琥珀酸，并且以葡萄糖为碳源时，琥珀酸的积累量最高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株经过基因改造导入外源基因，使不具备降解N,N-二甲基甲酰胺的所述出发菌株能够降解N,N-二甲基甲酰胺；所述外源基因包括二甲基甲酰胺酶基因DMFase、二甲胺脱氢酶基因DMAase和甲胺脱氢酶基因MAase；
所述二甲基甲酰胺酶基因DMFase的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述二甲胺脱氢酶基因DMAase的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述甲胺脱氢酶基因MAase的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述经过基因改造导入外源基因还包括敲除所述大肠杆菌的内源基因；所述内源基因包括乙醛酸途径抑制因子基因iclR和琥珀酸脱氢酶基因sdhAB。
2.一种如权利要求1所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用基因编辑技术，将包含二甲基甲酰胺酶基因的载体转入大肠杆菌，替换乙醛酸途径抑制因子基因iclR，构建大肠杆菌一代工程菌株EcEng1-DMF；
(2)利用基因编辑技术，将包含二甲胺脱氢酶基因的载体转入所述大肠杆菌一代工程菌株EcEng1-DMF，替换琥珀酸脱氢酶基因sdhAB，构建大肠杆菌二代工程菌株EcEng2-DMA；
(3)将包含甲胺脱氢酶基因的载体转入所述大肠杆菌二代工程菌株EcEng2-DMA，构建大肠杆菌三代工程菌株EcEng3-MA，获得大肠杆菌工程菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述替换乙醛酸途径抑制因子基因iclR具体包括利用如SEQ ID NO.2所示的iclR左同源臂序列和如SEQ ID NO.3所示的iclR右同源臂序列，将包含二甲基甲酰胺酶基因的载体插入到乙醛酸途径抑制因子iclR的位置，同时敲除乙醛酸途径抑制因子iclR。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述替换琥珀酸脱氢酶基因sdhAB具体包括利用如SEQ ID NO.5所示的sdhAB左同源臂序列和如SEQ ID NO.6所示的sdhAB右同源臂序列，将包含二甲胺脱氢酶基因的载体插入到琥珀酸脱氢酶基因sdhAB的位置，同时敲除琥珀酸脱氢酶基因sdhAB。
5.一种如权利要求1所述的大肠杆菌工程菌在降解N,N-二甲基甲酰胺中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌在降解N,N-二甲基甲酰胺的同时生产琥珀酸。
7.一种降解N,N-二甲基甲酰胺同时生产琥珀酸的方法，其特征在于，将权利要求1所述的大肠杆菌工程菌或其发酵液投入到含有N,N-二甲基甲酰胺的液体中，在30-37℃条件下发酵，降解N,N-二甲基甲酰胺同时生产琥珀酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，用于获得所述发酵液的培养基中包括甘油、葡萄糖、木糖或纤维素水解液。
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