CN113286872A - 胃肠道小生物群的新细菌属dysosmobacter及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种属于新细菌属Dysosmobacter的细菌，并涉及其治疗、营养制品和美容用途。

Description

胃肠道小生物群的新细菌属DYSOSMOBACTER及其用途
技术领域
本发明涉及肠道小生物群。更具体地，本发明涉及Dysosmobacter属的细菌和它们在肠道小生物群相关病症的治疗中的用途。
发明背景
人肠道被多种多样的复杂且动态的微生物群定殖，所述微生物群代表了超过1000个与宿主不断相互作用的不同种。肠道小生物群的内稳态取决于宿主特征(年龄、性别、遗传背景……)和环境条件(应激、药物、胃肠外科手术、感染原和毒性剂……)，而且还取决于每日饮食变化。
最近已经公认，肠道小生物群参与许多疾病。例如，肠道小生物群失衡被显示是癌症诸如结肠直肠癌的发展的风险因素。增长的证据也支持肠道小生物群在肥胖和有关病症、脑病症和肠炎症、或肠疼痛的发展中的作用。
因此，用靶向肠道小生物群的产品的治疗表现为用于治疗宽范围的病症的有前途的治疗工具。这些产品可以由活微生物组成(诸如在大多数益生菌的情况下)，或含有死微生物或其片段。另外，这些产品可以包含被肠道小生物群利用的底物(诸如在益生元的情况下)，或含有改变肠道小生物群的平衡的化合物，诸如特定抗微生物化合物。例如，WO 2008/076696描述了肠道小生物群作为用于治疗肥胖和有关病症的治疗靶标。WO 2008/076696具体地描述了通过向受试者施用抗生素和/或益生菌来改变该受试者的肠道中的拟杆菌门(Bacteroidetes)和/或硬壁菌门(Firmicutes)的丰度的方法。此外，EP 2 030 623涉及通过调节肠道中肠杆菌的量来预防和/或治疗代谢病症，例如，肥胖相关病症。EP 2 030 623公开了通过施用益生菌细菌例如双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)或乳杆菌属(Lactobacillus)来降低肠道中肠杆菌的量。
但是，仍然需要具有治疗小生物群相关疾病的治疗潜力的其它产品，例如其源自肠道小生物群。
梭菌簇IV是包括运动性的以及非运动性的物种、形成孢子的以及不形成孢子的细菌、和革兰氏染色阳性的、阴性的或可变的物种的表型异质组。它们中的大多数是从各种动物的消化道分离或至少在其中遇到的厌氧杆菌，所述动物例如具有Oscillibactervalericigenes的corbicula clams，具有反刍颤杆菌(Oscillibacter ruminantium)的牛，具有白蚁孢杆菌(Sporobacter termitidis)的食木白蚁，具有Agathobaculum desmolans的猫，和具有柔嫩梭菌(Clostridium leptum)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)或肉桂乳头杆菌(Papillibacter cinnamivorans)的人。它们中的几种，特别是普氏栖粪杆菌和Butyricicoccus pullicaecorum，是胃肠道中的主要丁酸盐生产菌且已经表现出健康促进特性(Sokol等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2008年10月28日；105(43):16731-6；Eeckhaut等人,Gut.2013年12月；62(12):1745-52)。由于它们在不依赖于培养的研究中与健康相关参数的常规关联，其它菌疑似具有有益特性。这是吉氏颤螺菌(Oscillospira guilliermondii)的情况，其与无脂肪(leanness)正相关且与炎性肠病和肝病负相关(Konikoff等人,Trends Microbiol.2016年7月；24(7):523-524)。
代表那些分类单位的可培养的分离菌株的缺乏阻碍了那些细菌的生理学的更好理解和它们对动物健康的成因影响的证实。
在本发明中，在鉴定从人肠道分离的潜在的新的有益微生物的努力中，申请人能够从健康的25岁女性的粪便样品分离和培养新细菌菌株J115。菌株J115代表新种Dysosmobacter welbionis的典型菌株，其本身是新属Dysosmobacter的典型种，它的鉴定已经打开了其在胃肠小生物群相关病症的治疗中的应用的道路。令人惊奇地，申请人在本文中证实，当在体内施用时，该新细菌种呈现出治疗与肠道小生物群有关的疾病的治疗潜力，以及美容潜力，例如，用于诱导重量减轻。
因此，本发明涉及Dysosmobacter属的细菌细胞，并涉及其在治疗或美容方法中的用途。
发明内容
本发明涉及属于Dysosmobacter属的分离的细菌和/或其变体和/或其片段。
在一个实施方案中，根据本发明的细菌属于种Dysosmobacter welbionis和/或其变体。
在一个实施方案中，本发明的分离的细菌的16S rRNA基因的核苷酸序列与SEQ IDNO:1具有至少约90％同一性。
在一个实施方案中，根据本发明的分离的细菌能够发酵肌-肌醇(myo-inositol)。
在一个实施方案中，根据本发明的分离的细菌是于2018年3月14日作为LMG P-30603保藏在BCCM/LMG的菌株J115和/或其变体。
在一个实施方案中，根据本发明的分离的细菌是巴氏灭菌的。
在一个实施方案中，根据本发明的分离的细菌是冷冻的。
本发明也涉及一种组合物，其包含根据本发明的分离的细菌和/或其片段。
本发明也涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的组合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
本发明也涉及一种营养制品组合物，其包含根据本发明的组合物和至少一种营养制品可接受的赋形剂。
本发明也涉及一种美容组合物，其包含根据本发明的组合物和至少一种美容上可接受的赋形剂。
本发明也涉及根据本发明的分离的细菌、组合物或药物组合物，其用于用作药物。
本发明也涉及根据本发明的分离的细菌、组合物或药物组合物，其用于在有此需要的受试者中治疗与胃肠小生物群有关的病症。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是代谢疾病，优选地选自包含肥胖、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、糖尿病、葡萄糖耐受不良、异常的脂质代谢、高血糖症、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的HDL-胆固醇和升高的甘油三酯的列表。
本发明也涉及根据本发明的分离的细菌、组合物、营养制品组合物或美容组合物用于在受试者中促进重量减轻、减少食物摄入、增加肌肉量、减少脂肪量、增加饱感和/或减少与食物摄入有关的重量增加的用途。
定义
在本发明中，下述术语具有下述含义：
-在数字前面的“约”是指所述数字的值的±10％。
-“可接受的”，例如当用在表述“药学上可接受的”、“营养制品可接受的”和“美容上可接受的”中时，表示当在适当地施用于受试者(特别是人)时不产生不利的、变应性的或其它不良的反应的分子实体和组合物。
-“细菌菌株”表示细菌种的亚型。
-“梭菌簇IV”表示包括运动性的以及非运动性的物种、形成孢子的以及不形成孢子的细菌、和革兰氏染色阳性的、阴性的或可变的物种的表型异质组。它们中的大多数是从各种动物的消化道分离或至少在其中遇到的厌氧杆菌，所述动物例如具有Oscillibactervalericigenes的corbicula clams，具有反刍颤杆菌(Oscillibacter ruminantium)的牛，具有白蚁孢杆菌(Sporobacter termitidis)的食木白蚁，具有Agathobaculum desmolans的猫，和具有柔嫩梭菌(Clostridium leptum)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)或肉桂乳头杆菌(Papillibacter cinnamivorans)的人。它们中的几种，特别是普氏栖粪杆菌和Butyricicoccus pullicaecorum，是胃肠道中的主要丁酸盐生产菌且已经表现出健康促进特性。由于它们在不依赖于培养的研究中与健康相关参数的常规关联，其它菌疑似具有有益特性。这是吉氏颤螺菌(Oscillospira guilliermondii)的情况，其与无脂肪(leanness)正相关且与炎性肠病和肝病负相关。
-“美容有效量”表示对于促进美容效果(例如在受试者中诱导重量减轻)而言必需的和足够的美容组合物的量。
-“Dusodibacter”[dy.so.di.bac’ter.a Gr.n.
Figure BDA0002962170110000041
腐烂的,臭气味；N.L.masc.n.细菌棒菌；N.L.masc.n.产生臭气味的棒菌]和“Dysosmobacter”[Dys.os.mo.bac'ter.Gr.masc.adj.dysosmos坏气味；N.L.masc.n.细菌棒菌；N.L.masc.n.Dysosmobacter一种坏气味棒菌]互换使用以表示本文描述的具有下述特性的一个新细菌属：细胞是专性厌氧的，无色素的，不形成孢子的，非运动性的，革兰氏染色阴性的。细胞形成主要为1.8-3.0μm的直棒，但是经常形成长达20μm的伸长棒，无论生长期如何。不产生呼吸性甲基萘醌。该属属于瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)。典型种是Dysosmobacter welbionis。在一个实施方案中，细胞壁中的诊断性二氨基酸是内消旋-2,6-二氨基庚二酸。
-“Dusodibacter welbiota”[u’εl.bi’o.ta.welbiota]和“Dysosmobacterwelbionis”[wel.bi.o'nis.N.L.gen.n.welbionis]互换使用以表示本文描述的新细菌种，其除了在上文中描述的Dysosmobacter属的特性以外还具有下述特性：在厌氧条件下在37℃温育72h后，在固体改良YCFA上的菌落为点状、膏状、半透明的、圆形的、边缘光滑的、略微凸出的且光滑的。2％w/v胆汁或2％w/v NaCl的存在会抑制生长。七叶甙不被水解。不产生吲哚。硝酸盐没有被还原。明胶不被消化。不产生尿素酶。不产生过氧化氢酶。酸是由肌-肌醇产生，而不是由D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-核糖和D-木糖产生。关于精氨酸二水解酶和谷氨酸脱羧酶获得阳性反应。来自API 20A和Rapid ID32A(bioMérieux,里昂,法国)的所有其它测试均为阴性。来自肌-肌醇的主要发酵终产物是丁酸盐。通过高效液相色谱法(HLPC)，典型菌株的DNA GC含量为59.3mol％。在一个实施方案中，基于基因组序列，典型菌株的DNAGC含量为58.9mol％。典型菌株为J115(于2018年3月14日作为LMG P-30603保藏在BCCM/LMG)，并从人粪便分离出。在一个实施方案中，主要细胞脂肪酸是饱和支链脂肪酸和DMA。在一个实施方案中，主要DMA脂肪酸是C18:0DMA，且主要饱和支链脂肪酸是异-C15:0和反异-C15:0。
-“发酵”表示在没有氧存在下消耗糖的代谢过程。产物是有机酸、气体或醇。如在乳酸发酵的情况下一样，它发生在酵母和细菌以及缺氧的肌细胞中。
-“胃肠小生物群有关病症”或“胃肠小生物群有关疾病”互换使用以表示与主题胃肠小生物群的组成和/或其产物的失衡、缺乏或过量有关的一组疾病或病症。与胃肠小生物群有关的病症的例子包括、但不限于：代谢疾病，例如，肥胖、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、糖尿病(例如，2型糖尿病)、葡萄糖耐受不良、高血糖症、异常的脂质代谢、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的LDL胆固醇和升高的甘油三酯，感染，结肠炎，例如，炎性肠病(例如，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、缺血性结肠炎、肠易激综合征、淋巴细胞性结肠炎和胶原性结肠炎，癌症，例如，结肠直肠癌，免疫系统的功能障碍，例如，湿疹、变态反应、食物变态反应和乳糜泻，心理学障碍，例如，应激、焦虑和成瘾，神经学障碍，例如，帕金森病和阿尔茨海默氏病，肝疾病，例如，肝硬化、非酒精性脂肪肝病和肝性脂肪变性、恶病质、prader-willy综合征，消化道的功能障碍，例如，溃疡和胆囊疾病，摄食行为障碍例如，神经性厌食、神经性贪食和暴食症，心血管疾病和病况，例如中风、动脉粥样硬化和高血压、哮喘、睡眠呼吸暂停和骨关节炎。
-“肠道小生物群”或“胃肠小生物群”互换使用以表示生活在人类和其它动物的消化道中的复杂微生物群。胃肠小生物群的组成在宿主生物的终生中或在宿主饮食改变时发生变化。它也随消化道而变化。消化道含有一个稠密栖居的微生物生态系统，每克肠内容物具有多达1012个细胞。肠道中的许多物种尚未在其宿主之外进行研究，因为大多数无法培养。人肠道中的四个主要细菌门是硬壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。大多数细菌属于拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、Blautia、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、另枝菌属(Alistipes)、粪球菌属(Coprococcus)、小杆菌属(Dialister)、Lachnoclostridium、颤螺菌属(Oscillospira)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、罗斯氏菌属(Roseburia)、Ruminiclostridium、萨特氏菌属(Sutterella)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。其它属，诸如埃希氏菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、巴恩斯氏菌(Barnesiella)、Butyricimonas、Butyricicoccus、毛螺菌属(Lachnospira)、Odoribacter、Turicibacter和乳杆菌属(Lactobacillus)，以更少的程度存在。认为肠道小生物群通过如下在防御病原体中起作用：与潜在病原体竞争，并参与肠道保护和免疫系统的发展、代谢，协助消化消耗的食物，帮助营养物质的吸收和合成维生素。肠道小生物群也与中枢神经系统以及神经内分泌和神经免疫系统的功能相互作用。
-“甲基萘醌”表示在微生物呼吸过程中在电子转移中起重要作用的细菌呼吸链的组分。
-本文中使用的“突变体”表示已经在其遗传结构中经历了自然的或诱导的(即通过诱变)变化的生物实体，所述变化不干扰所述生物实体的定义特性。其遗传结构的变化可以是基因组序列中一个或几个核苷酸的插入或缺失或置换。例如，Dysosmobacterwelbionis突变体表示在其遗传结构中，天然地或通过基因工程改造技术经历了不干扰其属于Dysosmobacter welbionis种的变化的Dysosmobacter welbionis菌株。
-“营养制品有效量”表示对于在受试者中提供生理益处或减轻不适所必需和足够的营养制品组合物、食品或饮食添加物或功能食品的量。
-“巴氏灭菌的细菌”表示进行了热处理(或加热过程)的细菌。
-“药学上可接受的载体或赋形剂”表示当适当地施用于受试者(特别是人)时，不产生不利的、变应性的或其它不良的反应的分子实体和组合物。它包括任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于人施用，制剂应满足监管局(例如FDA局或EMA)所要求的致热原性、一般安全性和纯度标准。因此，药学上可接受的载体或赋形剂可以表示任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。
-“益生元”表示一种物质，它可能不会被受试者(例如，人类)消化，而是通过肠道中的微生物对它的代谢来调节肠道小生物群的组成和/或活性，从而赋予宿主有益的生理作用。
-“益生菌”表示微生物细胞制剂(例如，活的微生物细胞)，当以有效量施用时，其对受试者的健康或福祉具有有益作用。根据定义，所有益生菌均具有证明的非病原特性。在一个实施方案中，这些健康益处与改善胃肠道中人或动物小生物群的平衡和/或恢复正常小生物群有关。
-“受试者”表示温血动物，优选人类、宠物或家畜。本文中使用的术语“宠物”和“家畜”包括、但不限于狗、猫、豚鼠、兔、猪、牛、绵羊、山羊、马和家禽。在一些实施方案中，所述受试者是雄性或雌性受试者。在一些实施方案中，所述受试者是成人或儿童。在一些实施方案中，所述受试者可以是“患者”，即，这样的受试者：其根据本发明的方法，正在等待接受或正在接受医疗护理，或曾经是/是/将来是医疗程序的对象，或者被监测疾病的发展。
-“基本上健康的受试者”用于定义不受要治疗的疾病或要缓解的不适影响的受试者。例如，如果将本发明的细菌或其片段用于治疗肥胖，则基本上健康的受试者不会受肥胖影响。优选地，基本上健康的受试者与待治疗的受试者具有共同的特征，例如相同的性别、年龄、性别、饮食、药物摄入或地理位置。
-“治疗有效量”表示药剂的水平或量，其目的在于，在不对靶标造成显著的负面或不利副作用的情况下，(1)延迟或预防疾病、病症或病况的发作；(2)减慢或停止疾病、病症或病况的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)带来疾病、病症或病况的症状的改善；(4)降低疾病、病症或病况的严重程度或发生率；或(5)治愈疾病、病症或病况。可以在疾病、病症或病况的发作之前施用治疗有效量以用于预防性或防止性作用。可替换地或另外地，可以在疾病、病症或病况开始之后施用治疗有效量以用于治疗作用。
-“治疗”表示治疗性处理和预防性的或防止性的措施，其中目的是预防或减慢(减轻)靶向的病理性病况或病症。需要治疗的那些包括已经具有所述病症的那些以及易于具有所述病症的那些或要在其中预防所述病症的那些。如果在接受治疗量的根据本发明的Dysosmobacter welbionis和/或其变体和/或其片段以后，患者显示出一种或多种以下可观察的和/或可测量的变化：与特定疾病或病况相关的一种或多种症状的改善，发病率和死亡率的降低，以及生活质量问题的改善，则该受试者或哺乳动物被成功地“治疗”。通过医师熟悉的常规程序，可以容易地测量用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数。
-“典型菌株”表示如在International Code of Nomenclature of Bacteria中所定义的，作为物种的命名类型和参考点，所有其它菌株与其进行对比以知晓它们是否属于该物种。例如，从健康的25岁女性的粪便样品分离的菌株J115是种Dysosmobacterwelbionis的典型菌株。
-“变体”表示保留了物种定义特征的物种的所有遗传上或表型上不同的菌株。术语变体也用于指其它系统发生分类单位，例如属或菌株。本文中使用的术语“变体”表示本文公开和举例说明的细菌的天然存在的和专门开发的变体或突变体。在一个实施方案中，变体可以具有或不具有本文举例说明的细菌的相同鉴定性生物学特性，只要它们在治疗或预防疾病方面具有相似的有利特性。在一个实施方案中，本发明细菌的变体具有与本发明的细菌相同的功能和/或治疗特性。用于制备本文举例说明的微生物菌株的变体的合适方法的示例性例子包括、但不限于基因整合技术，诸如通过元件或转座子的插入或通过同源重组介导的那些，用于修饰、插入、缺失、活化或沉默基因的其它重组DNA技术，种内原生质体融合，通过用紫外线或X射线照射或通过用化学诱变剂(诸如亚硝基胍、甲磺酸甲酯、氮芥等)处理而诱变，以及细菌噬菌体介导的转导。合适和适用的方法是本领域众所周知的，并且描述在例如：J.H.Miller,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1972)；J,H.Miller,A Short Course inBacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laborator Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1992)；和J.Sambrook,D.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)》，以及其它。
具体实施方式
本发明首先涉及属于Dysosmobacter属的细菌(或细菌细胞)。在命名法变化后，该属也被称作Dysosmobacter。两个术语是等同的且在整个本申请中可互换。如果分类法再次变化，熟练的技术人员会知道如何适应分类法中的变化以推导可以用在本发明中的细菌。
发明人在本文中首次描述了属于Dysosmobacter属的细菌。Dysosmobacter属属于瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)。在一个实施方案中，属于Dysosmobacter属的细菌具有下述特征：细胞是厌氧性的；没有色素；不形成孢子；非运动性的，革兰氏染色阴性的；细胞形成棒，例如，直棒(例如，约1.8-3μm长)或伸长的棒；细胞不产生呼吸性甲基萘醌；至少约10％、优选至少约20％、更优选约30％的细胞脂肪酸是饱和支链脂肪酸和DMA脂肪酸；C18: 0DMA占细胞脂肪酸的至少约5％、优选至少约10％、更优选约15％；异-C15:0占细胞脂肪酸的至少约10％、优选至少约15％、更优选约20％；且反异-C15:0占细胞脂肪酸的至少约5％、优选至少约7.5％、更优选约10％。在一个实施方案中，属于Dysosmobacter属的细菌的细胞壁中的诊断性二氨基酸是内消旋-2,6-二氨基庚二酸。
Dysosmobacter welbionis菌株J115的16S rRNA基因的序列SEQ ID NO:1已经在GenBank/EMBL/DDBJ登录号MG963288下保藏。
因为在它的高变区中积累的突变和该基因在所有细菌中的存在，16SrRNA基因的序列经常用于鉴定不同的细菌种。
在一个实施方案中，本发明的细菌的16S rRNA基因的核苷酸序列具有序列SEQ IDNO:1，或其序列与SEQ ID NO:1具有至少约90％同一性，优选与SEQ ID NO:1具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.65％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌的16S rRNA基因的核苷酸序列具有序列SEQ IDNO:1，或其序列与SEQ ID NO:1具有至少约99.9％同一性，优选与SEQ ID NO:1具有至少约99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％或更多同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌的16S rRNA基因的核苷酸序列具有序列SEQ IDNO:1，或其序列与SEQ ID NO:1的整个长度具有至少约90％同一性或更多同一性，优选与SEQ ID NO:1的整个长度具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.65％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％或更多同一性。
当用在两种或更多种多肽或两种或更多种核酸分子的序列之间的关系中时，术语“同一性”表示多肽或核酸分子之间的序列相关度程度，如通过两个或更多个氨基酸或核苷酸残基的串之间的匹配数所确定的。“同一性”衡量具有空位比对(如果存在的话)的2个或更多个序列中较小者之间相同匹配的百分比，所述空位比对通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。通过已知的方法，可以容易地计算相关多肽的同一性。这样的方法包括、但不限于在以下文献中描述的那些方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,编,Academic Press,New York,1993；Computer Analysisof Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编,M.StocktonPress,New York,1991；和Carillo等人,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)。用于确定同一性的优选方法被设计成给出所测试的序列之间的最大匹配。在公众可得到的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人,Nucl.Acid.Res.\2,387(1984)；GeneticsComputer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人,J.MoI.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序是公众可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST Manual,Altschul等人.NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul等人,出处同上)得到的。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于确定同一性。在一个实施方案中，在其参考的序列的整个长度上测量术语同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌属于种Dysosmobacter welbionis。在命名法变化后，该种也被称作Dusodibacter welbiota。两个术语是等同的且在本申请中可互换。
在一个实施方案中，发明人在本文中首次描述的属于种Dysosmobacterwelbionis的细菌除了具有在上文中描述的Dysosmobacter属的特征以外还具有下述特征：在厌氧条件下在37℃温育72h后，在固体改良YCFA培养基上形成的菌落为点状、膏状、半透明的、圆形的、边缘光滑的、略微凸出的且光滑的。在一个实施方案中，在等于或高于约1％w/v、优选约2％w/v的培养基中的胆汁浓度和/或在或高于约1％w/v、优选约2％w/v的培养基中的NaCl浓度抑制细菌生长。在一个实施方案中，细胞不具有过氧化氢酶活性。在一个实施方案中，细胞具有精氨酸二水解酶和/或谷氨酸脱羧酶活性。
在一个实施方案中，本发明的细菌能够发酵肌-肌醇。
在一个实施方案中，本发明的细菌不能发酵D-葡萄糖、D-核糖、D-阿拉伯糖和D-木糖。
在一个实施方案中，本发明的细菌不能发酵D-葡萄糖和/或D-木糖。
用于确定细菌能够发酵的底物的技术是本领域技术人员已知的。例如，该表征可以使用厌氧菌测试试剂盒诸如测试API 50CH(BioMérieux,里昂,法国)完成。
在一个实施方案中，来自厌氧菌测试试剂盒API20A(BioMérieux,里昂,法国)的至少1个、优选至少2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个测试是阴性的。
厌氧菌测试试剂盒API20A(BioMérieux,里昂,法国)允许通过实现以下20个生化测试进行厌氧细菌的生化表征，即尿素酶活性，吲哚产生，明胶水解，七叶甙水解，D-葡萄糖、D-甘露醇、D-乳糖、D-蔗糖、D-麦芽糖、水杨苷、D-木糖、L-阿拉伯糖、甘油、D-纤维二糖、D-甘露糖、D-松三糖、D-棉子糖、D-山梨醇、L-鼠李糖和D-海藻糖的发酵。
在一个实施方案中，来自厌氧菌测试试剂盒API32A(BioMérieux,里昂,法国)的至少1个、优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个测试是阴性的。
快速的ID32A(BioMérieux,里昂,法国)允许通过实现以下32个生化测试进行厌氧细菌的生化表征，即尿素酶、精氨酸二水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶-6-磷酸、α-葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、N-乙酰基(acethyl)-氨基葡糖苷酶、谷氨酸脱羧酶、α-岩藻糖苷酶、碱性磷酸酶、精氨酸芳基酰胺酶、脯氨酸芳基酰胺酶、亮氨酰基甘氨酸芳基酰胺酶、苯丙氨酸芳基酰胺酶、亮氨酸芳基酰胺酶、焦谷氨酸芳基酰胺酶、酪氨酸芳基酰胺酶、丙氨酸芳基酰胺酶、甘氨酸(glycide)芳基酰胺酶、组氨酸芳基酰胺酶、谷氨酸谷氨酰基芳基酰胺酶和丝氨酸芳基酰胺酶酶活性，以及硝酸盐还原，吲哚产生，和甘露糖和棉子糖发酵。
在一个实施方案中，本发明的细菌不是运动性的。在一个实施方案中，本发明的细菌不具有鞭毛。
在一个实施方案中，本发明的细菌是菌株J115(于2018年3月14日作为LMG P-30603保藏在BCCM/LMG)。J115菌株是种Dysosmobacter welbionis(以前被称作Dusodibacter welbiota)的典型菌株。
在一个实施方案中，本发明的细菌的基因组中的GC含量是在约50至约70％范围内，优选在约55至65％范围内，更优选为约59％。
用于确定基因组的GC含量(即DNA序列中的鸟嘌呤-胞嘧啶的比例)的方法是本领域技术人员众所周知的，且包括、但不限于整个基因组测序、高压液相色谱法、DNA解链温度分析和流式细胞计量术。
Dysosmobacter welbionis菌株J115的基因组序列SEQ ID NO:10已经在GenBank/EMBL/DDBJ登录号CP034413下保藏。
在一个实施方案中，本发明的细菌的基因组序列具有序列SEQ ID NO:10，或其序列与SEQ ID NO:10具有至少约65％同一性，优选与SEQ ID NO:10具有至少约70％、75％、80％、85％、90％同一性，更优选与SEQ ID NO:10具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.65％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多同一性。
在一个实施方案中，当与序列SEQ ID NO:10的基因组对比时，本发明的细菌具有高于约60、优选地高于约74、75、80、85、90、更优选地高于约95、甚至更优选地高于约96、97、98、98.5、98.65、99或更多的平均核苷酸同一性(ANI)评分。
用于确定ANI值的技术是本领域技术人员已知的(例如，在Kim等人,Int J SystEvol Microbiol.2014Feb；64(Pt 2):346-51中实现的方法)。简而言之，ANI对应于同一性的每个双向最佳命中(BBH–基于它们在基因组中的位置和序列同一性而鉴定的直系同源物序列)的总和乘以比对长度除以BBH基因的总长度。
在一个实施方案中，本发明的细菌与SEQ ID NO:10具有高于约60％、优选地高于约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、更优选地高于约70％的杂合DNA-DNA杂交值(也被称作DDH值)。
用于确定DDH值的技术是本领域技术人员已知的(例如，Rossello-Móra综述的方法，Stackebrandt等人,Molecular Identification,Systematics,and PopulationStructure of Prokaryotes,p23-50,2006,Springer,Berlin,Heidelberg)，并且依赖于下述一般原则：(i)将测定的生物体的基因组DNA(gDNA)和参照生物体(例如在本发明的上下文中，典型菌株J115(于2018年3月14日作为LMG P-30603保藏在BCCM/LMG)的gDNA剪切成600-800bp的小片段；(ii)将来自两种菌株的DNA片段的混合物加热以解离DNA双链；和(iii)随后降低温度，直到片段重新退火。由于双链的解链温度依赖于两条链之间的匹配碱基配对程度的原因，从解链温度可以推断基因组(不)相似性。通常相对于通过将参照基因组与自身杂交得到的DDH值来指定杂合DDH值。≤70％的DDH值可以视作测试的生物体属于与用作参照的典型菌株不同的物种的指标。还可以基于要使用公众可得到的计算机程序(例如使用在Meier-Kolthoff等人(BMC Bioinformatics.2013年2月21日；14:60)中描述的方法)对比的菌株的基因组序列来评价DDH值。
在一个实施方案中，本发明的细菌与SEQ ID NO:10具有低于约0.5、优选地低于约0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、更优选地低于约0.13、0.12、0.11、0.10或更少的基因组间距离。
用于确定基因组间距离或基因组-基因组距离(GGD)的技术是熟练的技术人员已知的。例如，可以使用Meier-Kolthoff等人(BMC Bioinformatics2013；21:14-60；Int JSyst Evol Microbiol 2014；1:352–6)描述的方法。可以使用基因组计算器2.1(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen–DSMZ)实现这样的方法，其中使用BLAST+作为局部比对工具并将在高评分区段对(HSP)中发现的所有同一性的总和除以总HSP长度。
本发明也涉及在上文中描述的本发明的细菌的变体。所述变体也可以称作本发明的细菌的衍生菌株。在一个实施方案中，本发明的细菌的变体可以通过本文描述的细菌的突变、变异或重组得到。在本发明中，本发明的细菌的变体也可以被称作本发明的细菌的突变体。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体是Dysosmobacter welbionis的变体。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体是菌株J115(于2018年3月14日作为LMGP-30603保藏在BCCM/LMG)的变体。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体的基因组与它的来源细菌的基因组具有至少约70％、优选至少约80％、至少约90％、至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或更多同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体的基因组序列与它的来源细菌的基因组的序列具有至少约65％同一性，优选与它的来源细菌的基因组的序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％同一性，更优选与它的来源细菌的基因组的序列具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.65％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体的基因组序列与SEQ ID NO:10具有至少约65％同一性，优选与SEQ ID NO:10具有至少约70％、75％、80％、85％、90％同一性，更优选与SEQ ID NO:10具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.65％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体的16S rRNA基因序列与它的来源细菌的16S rRNA基因具有至少约90％同一性，优选与它的来源细菌的16S rRNA基因的序列具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.65％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体的16S rRNA基因序列与它的来源细菌的16S rRNA基因具有至少约99.9％同一性，优选与它的来源细菌的16S rRNA基因的序列具有至少约99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％或更多同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体的16S rRNA基因序列与SEQ ID NO:1具有至少约90％同一性，优选与SEQ ID NO:1具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.65％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体的16S rRNA基因序列与SEQ ID NO:1具有至少约99.9％同一性，优选与SEQ ID NO:1具有至少约99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％或更多同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体的16S rRNA基因序列与SEQ ID NO:1在它的整个长度上具有至少约90％同一性，优选与SEQ ID NO:1在它的整个长度上具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.65％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％或更多同一性。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体具有高于约60％、优选地高于约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、更优选地高于约70％的杂合DNA-DNA杂交值(也被称作DDH值)。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体与它的来源细菌的基因组具有高于约60％、优选地高于约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、更优选地高于约70％的杂合DNA-DNA杂交值(也被称作DDH值)。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体与SEQ ID NO:10具有高于约60％、优选地高于约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、更优选地高于约70％的杂合DNA-DNA杂交值(也被称作DDH值)。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体具有高于约60％、优选地高于约65％、70％、75％、80％、85％、90％、更优选地高于约95％、甚至更优选地高于约96％的平均核苷酸同一性(ANI)值。
在一个实施方案中，当与它的来源细菌的基因组序列对比时，本发明的细菌的变体具有高于约60、优选地高于约74、75、80、85、90、更优选地高于约95、甚至更优选地高于约96、97、98、98.5、98.65、99或更多的平均核苷酸同一性(ANI)评分。
在一个实施方案中，当与SEQ ID NO:10对比时，本发明的细菌的变体具有高于约60、优选地高于约74、75、80、85、90、更优选地高于约95、甚至更优选地高于约96、97、98、98.5、98.65、99或更多的平均核苷酸同一性(ANI)评分。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体与它的来源细菌的基因组具有低于约0.5、优选地低于约0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、更优选地低于约0.13、0.12、0.11、0.10或更少的基因组间距离。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体与SEQ ID NO:10具有低于约0.5、优选地低于约0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、更优选地低于约0.13、0.12、0.11、0.10或更少的基因组间距离。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体的基因组中的GC含量是在约50至约70％范围内，优选在约55至65％范围内，更优选为约59％。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体能够发酵肌-肌醇。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体不能发酵D-葡萄糖和/或D-木糖。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体的细胞壁中的诊断性二氨基酸为内消旋-2,6-二氨基庚二酸。
在一个实施方案中，本发明的细菌的变体具有与它的来源细菌相同的功能和/或治疗特性。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是活细胞。在另一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是非活细胞。
本文中使用的术语“活细胞”表示能够增殖的细胞，这与不能增殖的非活细胞相反。用于测量细胞活力和增殖的方法是本领域技术人员已知的。例如，通过将含有至少一个本发明细菌的溶液铺展在培养皿上并在最佳生长条件下温育确定的时间后计数菌落的数目，可以评估细胞活力和增殖。或者，可以使细胞在液体培养基中生长，并且可以如下测量增殖：在最佳生长条件下温育确定的时间后测量细菌培养物的光密度。也可能通过显微镜观察来确定细胞(包括活细胞和非活细胞)的数目。尽管相差显微术是一种众所周知的用于此目的的方法，但通过用染料、荧光探针或抗体进行特异性染色可以使微生物细胞进一步可视化，从而有助于显微镜观察或通过流式细胞计量术对细胞计数。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体能够增殖。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是活的。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是有代谢活性的。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是新鲜的。本文中使用的术语“新鲜的”是指，本发明的细菌在其最后扩增阶段和其使用之间没有被冷冻。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是巴氏灭菌的。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是巴氏灭菌的细菌。
在一个实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在约50℃至约100℃、优选约60℃至约95℃、更优选约70℃至约90℃范围内的温度加热。在一个实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在约50、51、52、53、54、55、56、57、58或59℃的温度加热。在另一个实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在约60、61、62、63、64、65、66、67、68或69℃的温度加热。在另一个实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在约70、71、72、73、74、75、76、77、78或79℃的温度加热。在另一个实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在约80、81、82、83、84、85、86、87、88或89℃的温度加热。在另一个实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99℃或100℃的温度加热。
在一个实施方案中，没有将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在高于约100℃的温度加热。在一个特定实施方案中，没有将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在超高温度(例如在约110℃至约140℃范围内的温度)加热。在一个实施方案中，没有将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在高于约90℃的温度加热。因此，在本发明的一个实施方案中，没有将本发明的细菌和/或其变体灭菌。灭菌是旨在破坏、杀死或灭活所有生命形式和其它生物试剂的处理。这包括微生物和它们的孢子以及病毒和朊病毒。与灭菌不同，巴氏灭菌并非旨在杀死所有微生物，而是通常用于食品，目的是减少活病原体的数目。
在本发明的一个实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体加热至少约10分钟。在本发明的另一个实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体加热至少约15、20、25、30、35或45分钟。在一个实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体加热约10至约45分钟的时段。
在一个实施方案中，没有将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体加热短时间。在一个特定实施方案中，没有将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体加热小于约30秒、小于约60秒、小于约90秒或小于约120秒。在一个优选的实施方案中，没有将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体加热小于约1分钟的时间，优选小于约5、6、7、8或9分钟的时间。
在一个实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在约50℃至约100℃范围内的温度加热至少约10分钟。在一个特定实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体加热至约60℃保持约20或约30分钟。在另一个特定实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体加热至约70℃保持约20或约30分钟。在另一个特定实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体加热至约80℃保持约20或约30分钟。在另一个特定实施方案中，将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体加热至约90℃保持约20或约30分钟。
在一个特定实施方案中，没有将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在高于约110℃的温度加热约1至约120秒。在另一个特定实施方案中，没有将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在高于约100℃的温度加热约1至约120秒。在另一个特定实施方案中，没有将巴氏灭菌的本发明的细菌和/或其变体在高于约90℃的温度加热约1至约120秒。
在一个实施方案中，用超高温(UHT)处理来处理本发明的细菌和/或其变体。
本文中使用的“UHT”处理表示超高温度处理或超热处理(都缩写UHT)，其涉及通过将它在至少约135℃的温度加热短时间，例如，约1至约60秒，优选约1至约30秒，更优选约1至约10秒，将组合物至少部分灭菌。
UHT系统有两种主要类型：直接系统和间接系统。在直接系统中，将产品通过蒸汽注射或蒸汽输注进行处理，而在间接系统中，将产品使用板式热交换器、管式热交换器或刮表面热交换器进行热处理。可以在产品制备过程中的任一步骤或多个步骤中应用UHT系统的组合。
在一个实施方案中，将本发明的细菌和/或其变体快速巴氏灭菌。因此，在一个实施方案中，将本发明的细菌和/或其变体在约71.5℃至约74℃范围内的温度处理在约15至约30秒范围内的时间段。
在另一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体不是新鲜的。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是冷冻的。
本文中使用的术语‘冷冻的’表示，在允许所述细菌中从液体到固体的相变的温度或更低温度冷却的细菌。在一个实施方案中，所述温度是约-5°、-20℃、-70℃、-80℃或-190℃。
在一个实施方案中，从冷冻的本发明的细菌和/或其变体回收的细胞是活的。换而言之，在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是冷冻的和活的。
在一个实施方案中，至少约50％的从冷冻的本发明的细菌回收的细胞是活的，优选至少60％、65％、70％、75％、80％、85％的从冷冻的本发明的细菌回收的细胞是活的，更优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％或更多的从冷冻的本发明的细菌回收的细胞是活的。
制备细菌的冷冻储备物(可以从其回收活细胞)的方法是本领域技术人员已知的。简要地但不限于，可以使细菌在合适的液体培养基中生长以达到期望的细胞密度。可以将期望体积的细菌制品用无菌甘油溶液稀释，以使最终甘油浓度在15％(v/v)至50％(v/v)甘油之间，并转移到能够维持低温的容器诸如低温瓶。然后可以将容器冷却至-70℃或以下的温度。
在一个实施方案中，从冷冻的本发明的细菌和/或其变体回收的细胞是非活的。换而言之，在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是冷冻的和非活的。
在一个实施方案中，小于约50％的从冷冻的本发明的细菌回收的细胞是活的，优选地小于约40％、35％、30％、25％、20％、15％的从冷冻的本发明的细菌回收的细胞是活的，更优选地小于约14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或更少的从冷冻的本发明的细菌回收的细胞是活的。在一个实施方案中，约7％的从冷冻的本发明的细菌回收的细胞是活的。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体不能增殖。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是死的。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体不是有代谢活性的或是代谢上无活性的。
在一个实施方案中，将本发明的细菌热灭活。在一个实施方案中，将本发明的细菌热杀死。
在一个特定实施方案中，其中本发明的细菌和/或其变体是死的或非活的，所述细菌和/或其变体通过加热而杀死。在一个实施方案中，将热灭活的或热杀死的本发明的细菌和/或其变体在至少约90℃、优选至少约100℃、105℃、110℃、115℃或120℃、更优选至少约121℃、125℃、130℃、135℃、140℃或更多的温度加热。在一个实施方案中，将热灭活的或热杀死的本发明的细菌和/或其变体在约90℃、优选地约100℃、105℃、110℃、115℃或120℃、更优选地约121℃、125℃、130℃、135℃或140℃的温度加热。
在一个实施方案中，使用至少约10psig、优选至少约11、12、13、14、15或更多psig的饱和蒸汽压强将热灭活的或热杀死的本发明的细菌和/或其变体加热。在一个实施方案中，使用约10psig、优选约11、12、13、14或15psig的饱和蒸汽压强将死的或非活的本发明的细菌和/或其变体加热。
在一个实施方案中，将热灭活的或热杀死的本发明的细菌和/或其变体加热至少约5分钟，优选至少约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟或更多。在一个实施方案中，将热灭活的或热杀死的本发明的细菌和/或其变体加热约5分钟，优选约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟或30分钟。
本发明进一步涉及本发明的细菌和/或其变体的片段。
本文中使用的术语“片段”表示细胞组分、代谢物、分泌的分子或囊泡以及由本发明的细菌和/或其变体等的代谢产生的化合物。细胞组分的例子包括、但不限于细菌细胞壁组分诸如肽聚糖、细菌核酸诸如DNA和RNA、细菌膜组分和细菌结构组分诸如蛋白、碳水化合物、脂质和这些的组合诸如脂蛋白、糖脂和糖蛋白、细菌代谢物、有机酸、无机酸、碱、肽、酶和辅酶、氨基酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、糖脂、维生素、生物活性化合物和含有无机组分的代谢物。可以通过如下得到片段：回收本发明的细菌的培养物的上清液，或从本发明的细菌和/或其变体的培养物提取细胞组分或细胞级分、代谢物或分泌的化合物，降解产物，分离形式的组分，从本发明的细菌和/或其变体衍生出的一种或多种组分的任何混合物，或存在于本发明的细菌和/或其变体中的一种或多种组分，它们以另一种方式生产，例如，使用重组DNA技术、在微生物宿主中或以任何其它(生物)合成方法。
本发明进一步涉及细菌群体，其包含属于如本文中所述的Dysosmobacter属或种Dysosmobacter welbionis的细菌。本发明因此涉及包含至少一种本发明的细菌和/或其变体的细菌群体。
在一个实施方案中，本发明的细菌群体是基本上纯的，即，细菌群体的至少约50％的细菌细胞是本发明的细菌细胞和/或其变体,优选细菌群体的至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的细菌细胞是本发明的细菌细胞和/或其变体。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是分离的。
本文中使用的术语分离的表示细菌细胞与在环境(例如肠道小生物群、水、土壤或皮肤)中存在的活微生物的天然混合群体的分离。可以在确定的实验室培养基上扩增分离的细菌。
本发明进一步涉及如本文中所述的分离本发明的细菌和/或其变体的方法。
用于分离本发明的细菌和/或其变体的方法的一个非限制性例子提供在实验部分中。
在一个实施方案中，从受试者得到粪便样品并转移进厌氧室(Coy)(含有，例如，100％N2或80％N2、15％CO2、5％H2作为气体气氛)并立即在适合的培养基中稀释(例如，在稀释度1/10)。适合的培养基的一个非限制性例子是改良YCFA(酵母提取物-酪蛋白水解物-脂肪酸)，其可以任选地富含抗氧化剂。
然后可以将粪便悬浮液转移进气密密封的管，例如，在约20％CO2-约80％N2或100％CO2的气氛下。
然后，可以使用消光稀释技术进行单细胞培养，使得单个小瓶平均容纳一个细胞。
在一个实施方案中，在约24h至约7天范围内的时间段后将阳性培养物铺展至含有适合的细胞培养基(例如，如本文中所述的改良YCFA培养基)的固体板上，并在具有吸收O2和产生CO2的试剂的厌氧罐中温育约72h至约7天范围内的时间段。然后可以挑出单个菌落并将其转移到新鲜培养基中，并重复该过程，直到培养物被认为是纯的。可以使用熟练的技术人员众所周知的方法评价培养物的纯化，例如，观察铺板的细菌，显微镜观察，其可以与荧光原位杂交(FISH)细胞计量术、PCR和/或对16s rRNA基因的测序、特别是使用多路下一代测序(NGS)技术组合，所述NGS技术允许鉴定和确定样品中不同细菌种的相对比例。
在一个实施方案中，通过使用特异性引物的核酸扩增反应可检测本发明的细菌和/或其变体。
在一个实施方案中，通过使用至少一种引物的核酸扩增反应可检测本发明的细菌和/或其变体，所述引物选自包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18或者由SEQ ID NO:17和SEQID NO:18组成的集合。
在一个实施方案中，通过使用序列SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物的核酸扩增反应可检测本发明的细菌和/或其变体。
本发明进一步涉及一种培养如本文中所述的分离的细菌的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在约37℃的温度在厌氧性气氛中(例如，在具有吸收O2和产生CO2的试剂的厌氧罐中)在适合的培养基中培养细菌细胞。
可以用于使本发明的细菌生长的确定的实验室培养基的组成的一个非限制性例子提供在下文的表1和2中。
在一个实施方案中，如下文实施例中所述进行本发明的细菌的培养。简而言之，但不限于，可以在如表1和2中所定义的改良YCFA(酵母提取物-酪蛋白水解物-脂肪酸)培养基中在20％CO2-80％N2或100％CO2气氛下在悬浮液中在37℃培养本发明的细菌48小时。
在一个实施方案中，所述改良YCFA培养基包含大豆蛋白胨，其量在超过0g/L至约20g/L、优选约2g/L至约6g/L范围内，更优选地量为约4g/L。
在一个实施方案中，所述改良YCFA培养基包含小麦蛋白胨，其量在超过0g/L至约20g/L、优选约2g/L至约6g/L范围内，更优选地量为约4g/L。
在一个实施方案中，所述改良YCFA培养基包含Na2CO3，其量在超过0g/L至约20g/L、优选约2g/L至约6g/L范围内，更优选地量为约4g/L。
在一个实施方案中，所述改良YCFA培养基包含MgCl2，其量在超过0mg/L至约500mg/L、优选约25mg/L至约75mg/L范围内，更优选地量为约50mg/L。
在一个实施方案中，所述改良YCFA培养基包含谷胱甘肽，其量在超过0g/L至约5g/L、优选约0.5g/L至约1.5g/L范围内，更优选地量为约1g/L。
在一个实施方案中，所述改良YCFA培养基包含抗坏血酸盐，其量在超过0g/L至约1g/L、优选约0.25g/L至约0.75g/L范围内，更优选地量为约0.5g/L。
在一个实施方案中，所述改良YCFA培养基包含尿酸，其量在超过0g/L至约1.2g/L、优选约0.2g/L至约0.4g/L范围内，更优选地量为约0.3g/L。
在一个实施方案中，所述改良YCFA培养基包含约4g/L的量的大豆蛋白胨，约4g/L的量的小麦蛋白胨，约50mg/L的量的Na2CO3，约1g/L的量的谷胱甘肽，约1g/L的量的抗坏血酸盐，约0.5g/L的量的抗坏血酸盐和约0.3g/L的量的尿酸。
在一个实施方案中，所述改良YCFA培养基如在表1和2中所定义。
本发明也涉及包含至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、由其组成或基本上由其组成的组合物。
如本文中使用的，参考组合物的术语”基本上由……组成”是指，至少一种本发明的细菌或其片段是所述组合物内唯一一种具有生物活性的药剂。
在一个实施方案中，本发明的组合物中的至少约0.5％的细菌细胞是本发明的细菌的细胞和/或其变体和/或其片段，优选本发明的组合物中的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的细菌细胞是本发明的细菌的细胞和/或其变体和/或其片段。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.102至约1.1015cfu/g组合物、优选约1.104至约1.1012cfu/g组合物、更优选约1.105至约1.1010cfu/g组合物和甚至更优选约1.106至约5.109cfu/g组合物的范围内的量的本发明的细菌和/或其变体。在一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.104至约1.1014cfu/g组合物、优选约1.105至约1.1013cfu/g组合物、更优选约1.106至约1.1012cfu/g组合物、甚至更优选约1.107至约1.1011cfu/g组合物、约1.108至约1.1010cfu/g组合物和甚至更优选约2.108至约6.109cfu/g组合物范围内的量的本发明的细菌和/或其变体。
本文中使用的“cfu”代表“菌落形成单位”。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.102至约1.1015cfu/mL组合物、优选约1.104至约1.1012cfu/mL组合物、更优选约1.105至约1.1010cfu/mL组合物和甚至更优选约1.106至约5.109cfu/mL组合物范围内的量的本发明的细菌和/或其变体。在一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.104至约1.1014cfu/mL组合物、优选约1.105至约1.1013cfu/mL组合物、更优选约1.106至约1.1012cfu/mL组合物、甚至更优选约1.107至约1.1011cfu/mL组合物、1.108至约1.1010cfu/mL组合物和甚至更优选约2.108至约6.109cfu/mL组合物范围内的量的本发明的细菌和/或其变体。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.106至约1.1010cfu/g组合物或cfu/mL组合物、优选约1.108至约1.1010cfu/g或cfu/mL、更优选约1.109至约1.1010cfu/g或cfu/mL范围内的量的本发明的细菌。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.106至约1.1011cfu/g组合物或cfu/mL组合物、优选约1.108至约1.1011cfu/g或cfu/mL、更优选约1.1010至约1.1011cfu/g或cfu/mL范围内的量的本发明的细菌。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.102至约1.1015个细胞/g组合物、优选约1.104至约1.1012个细胞/g组合物、更优选约1.105至约1.1010个细胞/g组合物和甚至更优选约1.106至约1.109个细胞/g组合物范围内的量的本发明的细菌和/或其变体。在一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.104至约1.1014个细胞/g组合物、优选约1.105至约1.1013个细胞/g组合物、更优选约1.106至约1.1012个细胞/g组合物、甚至更优选约1.107至约1.1011个细胞/g组合物、约1.108至约1.1010个细胞/g组合物和甚至更优选约1.109至约1.1010个细胞/g组合物范围内的量的本发明的细菌和/或其变体。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.102至约1.1015个细胞/mL组合物、优选约1.104至约1.1012个细胞/mL组合物、更优选约1.105至约1.1010个细胞/mL组合物和甚至更优选约1.106至约1.109个细胞/mL组合物范围内的量的本发明的细菌和/或其变体。在一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.104至约1.1014个细胞/mL组合物、优选约1.105至约1.1013个细胞/mL组合物、更优选约1.106至约1.1012个细胞/mL组合物、甚至更优选约1.107至约1.1011个细胞/mL组合物、约1.108至约1.1010个细胞/mL组合物和甚至更优选约1.109至约1.1010个细胞/mL组合物范围内的量的本发明的细菌和/或其变体。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.106至约1.1010个细胞/g组合物或个细胞/mL组合物、优选约1.108至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL、更优选约1.109至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL范围内的量的本发明的细菌。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含在约1.106至约1.1011个细胞/g组合物或个细胞/mL组合物、优选约1.108至约1.1011个细胞/g或个细胞/mL、更优选约1.1010至约1.1011个细胞/g或个细胞/mL范围内的量的本发明的细菌。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.102至约1.1015cfu/g组合物、优选约1.104至约1.1012cfu/g组合物、更优选约1.105至约1.1010cfu/g组合物和甚至更优选约1.106至约1.109cfu/g组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.104至约1.1014cfu/g组合物、优选约1.105至约1.1013cfu/g组合物、更优选约1.106至约1.1012cfu/g组合物、甚至更优选约1.107至约1.1011cfu/g组合物、约1.108至约1.1010cfu/g组合物和甚至更优选约2.108至约6.109cfu/g组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.102至约1.1015cfu/mL组合物、优选约1.104至约1.1012cfu/mL组合物、更优选约1.105至约1.1010cfu/mL组合物和甚至更优选约1.106至约1.109cfu/mL组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.104至约1.1014cfu/mL组合物、优选约1.105至约1.1013cfu/mL组合物、更优选约1.106至约1.1012cfu/mL组合物、甚至更优选约1.107至约1.1011cfu/mL组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.108至约1.1010cfu/mL组合物、优选约2.108至约6.109cfu/mL组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.106至约1.1010cfu/g组合物或cfu/mL组合物、优选约1.108至约1.1010cfu/g或cfu/mL、更优选约1.109至约1.1010cfu/g或cfu/mL范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌的片段，所述量对应于在约1.106至约1.1011cfu/g组合物或cfu/mL组合物、优选约1.108至约1.1011cfu/g或cfu/mL、更优选约1.1010至约1.1011cfu/g或cfu/mL范围内的本发明的细菌的量。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.102至约1.1015个细胞/g组合物、优选约1.104至约1.1012个细胞/g组合物、更优选约1.105至约1.1010个细胞/g组合物和甚至更优选约1.106至约1.109个细胞/g组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.104至约1.1014个细胞/g组合物、优选约1.105至约1.1013个细胞/g组合物、更优选约1.106至约1.1012个细胞/g组合物、甚至更优选约1.107至约1.1011个细胞/g组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.108至约1.1010个细胞/g组合物、优选约1.109至约1.1010个细胞/g组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.102至约1.1015个细胞/mL组合物、优选约1.104至约1.1012个细胞/mL组合物、更优选约1.105至约1.1010个细胞/mL组合物和甚至更优选约1.106至约1.109个细胞/mL组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.104至约1.1014个细胞/mL组合物、优选约1.105至约1.1013个细胞/mL组合物、更优选约1.106至约1.1012个细胞/mL组合物、甚至更优选约1.107至约1.1011个细胞/mL组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌和/或其变体的片段，所述量对应于在约1.108至约1.1010个细胞/mL组合物、优选约1.109至约1.1010个细胞/mL组合物范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌的片段，所述量对应于在约1.106至约1.1010个细胞/g组合物或个细胞/mL组合物、优选约1.108至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL、更优选约1.109至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL范围内的本发明的细菌的量。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本发明的细菌的片段，所述量对应于在约1.106至约1.1011个细胞/g组合物或个细胞/mL组合物、优选约1.108至约1.1011个细胞/g或个细胞/mL、更优选约1.1010至约1.1011个细胞/g或个细胞/mL范围内的本发明的细菌的量。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是巴氏灭菌的，且本文列举的量对应于巴氏灭菌步骤之前的量。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是冷冻的，且本文列举的量对应于冷冻步骤之前的量。在另一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体是冷冻的，且本文列举的量对应于冷冻步骤之后的量。
本发明也涉及作为益生菌的如上文中所述的至少一种细菌和/或其变体。在一个实施方案中，至少一种本发明的细菌、优选菌株J115和/或其变体是益生菌，其有益于改善受试者的胃肠环境。
本发明进一步涉及至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段的治疗用途。
在一个实施方案中，本发明的组合物是药物组合物或药物。
本发明因此也涉及包含根据本发明的细菌或组合物和至少一种药学上可接受的赋形剂、基本上由其组成或由其组成的药物组合物。
可以用在本发明的组合物中的药学上可接受的赋形剂包括、但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，诸如人血清白蛋白，海藻糖，缓冲物质，诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，二氧化硅，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质(例如羧甲纤维素钠)，聚乙二醇，聚丙烯酸酯，蜡类，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。
在一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗和/或预防与肠道小生物群有关的疾病，优选代谢疾病。
本发明进一步涉及包含根据本发明的细菌或组合物、基本上由其组成或由其组成的药物。本发明也涉及根据本发明的细菌或组合物用于制备药物的用途。
在一个实施方案中，所述药物用于治疗和/或预防与肠道小生物群有关的疾病，优选代谢疾病。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物或药物可以进一步含有抗氧化剂诸如抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、BHT、山梨酸钾或迷迭香(Rosmarinus officinalis)提取物。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物或药物可以进一步含有调味剂诸如糖、水果或茶芳香剂。
在一个实施方案中，可以在适当地与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)混合的水中制备包含至少一种本发明的细菌和/或其片段的组合物。
在一个实施方案中，还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备包含至少一种本发明的细菌和/或其片段的组合物。
在一个实施方案中，包含至少一种本发明的细菌和/或其片段的组合物可以包含载体，所述载体还可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物和植物油诸如油酸。
可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣，诸如卵磷脂(即，大豆卵磷脂或脱脂的大豆卵磷脂)，通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)和通过使用表面活性剂。
在许多情况下，优选地包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通常，通过如下制备分散体：将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和选自上面列举的那些的所需的其它成分。
在配制后，本发明的药物组合物或药物将以与剂量制剂相容的方式和以有效量施用。本发明的药物组合物或药物可以多种剂型(诸如药物释放胶囊剂等)施用。剂量的一些变化必然随所治疗的受试者的状况而出现。负责施用的人在任何情况下将确定各个受试者的适当剂量。
本发明的药物组合物和药物，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段(单独地或与另一种活性成分组合)可以以单位施用形式、作为与常规药物支持物的混合物施用给动物和人类。合适的单位施用形式包括口服途径形式，诸如片剂、凝胶胶囊剂、粉剂、颗粒剂和口服悬浮液或溶液、舌下和含服施用形式、气溶胶、植入物、皮下的、透皮的、局部的、腹膜内的、肌肉内的、静脉内的、真皮下的、透皮的、鞘内的和鼻内的施用形式以及直肠施用形式。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物或药物将全身性地或局部地施用，或者适合全身性地或局部地施用。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物或药物将如下施用或适合如下施用：口服地，含服地，通过注射，通过经皮施用，胃肠外地，腹膜内地，通过内窥镜检查术，局部地(topically)，透皮地，透粘膜地，经鼻地，通过吸入喷雾，直肠地，阴道地，气管内地，和经由植入的蓄池，或它们的任何组合。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物或药物将口服地施用，或适合口服地施用。适合口服施用的制剂的例子包括、但不限于固体形式、液体形式和凝胶。适合口服施用的固体形式的例子包括、但不限于丸剂、片剂、胶囊剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、糖衣丸、颗粒剂、囊片、压缩的片剂、扁囊剂、糯米纸囊剂、糖包衣丸剂、糖包衣片剂或分散和/或崩解片剂、粉末、适合于在口服施用前溶解或悬浮在液体中的固体形式和泡腾片。适合口服施用的液体形式的例子包括、但不限于溶液、悬浮液、可饮用的溶液、酏剂、密封小药瓶、饮剂、灌服药、糖浆剂、液剂和喷雾剂。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物或药物将直肠地施用，或适合直肠地施用。适合直肠施用的制剂的例子包括、但不限于：栓剂、微型灌肠剂、灌肠剂、凝胶、直肠泡沫、乳膏剂、软膏剂。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物或药物将注射或适合注射。适合注射的制剂的例子包括、但不限于液体溶液或悬浮液、适合于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。
全身注射的例子包括、但不限于静脉内的、肿瘤内的、颅内的、淋巴管内的、腹膜内的、肌肉内的、皮下的、真皮内的、关节内的、滑膜内的、胸骨内的、鞘内的、膀胱内的、肝内的、病灶内的、海绵窦内的输注技术和灌注。在另一个实施方案中，当注射时，本发明的组合物、药物组合物或药物是无菌的。用于得到无菌药物组合物的方法包括、但不限于GMP合成(GMP代表“良好生产规范”)。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物或药物将如下施用或适合如下施用：以立即释放形式。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物或药物将如下施用或适合如下施用：以混合释放形式。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物或药物将如下施用或适合如下施用：以肠包衣形式。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物或药物将如下施用或适合如下施用：以持续释放形式。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物或药物包含控制活性成分的释放的递送系统。
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物进一步包含至少一种额外的益生菌菌株或种，例如，细菌益生菌菌株或种；除了细菌以外的原核生物益生菌；或真菌菌株或种，优选酵母菌株或种。在一个实施方案中，所述额外的益生菌菌株或种选自天然存在于受试者的肠道中、优选存在于人肠道中、更优选存在于基本健康的人受试者的肠道中的那些。在一个实施方案中，所述额外的益生菌菌株或种选自并非相应地天然存在于受试者的肠道中的菌株或种，诸如在例如乳制品中发现的那些。
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物进一步包含至少一种细菌益生菌菌株或种，其选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、Akkermansia、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、德库菌属(Desemzia)、Christensenella、Allobaculum、粪球菌属(Coprococcus)、柯林斯菌属(Collinsella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、Turicibacter、萨特氏菌属(Sutterella)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、链球菌属(Streptococcus)、孢杆菌属(Sporobacter)、Sporacetigenium、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、变形菌属(Proteus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、Papillibacter、颤螺菌属(Oscillospira)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、多尔氏菌属(Dorea)、小杆菌属(Dialister)、梭菌属(Clostridium)、西地西菌属(Cedecea)、Catenibacterium、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、Bulleidia、嗜胆菌属(Bilophila)、拟杆菌属(Bacteroides)、Anaerovorax、Anaerostopes、厌氧细杆菌属(Anaerofilum)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、硬壁细菌类(Fermicutes)、奇异菌属(Atopobium)、另枝菌属(Alistipes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Slackie、志贺氏菌属(Shigella)、希瓦氏菌属(Shewanella)、沙雷氏菌属(Serratia)、马氏菌属(Mahella)、毛螺菌属(Lachnospira)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、海源菌属(Idiomarina)、梭杆菌属(Fusobacterium)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)和埃格特菌属(Eggerthella)或其混合物。
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物进一步包含至少一种原核生物菌株或种，其选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：古细菌(Archaea)、硬壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)(例如，Akkermansia muciniphila)、Christensenella、拟杆菌门(例如，Allistipes、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、内脏拟杆菌(Bacteroides splachnicus)、粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、副拟杆菌属、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、紫单胞菌科(Porphyromondaceae)和相关属)、变形菌门(Proteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)(例如，水杆菌属(Aquabacterium)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia))、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)(例如，黄单胞菌科(Xanthomonadaceae))、放线菌门(Actinobacteria)(例如，放线菌科(Actinomycetaceae)和奇异菌属)、甲烷杆菌科(Methanobacteria)、螺体属(Spirochaetes)、丝状杆菌属(Fibrobacteres)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌属(Deinococcus)、栖热菌属(Thermus)、蓝细菌(Cyanobacteria)、Methanobrevibacteria、瘤胃球菌属、粪球菌属、罕见小球菌属、多尔氏菌属、Bulleidia、Anaerofustis、孪生球菌属(Gemella)、罗斯氏菌属、小杆菌属、Anaerotruncus、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微球菌属(Micrococcus)、丙酸杆菌(Propionibacteria)、肠杆菌科、栖粪杆菌属、拟杆菌属、副拟杆菌属、普雷沃氏菌属、真杆菌属、杆菌(Bacilli)(例如，唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)和相关种、气球菌属(Aerococcus)、颗粒链菌属(Granulicatella)、牛链球菌(Streptococcus bovis)和相关属以及中间链球菌(Streptococcus intermedius)和相关属)、梭菌属(例如，霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)和相关属)和丁酸弧菌属(Butyrivibrio)或其混合物。
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物进一步包含至少一种真菌益生菌菌株或种，优选酵母益生菌菌株或种，其选自包含子囊菌纲(Ascomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)或由它们组成的集合，优选地选自以下集合：曲霉菌属(Aspergillus)、球拟酵母属(Torulopsis)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、酵母菌属(Saccharomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、酒香酵母属(Bretanomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、淀粉霉属(Amylomyces)、接合酵母属、内孢霉属(Endomycess)、生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、接合酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毛霉菌属(Mucor)、根霉菌属(Rhizopus)、子囊菌酵母属(Yarrowia)、内孢霉属(Endomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)和/或青霉属(Penicillium)或其混合物。
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物进一步包含至少一种益生元。
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物进一步包含至少一种益生元，所述益生元选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：肌-肌醇、菊粉和菊粉-型果聚糖、寡果糖、β-葡聚糖、木糖、阿拉伯糖、阿拉伯木聚糖、核糖、半乳糖、鼠李糖、纤维二糖、果糖、乳糖、水杨苷、蔗糖、葡萄糖、七叶甙、吐温80、海藻糖、麦芽糖、甘露糖、蜜二糖、粘液或粘蛋白、棉子糖、低聚果糖、低聚半乳糖、氨基酸、醇、可发酵的碳水化合物及它们的任何组合。
在一个特定实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物进一步包含肌-肌醇。
益生元的其它非限制性例子包括水溶性的纤维素衍生物、不溶于水的纤维素衍生物、未加工的燕麦片、欧车前亲水胶(metamucil)、全麸(all-bran)多酚及它们的任何组合。
水溶性的纤维素衍生物的例子包括、但不限于甲基纤维素、甲基乙基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、阳离子的羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素。
本发明也涉及用于它的单独、同时或依次施用的治疗组合产品。
本文中使用的术语“治疗组合产品”(其也可以被称作多部分的治疗试剂盒)表示包含至少两个下述部分或由其组成的产品：第一部分，其包含(优选以治疗有效量)本发明的细菌和/或其变体、根据本发明的组合物、根据本发明的药物组合物或根据本发明的药物；和包含组合物的第二部分，所述组合物包含至少一种益生菌和/或至少一种益生元和/或用于治疗用途的一种其它药物。在一个实施方案中，所述治疗组合产品用于治疗和/或预防与肠道小生物群有关的疾病，优选代谢疾病。
已知其在治疗和/或预防代谢疾病中的用途的其它药物的例子包括、但不限于磺酰脲(例如，醋酸己脲、氨磺丁脲、氯磺丙脲、格列环脲、美他己脲、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列波脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列派特、格列吡脲和格列美脲和它们的衍生物)；双胍类(例如，二甲双胍、苯乙双胍和丁福明)；α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖)；噻唑烷二酮(例如，吡格列酮、罗格列酮和洛贝格列酮)；HMG-CoA还原酶抑制剂(或他汀类药物)(例如，辛伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、美伐他汀、西立伐他汀、罗舒伐他汀和氟伐他汀)；二肽基肽酶4抑制剂(或格列汀类)(例如，西格列汀、维格列汀、sawagliptin、利拉利汀、吉格列汀、anagliptin、替格列汀、阿洛利汀、trelagliptin、omarigliptin、evogliptin、gosopliptin、度格列汀和小檗碱)；胰高血糖素-样肽类似物和激动剂(例如，艾塞那肽、利拉糖肽和利司那肽)；钠/葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂(例如，empagliflozin、达格列净、卡格列净、ipragliflozin、ertugliflozin、luseogliflozin、bexagliflozin、todogliflozin、henagliflozin、sotagliflozin、remogliflozin、sergliflozin和atigliflozin)；考来烯胺、考来维仑、考来替泊和依折麦布。
在一个实施方案中，同时施用根据本发明的治疗组合产品的至少两个部分。在另一个实施方案中，在不同的时间施用根据本发明的治疗组合产品的至少两个部分。在另一个实施方案中，依次施用根据本发明的治疗组合产品的至少两个部分。
在一个实施方案中，使用不同的施用途径施用根据本发明的治疗组合产品的至少两个部分(例如，一个部分通过口服施用，且第二个部分通过注射)。在另一个实施方案中，使用相同的施用途径(例如，口服施用或注射)施用根据本发明的治疗组合产品的至少两个部分。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、治疗组合产品用于用作药物。
本发明进一步涉及至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段，或本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品，其用于在有此需要的受试者中治疗和/或预防与胃肠小生物群有关的病症。
与胃肠小生物群有关的病症的例子包括、但不限于代谢疾病(例如，肥胖、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、糖尿病(例如，2型糖尿病)、葡萄糖耐受不良、高血糖症、异常的脂质代谢、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的LDL胆固醇、升高的甘油三酯、脂肪组织炎症和脂肪组织纤维化、感染、结肠炎(例如，炎性肠病(例如，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、缺血性结肠炎、肠易激综合征、淋巴细胞性结肠炎和胶原性结肠炎)、癌症(例如，结肠直肠癌)、免疫系统的功能障碍(例如，湿疹、变态反应、食物变态反应和乳糜泻)、心理学障碍(例如，应激、焦虑和成瘾)、神经学障碍(例如，帕金森病和阿尔茨海默氏病)、肝疾病(例如，肝硬化、非酒精性脂肪肝病和肝性脂肪变性)、恶病质、Prader-willy综合征、消化道的功能障碍(例如，溃疡和胆囊疾病)、摄食行为障碍(例如，神经性厌食、神经性贪食和暴食症)、心血管疾病和病况(例如，例如中风、动脉粥样硬化和高血压)、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎和炎性疾病。
在一个实施方案中，至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品用于疾病的治疗和/或预防，或用于用在疾病的治疗和/或预防中，所述疾病选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：代谢疾病、肥胖、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐受不良、高血糖症、异常的脂质代谢、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的LDL胆固醇、升高的甘油三酯、脂肪组织炎症、脂肪组织纤维化、感染、结肠炎、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、缺血性结肠炎、肠易激综合征、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、肠炎、癌症、结肠直肠癌、免疫系统的功能障碍、湿疹、变态反应、食物变态反应、乳糜泻、心理学障碍、应激、焦虑、成瘾、神经学障碍、帕金森病、阿尔茨海默氏病、肝疾病、肝硬化、非酒精性脂肪肝病、肝性脂肪变性、恶病质、Prader-willy综合征、消化道的功能障碍、溃疡、胆囊疾病、摄食行为障碍、神经性厌食、神经性贪食、暴食症、心血管疾病、中风、动脉粥样硬化和高血压、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎和炎性疾病。
在一个实施方案中，至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品用于疾病的治疗和/或预防，或用于用在疾病的治疗和/或预防中，所述疾病选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：代谢疾病、肥胖、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐受不良、高血糖症、异常的脂质代谢、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的LDL胆固醇、升高的甘油三酯、脂肪组织炎症、脂肪组织纤维化、感染、结肠炎、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、缺血性结肠炎、肠易激综合征、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、肠炎、食物变态反应、乳糜泻、溃疡、恶病质、Prader-willy综合征、摄食行为病症和暴食症。
在一个实施方案中，至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品用于疾病的治疗和/或预防，或用于用在疾病的治疗和/或预防中，所述疾病选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：代谢疾病、感染、结肠炎、肠炎、食物变态反应、乳糜泻、溃疡、恶病质、Prader-willy综合征和摄食行为病症。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是代谢疾病。
代谢疾病的例子包括、但不限于肥胖、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、糖尿病(例如，2型糖尿病)、葡萄糖耐受不良、异常的脂质代谢、高血糖症、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的HDL-胆固醇、升高的甘油三酯、脂肪组织炎症和脂肪组织纤维化。
在一个实施方案中，至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品是用于代谢疾病的治疗和/或预防，或用于用在代谢疾病的治疗和/或预防中，所述代谢疾病选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：肥胖、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐受不良、高血糖症、异常的脂质代谢、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的LDL胆固醇、升高的甘油三酯、脂肪组织炎症和脂肪组织纤维化。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是代谢疾病，优选地选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：肥胖，糖尿病、优选2型糖尿病，代谢综合征，胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症和葡萄糖耐受不良。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是肥胖。在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是2型糖尿病。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是代谢疾病，优选地选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：异常的脂质代谢、高血糖症、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的HDL-胆固醇和升高的甘油三酯。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是感染。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是结肠炎，优选地选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：炎性肠病(例如，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、缺血性结肠炎、肠易激综合征、淋巴细胞性结肠炎和胶原性结肠炎。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是癌症，优选结肠直肠癌。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是免疫系统的功能障碍，优选地选自包含湿疹、变态反应、食物变态反应和乳糜泻的集合。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：食物变态反应和乳糜泻。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是心理学病症，优选地选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：应激、焦虑和成瘾。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是神经学病症，优选地选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：帕金森病和阿尔茨海默氏病。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是肝病，优选地选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：肝硬化、非酒精性脂肪肝病和肝性脂肪变性。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是恶病质。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是Prader-willy综合征。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是消化道的功能障碍，优选地选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：溃疡和胆囊疾病。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是进食行为障碍，优选地选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：神经性厌食、神经性贪食和暴食症。
在一个实施方案中，所述与胃肠小生物群有关的病症是心血管疾病或病况，优选地选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：中风、动脉粥样硬化和高血压。
在一个实施方案中，至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品是用于炎性疾病的治疗和/或预防，或用于用在炎性疾病的治疗和/或预防中。在一个实施方案中，所述炎性疾病选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：脂肪组织炎症、脂肪组织功能障碍、结肠炎和肠炎。
发明人已经观察到，本发明的细菌在肠道小生物群中的存在促进肠上皮屏障的完整性。除了它在代谢功能中的重要性(尤其是在1型糖尿病中)外，已经发现肠上皮屏障的完整性的降低与几种其它疾病有关，所述疾病例如感染、结肠炎、肠炎、湿疹、变态反应、食物变态反应、肝疾病、炎性肠病(例如，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、乳糜泻和心理学障碍(例如，焦虑、应激和成瘾)。
本发明因此进一步涉及本发明的细菌和/或其变体和/或其片段，或本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品，其用于治疗和/或预防与增加的上皮屏障渗透性有关的疾病或用于用在所述用途中。与增加的上皮屏障渗透性有关的疾病的例子包括、但不限于感染、结肠炎、肠炎、I型糖尿病、湿疹、变态反应、食物变态反应、肝疾病、炎性肠病(例如，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、乳糜泻和心理学障碍(例如，焦虑、应激和成瘾)。
在一个实施方案中，至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品用于治疗与肠上皮屏障的完整性有关的疾病，或用于用在治疗与肠上皮屏障的完整性有关的疾病中。在一个实施方案中，与肠上皮屏障的完整性有关的疾病选自包含以下成员或由以下成员组成的集合：感染、结肠炎、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、缺血性结肠炎、肠易激综合征、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、肠炎、乳糜泻和食物变态反应。
本发明涉及一种用于治疗和/或预防受试者中的病症的方法，所述病症选自代谢疾病、肥胖、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐受不良、高血糖症、异常的脂质代谢、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的LDL胆固醇、升高的甘油三酯、脂肪组织炎症、脂肪组织纤维化、感染、结肠炎、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、缺血性结肠炎、肠易激综合征、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、肠炎、癌症、结肠直肠癌、免疫系统的功能障碍、湿疹、变态反应、食物变态反应、乳糜泻、心理学障碍、应激、焦虑、成瘾、神经学障碍、帕金森病、阿尔茨海默氏病、肝疾病、肝硬化、非酒精性脂肪肝病、肝性脂肪变性、恶病质、Prader-willy综合征、消化道的功能障碍、溃疡、胆囊疾病、摄食行为障碍、神经性厌食、神经性贪食、暴食症、心血管疾病、中风、动脉粥样硬化和高血压、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎和炎性疾病，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于治疗和/或预防受试者中的病症的方法，所述病症选自代谢疾病、肥胖、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐受不良、高血糖症、异常的脂质代谢、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的LDL胆固醇、升高的甘油三酯、脂肪组织炎症、脂肪组织纤维化、感染、结肠炎、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、缺血性结肠炎、肠易激综合征、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、肠炎、食物变态反应、乳糜泻、溃疡、恶病质、Prader-willy综合征、摄食行为病症和暴食症，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于治疗和/或预防受试者中的病症的方法，所述病症选自代谢疾病、感染、结肠炎、肠炎、食物变态反应、乳糜泻、溃疡、恶病质、Prader-willy综合征和摄食行为病症，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于治疗和/或预防受试者中的代谢疾病的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。在一个实施方案中，所述方法用于治疗和/或预防选自包含以下成员或由以下成员组成的集合的疾病：肥胖、糖尿病、优选2型糖尿病、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症和葡萄糖耐受不良。
在一个实施方案中，所述方法用于在有此需要的受试者中治疗和/或预防肥胖。在一个实施方案中，所述方法用于在有此需要的受试者中治疗和/或预防II型糖尿病。
本发明涉及一种用于治疗和/或预防受试者中与肠上皮屏障的完整性有关的病症的方法，所述病症优选地选自感染、结肠炎、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、缺血性结肠炎、肠易激综合征、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、肠炎、乳糜泻和食物变态反应，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
在一个实施方案中，所述受试者是人。
在一个实施方案中，所述受试者被诊断出具有与胃肠小生物群有关的病症。
在一个实施方案中，所述受试者处于发生与胃肠小生物群有关的病症的风险中。风险因素的例子可以包括、但不限于受试者是超重或肥胖的事实，或这样的病症的倾向，例如，家族性倾向。
在一个实施方案中，所述受试者是肥胖的。本文中使用的术语“肥胖的”在本文中表示一种医学病况，其中受试者优选地具有高于约30、优选地高于约35、更优选地高于约40的BMI。
“BMI”或“身体质量指数”被定义为受试者的体重(按千克计)除以其高度(按米计)的平方。在医学中普遍使用的公式产生kg/m2的测量单位。
发明人已经估计，存在于基本上健康的受试者的肠道小生物群中的本发明的细菌的比例是在受试者的粪便中发现的总细菌的约0.1％至5％，优选约0.5％至4％，更优选约0.8％至3％范围内。在一个实施方案中，存在于基本上健康的受试者的肠道小生物群中的本发明的细菌的比例是在受试者的粪便中发现的总细菌的约2.45％。
在本发明的一个实施方案中，所述受试者呈现肠道小生物群组成的失调。优选地，所述受试者的肠道小生物群中本发明的细菌被耗竭，更优选地与基本上健康的受试者的肠道小生物群相比。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品将以熟练的技术人员和适合每位受试者的人员确定的剂量施用。
另外，用于任何特定受试者的具体治疗有效量将取决于多种因素，包括采用的具体组合物，受试者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间，施用途径，治疗的持续时间；与本发明的组合物联合或同时使用的药物；和医学、营养制品和美容领域中众所周知的类似因素。
在一个实施方案中，治疗有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品要施用每天至少1次、每天至少2次、每天至少3次。
在一个实施方案中，治疗有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品要每2、3、4、5、6天施用1次。
在一个实施方案中，治疗有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品要施用每周2次、每周1次、每2周1次、每个月1次。
在一个实施方案中，治疗有效的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品要每个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每年1次施用。
在一个实施方案中，治疗有效的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品要施用约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年的时间段或更长的时间段，例如，几年或受试者的余生。
在一个实施方案中，当本发明的治疗组合产品要施用给受试者时，可以以不同的频率和不同的时间段施用所述组合产品的每个部分。
用于任何特定受试者的具体治疗有效量将取决于多种因素，包括所治疗的疾病和疾病的严重程度。例如，以低于获得期望的治疗效果所需的水平的水平开始治疗性化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到期望的效果，这完全在本领域的技术范围内；但是相反，以负荷剂量开始可以同样是有用的，这是一种更快速地达到稳态血浆浓度的方式(也被称作推注)，且然后任选地，遵循计算出的维持剂量以准确地补偿消除过程的影响。
应该理解，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。
在一个实施方案中，要施用治疗有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、或本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品，直到治疗或减轻与胃肠小生物群有关的病症；或直到已经达到期望的治疗效果。
与本发明的细菌的施用有关的期望治疗效果的例子包括、但不限于：在受试者的肠道中恢复本发明的细菌的正常比例(其优选由在基本上健康的受试者的肠道中测量的本发明的细菌的比例来定义)，在受试者的肠道中本发明的细菌的比例的增加，在受试者的肠道中本发明的细菌的任何活性化合物的丰度的增加，葡萄糖耐受不良的减少，胰岛素抗性的减少，肠道肠屏障的渗透性的降低，在上皮屏障的建立和/或维持中涉及的基因(诸如编码闭合蛋白、密蛋白、连接粘附分子(JAM)、E-钙粘着蛋白、连环蛋白、连接素、afadin、zonulin和闭锁小带(ZO)-1、ZO-2和ZO-3的基因)的表达水平的增加，肠上皮的粘液分泌的增加，胰高血糖素原、胰高血糖素-样肽1(GLP-1)和/或胰高血糖素-样肽2(GLP-2)的水平的增加，饮食诱导的禁食高血糖的下降，受试者中肠道小生物群的其它微生物的生长和/或生物活性的抑制和/或活化，辅助防御外源病原性细菌，辅助在受试者的肠道中抗细菌化合物、维生素、SCFA、乙酸盐、乙酸、丙酸盐、丙酸、异丙酸盐、异丙酸戊酸盐、戊酸、异戊酸盐、异戊酸、异丁酸盐、异丁酸、丁酸盐和/或丁酸的消化和产生的增加。
在一个实施方案中，要施用治疗有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品用于长期治疗。在另一个实施方案中，要施用治疗有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、药物组合物、药物或治疗组合产品用于短期治疗。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌和/或其变体的治疗有效量是在约1.102至约1.1015cfu/天、优选约1.105至约1.1012cfu/天、更优选约1.108至约1.1010cfu/天和甚至更优选约1.109至约1.1010cfu/天范围内。在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌和/或其变体的治疗有效量是在约1.107至约1.1010cfu/天、优选约1.108至约1.109cfu/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的治疗有效量是在约1.106至约1.1010cfu/天、优选约1.108至约1.1010cfu/天、更优选约1.109至约1.1010cfu/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的治疗有效量是在约1.106至约1.1011cfu/天、优选约1.108至约1.1011cfu/天、更优选约1.1010至约1.1011cfu/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌和/或其变体的治疗有效量是在约1.102至约1.1015个细胞/天、优选约1.105至约1.1012个细胞/天、更优选约1.108至约1.1011个细胞/天和甚至更优选约1.109至约1.1010个细胞/天范围内。在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌和/或其变体的治疗有效量是在约1.108至约1.1011个细胞/天、优选约5.108至约5.1010个细胞/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的治疗有效量是在约1.106至约1.1010个细胞/天、优选约1.108至约1.1010个细胞/天、更优选约1.109至约1.1010个细胞/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的治疗有效量是在约1.106至约1.1011个细胞/天、优选约1.108至约1.1011个细胞/天、更优选约1.1010至约1.1011个细胞/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的治疗有效量对应于在约1.102至约1.1015cfu/天、优选约1.105至约1.1012cfu/天、更优选约1.108至约1.1010cfu/天和甚至更优选约1.109至约1.1010cfu/天范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的治疗有效量对应于在约1.107至约1.1010cfu/天、优选约1.108至约1.109cfu/天范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的治疗有效量对应于在约1.106至约1.1010cfu/天、优选约1.108至约1.1010cfu/天、更优选约1.109至约1.1010cfu/天范围内的本发明的细菌的量。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的治疗有效量对应于在约1.106至约1.1011cfu/天、优选约1.108至约1.1011cfu/天、更优选约1.1010至约1.1011cfu/天范围内的本发明的细菌的量。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的治疗有效量对应于在约1.102至约1.1015个细胞/天、优选约1.105至约1.1012个细胞/天、更优选约1.108至约1.1011个细胞/天和甚至更优选约1.109至约1.1010个细胞/天范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的治疗有效量对应于在1.108至约1.1011个细胞/天、优选约5.108至约5.1010个细胞/天范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的治疗有效量对应于在约1.106至约1.1010个细胞/天、优选约1.108至约1.1010个细胞/天、更优选约1.109至约1.1010个细胞/天范围内的本发明的细菌的量。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的治疗有效量对应于在约1.106至约1.1011个细胞/天、优选约1.108至约1.1011个细胞/天、更优选约1.1010至约1.1011个细胞/天范围内的本发明的细菌的量。
本发明也涉及至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段用于在受试者中获得生理学益处、改善健康状况或减轻不适的营养制品用途。
本发明进一步涉及至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段用于改善受试者本人和/或其他人对受试者的外观的感觉的美容用途。
在一个实施方案中，本发明的组合物呈食品添加剂、饮料添加剂、饮食补充物、营养产品、医疗食品或营养制品组合物的形式。
本发明进一步涉及一种营养制品组合物，其包含根据本发明的组合物和至少一种营养制品可接受的赋形剂。
本发明进一步涉及一种美容组合物，其包含根据本发明的组合物和至少一种美容上可接受的赋形剂。
在本发明的营养制品或美容组合物中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段单独地或与另一种活性成分组合地可以作为与常规支持物的混合物以单位施用形式施用给动物和人类。合适的单位施用形式包含口服途径形式，诸如片剂、凝胶胶囊剂、粉剂、颗粒剂和口服悬浮液或溶液剂、舌下和含服施用形式、气溶胶、植入物、皮下的、透皮的、局部的(topical)、腹膜内的、肌肉内的、静脉内的、真皮下的、鞘内的、鼻内的和直肠的施用形式。
在一个实施方案中，根据本发明的营养制品或美容组合物可以用作食品和饮料的饮食补充物。
根据本发明的营养制品或美容组合物可以进一步含有保护性水胶体(诸如树胶、蛋白、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包囊剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣剂、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡类、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填充剂、共化合物、分散剂、湿润剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、掩味剂、增重剂、胶凝剂、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗微生物剂。
此外，可以将多种维生素和矿物质补充剂添加至本发明的营养制品或美容组合物中以获得足够量的在一些饮食中缺失的必需营养物。多种维生素和矿物质补充剂还可用于疾病预防和保护免于由生活方式模式造成的营养损失和缺乏。
根据本发明的营养制品或美容组合物可以呈适合于向身体施用的任何剂型(galenic form)，尤其是呈常规用于口服施用的任何形式。
在一个实施方案中，本发明的营养制品或美容组合物要被口服施用。
适合口服施用的制剂的例子包括、但不限于固体形式、液体形式和凝胶。适合口服施用的固体形式的例子包括、但不限于丸剂、片剂、胶囊剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、糖衣丸、颗粒剂、囊片、压缩的片剂、扁囊剂、糯米纸囊剂、糖包衣丸剂、糖包衣片剂或分散和/或崩解片剂、粉末、适合于在口服施用前溶解或悬浮在液体中的固体形式和泡腾片。适合口服施用的液体形式的例子包括、但不限于溶液、悬浮液、可饮用的溶液、酏剂、密封小药瓶、饮剂、灌服药、糖浆剂、液剂和喷雾剂。
适合口服施用的固体形式的其它例子包括、但不限于食品或饲料(的添加剂/补充剂)、食品或饲料预混合物、强化食品或饲料、片剂、丸剂、颗粒、糖衣丸、胶囊剂和泡腾制剂，诸如粉剂和片剂。
适合口服施用的液体形式的其它例子包括、但不限于溶液、乳剂或悬浮液，例如饮料、糊剂和油性悬浮液。可以将糊剂掺入硬壳或软壳胶囊中，由此该胶囊特征在于例如(鱼、猪、家禽、牛)明胶、植物蛋白或木素磺酸盐的基质。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物、营养制品组合物或美容组合物呈营养组合物的形式，即包含液体或固体食品、饲料或饮用水。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物、营养制品组合物或美容组合物是食物产品，例如，乳制品、乳饮料、酸乳、水果汁或蔬菜汁或其浓缩物、粉末、基于麦芽或大豆或谷物的饮料、早餐用谷物(诸如什锦谷物早餐片(muesli flake))、水果和蔬菜汁粉末、谷物和/或巧克力条、糖果、涂抹酱、面粉、奶、果昔、糖果、奶制品、奶粉、重构奶、培养奶(cultured milk)、酸乳酪、饮用酸乳酪、凝固型酸乳酪、饮料、乳饮料、奶制饮料、巧克力、凝胶、冰淇淋、谷物、重构水果产品、零食棒、食物棒、什锦谷物早餐棒(muesli bar)、涂抹酱、调味酱、蘸酱、乳制品(包括酸乳酪和奶酪)、饮料(包括基于乳和非基于乳的饮料)、运动补充剂(包括基于乳和非基于乳的运动补充剂)。
食品的例子是乳制品，包括、但不限于，人造黄油、涂抹酱、黄油、奶酪、香肠、调味料、酸乳酪、乳饮料、冰淇淋、树胶、口香糖、胶质糖果、太妃糖、焦糖糖果、软糖和硬糖。
强化食品的例子包括、但不限于甜玉米、面包、谷物棒、烘焙食品(诸如蛋糕、派和饼干)以及马铃薯片或条。
饮料包括非酒精饮料和酒精饮料，以及要添加到饮用水和液体食品中的液体制剂。非酒精饮料包括、但不限于软饮料、运动饮料、能量饮料、果汁、柠檬水、苏打水、茶水和基于奶的饮料。液体食品包括、但不限于汤和乳制品。
在一个实施方案中，本发明的组合物、营养制品组合物或美容组合物进一步包含额外的益生菌菌株或种，例如，细菌益生菌菌株或种；除了细菌以外的原核生物益生菌；或真菌菌株或种，优选酵母菌株或种。在一个实施方案中，所述额外的益生菌菌株或种选自天然存在于受试者的肠道中、优选存在于人肠道中、更优选存在于基本健康的人受试者的肠道中的那些。在上文中列出了益生菌菌株的例子。
在一个实施方案中，本发明的组合物、营养制品组合物或美容组合物进一步包含益生元。在上文中列出了益生元化合物的例子。
本发明也涉及用于其单独、同时或依次施用的营养制品或美容组合产品。
本文中使用的术语“营养制品或美容组合产品”(其也可以被称作营养制品或美容多部分试剂盒)表示包含至少2个下述部分或由其组成的产品：第一部分，其包含(优选地以营养制品上或美容上有效的量)本发明的细菌和/或其变体、根据本发明的组合物、根据本发明的营养制品组合物、或根据本发明的美容组合物；和包含组合物的第二部分，所述组合物包含至少一种益生菌和/或至少一种益生元。
在一个实施方案中，同时施用根据本发明的营养制品或美容组合产品的至少两个部分。在另一个实施方案中，在不同的时间施用根据本发明的营养制品或美容组合产品的至少两个部分。在另一个实施方案中，依次施用根据本发明的营养制品或美容组合产品的至少两个部分。
在一个实施方案中，使用不同的施用途径施用根据本发明的营养制品或美容组合产品的至少两个部分(例如，一个部分通过口服施用，且第二个部分通过注射)。在另一个实施方案中，使用相同的施用途径(例如，口服施用或注射)施用根据本发明的营养制品或美容组合产品的至少两个部分。
本发明进一步涉及用于在受试者中改善健康状况、得到生理学益处和/或得到美容益处的非治疗性方法，其中所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、或本发明的组合物、营养制品组合物或组合产品、或美容组合物或组合产品。
本发明因此涉及本发明的细菌和/或其变体和/或其片段的营养制品或美容用途。
在一个实施方案中，本发明的方法包括给受试者施用美容有效量的本发明的细菌和/或其片段、本发明的组合物或美容组合物。
在一个实施方案中，本发明的方法包括给受试者施用营养制品有效量的本发明的细菌和/或其片段、或本发明的组合物或营养制品组合物或组合产品。
本文中使用的术语“生理学益处”表示在受试者中生理功能的效率的增加，或在受试者中不适的部分或完全减轻。
本文中使用的术语“健康状况”表示受试者对他自身的健康状况的感觉的改善。
本文中使用的术语“美容益处”表示受试者本人和/或其他人对受试者的外观的感觉的改善。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种用于改善受试者的健康状况的方法。本发明因此涉及本发明的细菌和/或其变体和/或其片段用于改善受试者的健康状况的用途。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种用于促进受试者的重量减轻的方法。本发明因此涉及本发明的细菌和/或其变体和/或其片段用于促进受试者的重量减轻的用途。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种用于减少受试者的食物摄入的方法。本发明因此涉及本发明的细菌和/或其变体和/或其片段用于减少受试者的食物摄入的用途。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种用于增加受试者的肌肉量的方法。本发明因此涉及本发明的细菌和/或其变体和/或其片段用于增加受试者的肌肉量的用途。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种用于减少受试者的脂肪量的方法。本发明因此涉及本发明的细菌和/或其变体和/或其片段用于减少受试者的脂肪量的用途。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段减少异常的脂肪积累、改变的脂解和高脂肪储存。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段增加脂解。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种用于增加受试者的饱感的方法。本发明因此涉及本发明的细菌和/或其变体和/或其片段用于增加受试者的饱感的用途。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种用于在受试者中减少与食物摄入有关的重量增加的方法。本发明因此涉及本发明的细菌和/或其变体和/或其片段用于在受试者中减少与食物摄入有关的重量增加的用途。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种用于在受试者中减少与食物摄入有关的肠吸收的方法。本发明因此涉及本发明的细菌和/或其变体和/或其片段用于在受试者中减少与食物摄入有关的肠吸收的用途。
在一个实施方案中，所述受试者是基本上健康的，尤其在与肠道小生物群有关的病症方面。
在一个实施方案中，所述受试者不是肥胖的。在一个实施方案中，所述受试者具有低于约40、优选地低于约35、更优选地低于约30的BMI。在一个实施方案中，所述受试者不是超重的。在一个实施方案中，所述受试者具有低于约30、更优选地低于约25的BMI。
在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、本发明的组合物、营养制品组合物或组合产品、或美容组合物或组合产品将以熟练的技术人员和适合每位受试者的人员确定的剂量施用。
另外，用于任何特定受试者的具体营养制品或美容有效量将取决于多种因素，包括采用的具体组合物，受试者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间，施用途径，治疗的持续时间；与本发明的组合物联合或同时使用的药物；和医学、营养制品和美容领域中众所周知的类似因素。
在一个实施方案中，营养制品或美容有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、或本发明的组合物、营养制品组合物或组合产品、或美容组合物或组合产品要施用每天至少1次、每天至少2次、每天至少3次。
在一个实施方案中，营养制品或美容有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、或本发明的组合物、营养制品组合物或组合产品、或美容组合物或组合产品要每2、3、4、5、6天施用1次。
在一个实施方案中，营养制品或美容有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、或本发明的组合物、营养制品组合物或组合产品、或美容组合物或组合产品要施用每周2次、每周1次、每2周1次、每个月1次。
在一个实施方案中，营养制品或美容有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、或本发明的组合物、营养制品组合物或组合产品、或美容组合物或组合产品要每个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每年1次施用。
在一个实施方案中，营养制品或美容有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、或本发明的组合物、营养制品组合物或组合产品、或美容组合物或组合产品要施用约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年的时间段或更长的时间段，例如，几年或受试者的余生。
在一个实施方案中，当本发明的营养制品或美容组合产品要施用给受试者时，可以以不同的频率和不同的时间段施用所述组合产品的每个部分。
在一个实施方案中，要施用营养制品或美容有效量的本发明的细菌和/或其变体和/或其片段、或本发明的组合物、营养制品组合物或组合产品、或美容组合物或组合产品，直到已经实现期望的生理学或美容益处。
生理学或美容益处的例子包括、但不限于健康状况的改善、重量减轻、肌肉量的增加、脂肪量的减少、食物摄入的减少、饱感的增加、与食物摄入有关的重量增加的减少、与食物摄入有关的肠吸收的减少。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌和/或其变体的营养制品或美容有效量是在约1.102至约1.1015cfu/天、优选约1.105至约1.1012cfu/天、更优选约1.108至约1.1010cfu/天和甚至更优选约1.109至约1.1010cfu/天范围内。在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌和/或其变体的营养制品或美容有效量是在约1.107至约1.1011cfu/天、优选约1.108至约1.1010cfu/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的营养制品或美容有效量是在约1.106至约1.1010cfu/天、优选约1.108至约1.1010cfu/天、更优选约1.109至约1.1010cfu/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的营养制品或美容有效量是在约1.106至约1.1011cfu/天、优选约1.108至约1.1011cfu/天、更优选约1.1010至约1.1011cfu/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌和/或其变体的营养制品或美容有效量是在约1.102至约1.1015个细胞/天、优选约1.105至约1.1012个细胞/天、更优选约1.108至约1.1010个细胞/天和甚至更优选约1.109至约1.1010个细胞/天范围内。在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌和/或其变体的营养制品或美容有效量是在约1.108至约1.1011个细胞/天、优选约5.108至约5.1010个细胞/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的营养制品或美容有效量是在约1.106至约1.1010个细胞/天、优选约1.108至约1.1010个细胞/天、更优选约1.109至约1.1010个细胞/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的营养制品或美容有效量是在约1.106至约1.1011个细胞/天、优选约1.108至约1.1011个细胞/天、更优选约1.1010至约1.1011个细胞/天范围内。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的营养制品或美容有效量对应于在约1.102至约1.1015cfu/天、优选约1.105至约1.1012cfu/天、更优选约1.108至约1.1010cfu/天和甚至更优选约1.109至约1.1010cfu/天范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的营养制品或美容有效量对应于在约1.107至约1.1011cfu/天、优选约1.108至约1.1010cfu/天范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的营养制品或美容有效量对应于在约1.106至约1.1010cfu/天、优选约1.108至约1.1010cfu/天、更优选约1.109至约1.1010cfu/天范围内的本发明的细菌的量。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的营养制品或美容有效量对应于在约1.106至约1.1011cfu/天、优选约1.108至约1.1011cfu/天、更优选约1.1010至约1.1011cfu/天范围内的本发明的细菌的量。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的营养制品或美容有效量对应于在约1.102至约1.1015个细胞/天、优选约1.105至约1.1012个细胞/天、更优选约1.108至约1.1011个细胞/天和甚至更优选约1.109至约1.1010个细胞/天范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的营养制品或美容有效量对应于在约1.108至约1.1011个细胞/天、优选约5.108至约5.1010个细胞/天范围内的本发明的细菌和/或其变体的量。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的营养制品或美容有效量对应于在约1.106至约1.1010个细胞/天、优选约1.108至约1.1010个细胞/天、更优选约1.109至约1.1010个细胞/天范围内的本发明的细菌的量。
在一个实施方案中，每天施用的本发明的细菌的片段的营养制品或美容有效量对应于在约1.106至约1.1011个细胞/天、优选约1.108至约1.1011个细胞/天、更优选约1.1010至约1.1011个细胞/天范围内的本发明的细菌的量。
本发明涉及一种用于在受试者中治疗与胃肠小生物群有关的病症的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明也涉及一种用于在受试者中恢复和/或增强与肠道小生物群有关的功能的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于在受试者中减少葡萄糖耐受不良和/或胰岛素抗性的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于恢复存在于有此需要的受试者的肠道小生物群中的本发明的细菌的正常比例的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。在一个实施方案中，所述正常比例对应于在基本上健康的受试者中观察到的比例。在一个实施方案中，所述正常比例是在受试者的粪便中发现的总细菌的约0.1％至约5％，优选约0.5％至约4％，更优选约0.8％至约3％。在一个实施方案中，基本上健康的受试者中的正常比例是在受试者的粪便中发现的总细菌的约2.45％。在一个实施方案中，所述正常比例是在基本上健康的受试者的粪便中发现的总细菌的至少0.5％，优选至少0.6％、0.7％、0.8％、0.85％、0.90％、0.95％、1％、1.05％、1.10％、1.15％、1.20％、1.25％、1.30％、1.35％、1.40％、1.45％、更优选至少1.50％、1.55％、1.60％、1.65％、1.70％、1.75％、1.80％、1.85％、1.90％、2％、2.05％、2.10％、2.15％、2.20％、2.25％、2.30％、2.35％、2.40％或更多。
用于确定本发明的细菌的存在和/或比例的技术是熟练的技术人员已知的，且包括、但不限于：PCR、qPCR、杂交技术(FISH、RNA印迹)、细菌鉴定试剂盒和DNA或RNA测序和免疫检测技术。
本发明涉及一种用于在受试者中降低肠道肠屏障的渗透性的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于增加在上皮屏障的建立和/或维持中所涉及的基因的表达水平的方法，所述基因是例如编码粘蛋白(muc-包括、但不限于粘蛋白2)、闭合蛋白、密蛋白(cldn-包括、但不限于密蛋白3、4、7、15和23)、防卫素(defa-包括、但不限于防卫素5、17、21、22、24、30、34)、再生岛-衍生的蛋白(reg-包括、但不限于再生岛-衍生的蛋白1、3a、3b和3g)、连接粘附分子(JAM)、E-钙粘着蛋白、连环蛋白、连接素、afadin、zonulin和闭锁小带(ZO)-1、ZO-2和ZO-3的基因，其中本发明的方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于增加肠上皮的粘液分泌的方法，其中本发明的方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于增加受试者中胰高血糖素原和/或胰高血糖素-样肽1(GLP-1)和/或胰高血糖素-样肽2(GLP-2)的水平的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减少受试者中脂肪组织的纤维化的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减少受试者的脂肪组织中的纤维化所涉及的基因的表达的方法，所述基因优选选自包含以下成员或由以下成员组成的集合的基因：Thbs2、Col6a2、S100a6、Myoc、Col1a2、Col1a1、Col5a2、Col3a1、Ntn1、Ctsc2、Serpinf1、Adamts4、Col6a1、Anxa1、Nid2、Cilp、Lum和Mmp14，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减少受试者的棕色脂肪组织中的纤维化所涉及的基因的表达的方法，所述基因优选选自包含以下成员或由以下成员组成的集合的基因：Thbs2、Col6a2、S100a6、Myoc、Col1a2、Col1a1、Col5a2、Col3a1、Ntn1、Ctsc2、Serpinf1、Adamts4、Col6a1、Anxa1、Nid2、Cilp、Lum、Mmp14和Col10a，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减少受试者的皮下脂肪组织中的纤维化所涉及的基因的表达的方法，所述基因优选选自包含以下成员或由以下成员组成的集合的基因：Thbs2、Adamts12、Lum、Cela1、S100a6、Cilp、Ctsc2、Serpinf1、Anxa1、Mmp14、Col1a2、Col3a1、Col5a2、Col6a1、Col6a2、Col1a1、Myoc、Nid2、Ntn1和Adamts4，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减少受试者中脂肪组织、优选棕色脂肪组织的炎症的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减少受试者的脂肪组织、优选棕色脂肪组织的炎症所涉及的基因的表达的方法，所述基因优选选自包含以下成员或由以下成员组成的集合的基因：Naip6、Anxa1、Lbp、Ccl6、Pycard、F2rl1、Ccl9、Smpdl3b、Cela1、Tnfrsf1b、Cd5l、Ptafr、C3ar1、Pf4、Loxl3、Ccr5、Saa3、Ccr1、Adra2a、Tlr13、Ccl2、Alox5、Fcgr1、Ccl7、Ccl8、Ptgs2、Havcr2、Relb2、Ticam2、Stab1、Themis2_2、Tlr11、Ptger2、Orm2、Cxcr3、Pxk1、Pelb1、Nlrp10、Ccl12、Ppbp、Cd180、C、cl3、Ptgir2、Ptgir1、Chst1_2、Adma8、Nrros、Ptger1和Themis2_1，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减轻受试者中饮食诱导的禁食高血糖症的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于增加受试者的能量消耗的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减少受试者的能量肠吸收的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
当共享相同的环境时，微生物之间的相互作用可能导致竞争和/或协同效应。
本发明因此进一步涉及一种用于在受试者中活化肠道小生物群的其它微生物的生长和/或生物活性的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明也涉及一种用于在受试者中抑制肠道小生物群的其它微生物的生长和/或生物活性的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明也涉及一种用于在受试者中辅助防御外源病原性细菌的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于增加受试者中抗细菌化合物的产生的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于增加受试者中防卫素的产生的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
肠道小生物群的细菌通过参与消化和产生维生素而参与它们的宿主的代谢。
本发明因此进一步涉及一种用于在受试者中辅助消化和/或产生维生素的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
由肠道小生物群的厌氧细菌产生的丁酸盐在能量代谢和相关代谢疾病方面对宿主健康具有多种有益作用，它还具有免疫调节、抗微生物和抗癌作用。作为本发明的细菌，属于梭菌簇IV的细菌是主要的丁酸盐生产者。除了丁酸盐的唯一作用外，其它短链脂肪酸(SCFA)诸如甲酸盐、乙酸盐、异丁酸盐、丙酸盐、异戊酸盐和戊酸盐对它们的宿主的代谢和免疫也具有有益作用。
本发明因此进一步涉及一种用于增加在受试者的肠道中SCFA的产生的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明也涉及一种用于增加在受试者的肠道中丁酸盐、异丁酸盐、丁酸和/或异丁酸的产生的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于增加在受试者的肠道中乙酸盐和/或乙酸的产生的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于增加在受试者的肠道中丙酸盐、异丙酸盐、丙酸和/或异丙酸的产生的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减少在受试者的脂肪组织、优选棕色和/或皮下脂肪组织的炎性应答中所涉及的基因的表达的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减少在受试者的脂肪组织、优选棕色和/或皮下脂肪组织的炎性应答中所涉及的基因的表达的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于减少在受试者的脂肪组织、优选棕色和/或皮下脂肪组织的纤维化中所涉及的基因的表达的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
本发明涉及一种用于增加受试者的肠道中Toll-样受体2(TLR2)受体的活化的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。在一个实施方案中，本发明的细菌和/或其变体和/或其片段增加受试者的肠上皮细胞中的Toll-样受体2(TLR2)受体的活化。
本发明涉及一种用于增加在受试者的肠道中戊酸盐、异戊酸盐、戊酸和/或异戊酸的产生的方法，所述方法包括给所述受试者施用至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段。
在一个实施方案中，本发明的治疗方法包括给受试者施用本发明的组合物、药物组合物或药物。在一个实施方案中，将治疗有效量的至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段施用给受试者。
在一个实施方案中，本发明的非治疗性方法包括给受试者施用本发明的组合物、营养制品组合物或美容组合物。在一个实施方案中，将美容或营养制品有效量的至少一种本发明的细菌和/或其变体和/或至少一种其片段施用给受试者。
附图说明
图1显示了在指数期的菌株J115的细胞的扫描电子显微照片。(a)50 000放大率，比例条＝1μm。(b)10 000放大率，比例条＝2μm。
图2显示了基于16S rRNA基因序列的系统发生树，显示了菌株J115(Dysosmobacter welbionis)、反刍颤杆菌JCM 18333T(＝GH1T＝KCTC 15176＝NBRC108824)、Oscillibacter valericigenes DSM 18026T(Sjm18-20T＝NBRC 101213)、吉氏颤螺菌克隆和其它有关的分类单位之间的联系。GenBank登录号显示在括弧中。基于1000个重复的Bootstrap值指示在分支点上。条，每个核苷酸位置0.02个置换。(a)邻域连接系统发生树，(b)最大似然系统发生树。
图3显示了基于12个蛋白编码基因的连接序列的MLSA的系统发生树，显示了菌株J115(Dysosmobacter welbionis)、反刍颤杆菌JCM 18333T(＝GH1T＝KCTC 15176＝NBRC108824)、Oscillibacter valericigenes DSM 18026T(Sjm18-20T＝NBRC 101213)和其它有关的分类单位之间的联系。用于检索基因序列的完整基因组的GenBank登录号显示在括弧中。基于1000个重复的Bootstrap值指示在分支点上。在MLSA中包括的12个基因是RNA聚合酶孢子形成(sporulation)特异性的σ因子SigE(sigE)、磷酸核糖甲酰甘氨脒环连接酶(purM)、精氨基琥珀酸合酶(ass)、天冬氨酸激酶(lysC)、磷酸盐饥饿可诱导的蛋白(phoH)、分解代谢产物阻遏HPr-样蛋白(crh)、伴侣蛋白groEL(groEL)、tRNA修饰GTPase MnmE(thdF)、翻译起始因子IF-2(infB)、蛋白recA(recA)、RNA聚合酶σ因子RpoD(rpoD)和DNA促旋酶亚基B(gyrB)。条，每个核苷酸位置0.05个置换。(A)邻域连接系统发生树，(B)最大似然系统发生树。
图4显示了基于整个基因组的具有平均核苷酸同一性(ANI)的算术平均值(UPGMA)系统发生树的非加权对组方法，显示了菌株J115(Dysosmobacter welbionis)、反刍颤杆菌JCM 18333T(＝GH1T＝KCTC 15176＝NBRC 108824)、Oscillibacter valericigenes DSM18026T(Sjm18-20T＝NBRC 101213)和其它有关的分类单位之间的联系。使用的完整基因组的GenBank登录号显示在括弧中。
图5显示了基于整个基因组的基因组间距离(GGD)的UPGMA系统发生树，显示了菌株J115(Dysosmobacter welbionis)、反刍颤杆菌JCM 18333T(＝GH1T＝KCTC 15176＝NBRC108824)、Oscillibacter valericigenes DSM 18026T(Sjm18-20T＝NBRC 101213)和其它有关的分类单位之间的联系。使用的完整基因组的GenBank登录号显示在括弧中。
图6的图显示了下述小鼠的体重曲线：通过每日经口管饲Dysosmobacterwelbionis J115(109个细菌细胞悬浮于200μL无菌厌氧磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水(PCBS)中)处理并饲喂高脂肪饮食的小鼠(HFD-Dysosmobacter J115)，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的无菌厌氧PCBS-碳酸盐持续8-周处理的小鼠(n＝10/组)。
图7的图显示了在如图6中所述的8-周处理结束时每组测量的重量增加。将数据显示为具有中值的散布点图。*:p<0.05,Kruskal-Wallis检验，随后进行逐对对比。
图8的图显示了每只小鼠的每日食物摄入，基于如图6中所述的8-周处理期间2-小鼠笼子的每周食物摄入进行计算。将数据显示为具有中值的散布点图。**:p<0.01,Kruskal-Wallis检验，随后进行逐对对比。
图9的图显示了在如图6中所述的8-周处理的第6和7周期间每只小鼠每日摄入的卡路里量。将数据显示为具有中值的散布点图。*:p<0.05,Kruskal-Wallis检验，随后进行逐对对比。
图10的图显示了在如图6中所述的8-周处理的第6和7周期间每只小鼠每日排泄的卡路里量(粪便能量输出)。将数据显示为具有中值的散布点图。*:p<0.05,Kruskal-Wallis检验，随后进行逐对对比。
图11的图显示了在如图6中所述的8-周处理的第6和7周期间每只小鼠每日吸收的卡路里量(吸收的能量)。将数据显示为具有中值的散布点图。*:p<0.05,Kruskal-Wallis检验，随后进行逐对对比。
图12的图显示了在如图6中所述的8-周处理结束时重量增加与食物摄入之比。将数据显示为具有中值的散布点图。
图13的图显示了在如图6中所述的8-周处理结束时在末端回肠中测量的胰高血糖素原mRNA表达水平。将数据显示为具有中值的散布点图。**:p<0.01,Kruskal-Wallis检验，随后进行逐对对比。
图14的直方图显示了Dysosmobacter welbionis菌株J115在体外生产的短链脂肪酸(SCFA)。
图15的图显示了在如图6中所述的8-周处理结束时在末端回肠中测量的闭合蛋白mRNA表达水平。将数据显示为具有中值的散布点图。*:p<0.05,Kruskal-Wallis检验，随后进行逐对对比。
图16的图显示了暴露于不同浓度的D.welbionis J115T 2小时以后在GLUtag细胞的上清液中的总GLP-1的相对浓度。将数据显示为具有中值的散布点图。
图17的图显示了暴露于不同浓度的D.welbionis J115T 2小时以后在GLUtag细胞中的GLP-1的细胞外(上清液)和细胞内相对浓度的总和。将数据显示为具有中值的散布点图。
图18的图显示了每只小鼠和每天施用的新鲜和冷冻悬浮液中的D.welbionisJ115T的死和活细胞的量。
图19的图显示了下述小鼠的体重演变：通过每日经口管饲5.109个D.welbionisJ115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。星号或(+)符号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*或+:p<0.05；**或++:p<0.01；***或+++:p<0.001)。*指示HFD和HFD-J115-新鲜组之间的统计显著性，而+指示HFD和HFD-J115-冷冻组之间的统计显著性。
图20的图显示了在13-周时段结束时测量的下述小鼠的总体重增加：通过每日经口管饲5.109D.welbionis J115T的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。星号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*:p<0.05)。
图21的图显示了下述小鼠的每只小鼠和每天的每日食物摄入：通过每日经口管饲5.109D.welbionis J115T的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)，这基于在13-周时段中2小鼠笼子的每周食物摄入而计算。星号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(****:p<0.0001)。
图22的图显示了在实验的第6和8周期间下述小鼠每天和每只小鼠摄入的能量(卡路里)：通过每日经口管饲5.109D.welbionis J115T的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。
图23的图显示了在实验的第6和8周期间下述小鼠每天和每只小鼠的粪便能量输出(排泄的卡路里)：通过每日经口管饲5.109D.welbionis J115T的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。
图24的图显示了在实验的第6和8周期间下述小鼠每天和每只小鼠吸收的能量(卡路里)：通过每日经口管饲5.109D.welbionis J115T的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。每日经口管饲新鲜的或冷冻的5.109个Dysosmobacterwelbionis J115T细胞。将数据显示为具有中值的散布点图。
图25的图显示了在13周实验结束时下述小鼠的重量增加与食物摄入之比：通过每日经口管饲5.109D.welbionis J115T的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(**:p<0.01)。
图26的图显示了下述小鼠的总脂肪量演变：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号和加号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*或+:p<0.05；**或++:p<0.01；***或+++:p<0.001)。*指示HFD和HFD-J115-新鲜组之间的统计显著性，而+指示HFD和HFD-J115-冷冻组之间的统计显著性。
图27的图显示了在13-周时段结束时下述小鼠的肠系膜、皮下和附睾脂肪垫重量：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*:p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001)。
图28是在13-周时段结束时下述小鼠的皮下脂肪组织(SCAT)的代表性苏木精和伊红(H&E)-染色照片系列：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组),。
图29的图显示了在13-周时段结束时下述小鼠的SCAT的脂肪细胞直径(μm)分布：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号和加号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*或+:p<0.05；**或++:p<0.01；***或+++:p<0.001)。*指示HFD和HFD-J115-新鲜组之间的统计显著性，而+指示HFD和HFD-J115-冷冻组之间的统计显著性。
图30是在13-周时段结束时下述小鼠的肠系膜脂肪组织(MAT)的代表性苏木精和伊红(H&E)-染色照片系列：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。
图31的图显示了在13-周时段结束时下述小鼠的MAT的脂肪细胞直径(μm)分布：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号和加号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*或+:p<0.05；**或++:p<0.01；***或+++:p<0.001)。*指示HFD和HFD-J115-新鲜组之间的统计显著性，而+指示HFD和HFD-J115-冷冻组之间的统计显著性。
图32的图显示了下述小鼠在口服葡萄糖耐量测试(OGTT)过程中的血浆葡萄糖(mg/dL)曲线：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号和加号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*或+:p<0.05；**或++:p<0.01；***或+++:p<0.001)。*指示HFD和HFD-J115-新鲜组之间的统计显著性，而+指示HFD和HFD-J115-冷冻组之间的统计显著性。
图33的图显示了下述小鼠在口服葡萄糖耐量测试(OGTT)过程中在葡萄糖施用之前30min和之后15min测量的血浆胰岛素浓度(μg/L)：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*:p<0.05)。
图34的图显示了下述小鼠在血浆中的禁食瘦素浓度(ng/mL)：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*:p<0.05)。
图35的图显示了下述小鼠的肩胛间棕色脂肪组织(BAT)重量：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*:p<0.05)。
图36的图显示了下述小鼠的体温：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(HFD-J115-新鲜组)或高脂肪饮食(HFD)的小鼠，和通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续3周处理的小鼠(n＝7/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号指示根据由Mann-Whitney检验组成的统计分析两组之间的显著差异(**:p<0.01)。
图37的图显示了下述小鼠的BAT重量和体温之间的关联：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(HFD-J115-新鲜组)或高脂肪饮食(HFD)的小鼠，和通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续3周处理的小鼠(n＝7/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。根据由Spearman关联组成的统计分析，指示p值。
图38的图得自BAT中的RNAseq分析，代表了下述小鼠的属于炎性应答基因本体论(ontology)组的基因的相对表达：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食的小鼠，相对于饲喂高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为处理过的小鼠中的表达相对于未处理的小鼠中的表达之比。
图39的图得自BAT中的qPCR分析，代表了下述小鼠中F4/80的相对表达：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*:p<0.05；**:p<0.01)。
图40的图得自BAT中的qPCR分析，代表了下述小鼠中ColA1的相对表达：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(**:p<0.01)。
图41的图显示了递增浓度的冷冻的D.welbionis J115T对人HEK-hTLR2细胞的刺激。
图42的图显示了得到人HEK-hTLR2细胞的最大刺激的一半所需的冷冻D.welbionis J115T的有效浓度(EC50)。
图43的图得自空肠中的qPCR分析，代表了下述小鼠中防卫素α(DEFA)的相对表达：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的新鲜和冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食(分别是HFD-J115-新鲜组和HFD-J115-冷冻组)的小鼠，或饲喂对照饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组)。将数据显示为具有中值的散布点图。星号指示根据由单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比和Tukey校正组成的统计分析两组之间的显著差异(*:p<0.05；**:p<0.01)。
图44的图显示，粪便Dysosmobacter属相对丰度与人类的身体质量指数(BMI)负相关。BMI和大便中Dysosmobacter属相对丰度的log之间的Pearson关联。
实施例
下述实施例进一步举例说明了本发明。
实施例1:从健康的25岁女性的粪便样品分离菌株J115
为了确定分离物是一个新种，应进行几种分析：形态学(诸如活动力和鞭毛)、生化(诸如酶促和发酵能力)、生理学(诸如脂肪酸分析)和系统发生(诸如平均核苷酸同一性(ANI)、DNA-DNA杂交和GC含量)表征。
将粪便样品保存在具有吸收O2和产生CO2的试剂(Genbox Anaer；Biomérieux)的密闭容器中，并在收集后不到两个小时进行分离。将样品转移进含有100％N2作为气体气氛的厌氧室(Coy)，并立即在富含抗氧化剂的改良YCFA(酵母提取物-酪蛋白水解物-脂肪酸)中1/10稀释(表1和表2)。
表1:改良YCFA培养基的组成.q.s.:适量.
Figure BDA0002962170110000611
Figure BDA0002962170110000621
表2:用于制备改良YCFA培养基的维生素溶液的组成.q.s.:适量.
Figure BDA0002962170110000622
Figure BDA0002962170110000631
然后将粪便悬浮液转移到在20％CO2-80％N2的气氛下用丁基橡胶气密密封的管中。然后，使用消光稀释技术进行单细胞培养，即，将粪便悬浮液稀释并等分在300个小瓶中，使得单个小瓶平均接受一个细胞。将在37℃保持24小时至7天后的阳性培养物铺展至固体改良YCFA上，并在具有吸收O2和产生CO2的试剂(Genbox Anaer；Biomérieux)的厌氧罐(Merck)中在相同温度温育72h至7天。挑出单个菌落并转移到新鲜培养基，并重复该过程，直至培养物被认为是纯的。在获得的培养物中，命名为J115的培养物被考虑用于进一步研究。在改良YCFA培养基中的48小时培养物被用于常规温育、生长测试和生化分析。将菌株在-80℃保存在20％甘油中。
鉴定出J115菌株与颤杆菌属的种O.valericigenes和反刍颤杆菌(O.Ruminantium)有关(参见下文系统发生分析部分)。因此，为了对比目的，获得了这两个种中的每一个的典型菌株。反刍颤杆菌JCM 18333T(＝GH1T＝KCTC 15176＝NBRC 108824)得自日本微生物保藏中心(Japan Collection of Microorganisms，JCM)，而O.valericigenes DSM 18026T(Sjm18-20T＝NBRC101213)得自Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)。在37℃在改良YCFA培养基中的48小时培养物被用于常规温育、生长测试和生化分析。将菌株在-80℃保存在20％甘油中。
扫描电子显微术显示，J115细胞是直棒，单个发生，且主要测量为0.5-0.6x 1.8-3.0μm，但在指数期和早期静止期经常观察到长达18-20μm的棒(图1)。在厌氧性气氛中在37℃温育72h以后在固体改良YCFA上的J115菌落是点状、膏状、半透明的、圆形的、边缘光滑的、略微凸出的且光滑的。当将菌株刺入接种在半固体改良YCFA(0.5％琼脂)中并在37℃厌氧温育72h时，菌株的活动力为阴性。与J115细胞相反，O.valericigenes DSM 18026T和反刍颤杆菌JCM 18333T细胞是运动性的，并具有鞭毛。
在含有递增浓度的牛胆汁(Sigma,1％w/v的脱水胆汁对应于10％w/v新鲜胆汁)或NaCl(VWR)的液体改良YCFA中，测试了耐受胆汁和NaCl的能力。菌株的生长发生在含有低于2％胆汁或2％NaCl的培养基上，但在含有2.5％的培养基上或在含有2.25％或以上胆汁或NaCl的培养基上却没有。反刍颤杆菌JCM 18333T可以在含有0-2％胆汁的培养基上生长，而O.valericigenes DSM 18026T可以在含有0-1％胆汁的培养基中生长。
革兰氏染色为阴性。KOH测试(3％,w/v)为阳性。在指数和静止生长期在透射或扫描电子显微术(Philips Electron Microscope CM12/STEM)中没有观察到孢子形成。用70°乙醇处理30分钟后，没有发生生长。对于分离物J115和仅在严格厌氧条件下生长的菌株，使用3％w/v H2O2测试未检测到过氧化氢酶。
生化表征
生化表征的结果给出在表3和表4的种描述中。根据生产商的说明书和API 20A厌氧菌测试试剂盒和API 50CH碳水化合物试剂盒(Biomérieux)，用不含碳源的改良YCFA，使用Rapid ID 32A厌氧菌鉴定试剂盒(Biomérieux)。对三种单独培养物一式三份进行测试。Rapid ID 32A和API 20A显示，菌株J115对于谷氨酸脱羧酶和精氨酸二水解酶是阳性的，但是对于所有其它测试是阴性的(表3)。
表3:菌株J115、O.valericigenes DSM 18026T和反刍颤杆菌JCM 18333T的生化表征。如下指示来自Rapid ID 32A和API 20A测试的结果：“-”指示阴性测试，“+”指示阳性测试。
Figure BDA0002962170110000641
Figure BDA0002962170110000651
使用API 50CH试剂盒测试了通过从各种碳源发酵产生的酸，并发现菌株J115可通过其发酵肌-肌醇的能力及其无法发酵D-葡萄糖和D-木糖的能力与两个颤杆菌种区分开(表4)。
表4:菌株J115的发酵能力.na:不可得到。如下呈现来自API 50CH测试的结果:“-”指示所考虑的菌株不发酵的底物，且“+”指示所考虑的菌株发酵的底物。
Figure BDA0002962170110000652
Figure BDA0002962170110000661
Figure BDA0002962170110000671
细胞脂肪酸组成
使用Miller(J Clin Microbiol.1982年9月；16(3):584-6)和Kuykendall等人(Int J Syst Evol Microbiol.1988；38(4):358-361)的方法的稍微改进，通过皂化、甲基化和提取，由Identification Service of the DSMZ(Braunschweig,德国)从30mg冷冻干燥的细胞分析细胞脂肪酸。与O.valericigenes Sjm18-20T和反刍颤杆菌GH1T一样，菌株J115的主要细胞饱和支链脂肪酸是异-C15:0(24.2％)和反异-C15:0(15.2％)(表5)。但是，数量的差异非常大，因为异-C15:0仅占颤杆菌种中的细胞脂肪酸的9.8％和8.9％。此外，反异-C15:0不是O.valericigenes DSM 18026T和反刍颤杆菌JCM 18333T的主要细胞脂肪酸。相反，饱和直链脂肪酸C14:0和C16:0是O.valericigenes DSM 18026T和反刍颤杆菌JCM 18333T的主要细胞脂肪酸，但是仅以痕量在菌株J115中检测到。
表5:细胞脂肪酸分析.菌株:1,J115；2,O.valericigenes Sjm 18-20T；3,反刍颤杆菌GH1T。Tr,痕量(<1％)；-，未检测到。*总计特征代表使用MIDI Sherlock系统不可分离的两种或三种脂肪酸的组。总计特征1含有C13:1ω1c和/或C14:0ALDE。总计特征3含有ECL13.570和/或异-C15:0ALDE的一种或多种未知脂肪酸。总计特征5含有C15:0DMA和/或C14:0 3-OH。
Figure BDA0002962170110000672
Figure BDA0002962170110000681
但是，菌株J115与这两个种的区别在于作为二甲基缩醛(DMA)诸如C18:0DMA发现的脂肪醛，其在J115中是丰富的(18.4％)，但在颤杆菌种中却不存在。此外，在菌株J115中发现的C16:0DMA的浓度比在颤杆菌种中的浓度低得多。在两个颤杆菌种中，C16:0DMA分别占细胞脂肪酸的25.2％和19.9％。另外，在O.valericigenes DSM 18026T和反刍颤杆菌JCM 18333T中以可察觉的量检测到C14:0DMA(分别是6.2％和4.5％)，但仅占菌株J115的细胞脂肪酸的痕量。
呼吸性脂醌(Respiratory lipoquinones)
由Identification Service of the DSMZ(Braunschweig,德国)分析了菌株J115的呼吸性脂醌和二氨基庚二酸。简而言之，根据Tindall的方法，使用甲醇:己烷从100mg冷冻干燥的细胞提取醌，随后相分离进己烷中。如在颤杆菌种中，在菌株J115中没有检测到醌。使用Rhuland等人(J Am Chem Soc1955；77:4844-6)的溶剂系统，通过纤维素平板上的薄层色谱法检查全细胞水解物。菌株J115含有内消旋-2,6-二氨基庚二酸作为细胞壁肽聚糖的诊断性二氨基酸。
由Identification Service和Peter Schumann博士(DSMZ,Braunschweig,德国)进行DNA碱基组成的分析。菌株J115的DNA GC含量为59.3％，稍微高于O.valericigenesSjm18-20T和反刍颤杆菌GH1T的含量(分别是52.9％和54.9％)。
系统发生分析
使用通用引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’SEQ ID NO:2)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’SEQ ID NO:3)得到菌株J115的几乎整个(1428bp-SEQ ID NO:1)16S rRNA序列。使用EzBioCloud的鉴定服务(EzBioCloud's Identify service)(2017.10.23更新的数据库)和GenBank
Figure BDA0002962170110000691
确定并获得菌株J115的以前鉴定的最接近亲属的16S rRNA序列。
使用MUSCLE进行序列的多重比对。使用Maximum Composite Likelihood方法计算距离，并在缺口后在MEGA7.0中通过邻域连接方法构建系统发生树，并消除未知碱基。菌株J115落在低GC含量梭菌细菌分支的簇IV内。菌株J115与反刍颤杆菌GH1T(95.4％相似性)和Oscillibacter valericigenes Sjm 18-20T(94.1％相似性)有关。菌株J115也位于吉氏颤螺菌进化枝附近。在系统发生上,菌株J115T形成一个单源的独立分支，其作为姐妹进化枝定位至在邻域连接和最大似然树中得到100％bootstrap值支持的颤杆菌属-颤螺菌属进化枝(图2A和B)。
对于整个基因组序列，使用Qiagen DNeasy UltraClean Microbial试剂盒提取高分子量DNA。在Eurofins GATC公司使用PacBio技术得到长读出值。使用分级基因组装配方法进行组装，并在一个重叠群中产生3 576 111个碱基对的完整基因组[NCBI登录号CP034413]，其覆盖深度为242。使用ContEst16S算法的基因组分析指示，菌株J115T的基因组未被污染。获取三个16S rRNA基因拷贝的序列，并与通过PCR和Sanger测序得到的16SrRNA基因序列进行对比。三个拷贝与通过PCR得到的序列严格相同。
进行多基因座序列分析(MLSA)以得到菌株J115和属于瘤胃球菌科的邻居分类单位之间的系统发生关联的更高分辨率。除了没有得到其完整基因组的Oscillispiraguillermondii和Flintibacter butyricus以外，从所有典型菌株的完整基因组得到12个蛋白编码基因(sigE、purM、ass、lysC、phoH、crh、groEL、thdF、infB、recA、rpoD和gyrB)的序列。类似地，对于16S rRNA基因分析，使用MUSCLE比对了连接序列，并用具有1000bootstrap复制的邻域连接和最大似然法构建系统发生树(图3A和B)。如以前，J115形成一个单源的独立分支，其作为姐妹进化枝定位至在两种树中得到100％bootstrap值支持的颤杆菌进化枝。
使用OAT独立0.93.1软件计算菌株之间的基因组相关性的稳健测量、平均核苷酸同一性(ANI)、菌株J115和可得到的参照菌株基因组。将ANI评分表示为热图并用于以具有算术平均值的非加权对组方法(UPGMA)构建树状图(图4)。用高于98.65％(或98.7％)的参照种或菌株得到的ANI评分暗示，分离物是一个新种。如在16S rRNA基因序列和MLSA中，与菌株J115T的最接近分类单位是反刍颤杆菌JCM 18333T和O.valericigenes DSM 18026T，分别具有73.37和73.24的ANI评分。
为了补充基于ANI的该分析，使用由DSMZ提供的基因组到基因组计算器2.1计算了基因组间的距离。使用的设置是BLAST+作为局部比对工具和公式2，也就是说，在高评分区段对(HSP)中找到的所有同一性的总和除以总HSP长度。然后使用基因组间距离确定具有等于或高于70％的DNA-DNA杂交(DDH)的可能性，并使用OAT独立0.93.1软件生成热图以及UPGMA树(图5)。基于基因组间距离的UPGMA树具有与以前获得的树相当不同的拓扑结构。实际上，根据基因组间距离在命名法上最接近的种是普氏栖粪杆菌ATCC 27768T，其具有0.1342的基因组间距离，这对应于0.19的DDH等于或高于70％的概率和31.5[29.1-34]％的计算机环境DDH值。尽管与16SrRNA基因序列不同，基于MLSA和ANI的结果、计算机环境DDH结果清楚地表明，菌株J115属于梭菌簇IV中的瘤胃球菌科，并且与命名法中最接近的分类单元颤杆菌属显著不同。
结论
表6总结了在菌株J115和最接近的种反刍颤杆菌JCM 18333T(＝GH1T＝KCTC15176＝NBRC 108824)、Oscillibacter valericigenes DSM 18026T(Sjm18-20T＝NBRC101213)的典型菌株之间观察到的差异。
表6:菌株J115(Dysosmobacter welbionis)、O.valericigenes DSM 18026T和反刍颤杆菌JCM 18333T的特征
Figure BDA0002962170110000711
菌株J115 16S rRNA基因序列与反刍颤杆菌GH1T和O.valericigenes Sjm 18-20T的16S rRNA基因序列相差4.6-5.9％，这低于原核属定界的建议阈值6％。菌株J115的细胞是直棒，通常1.8-3.0μm，且经常形成伸长的棒。菌株J115是严格厌氧性的且不具有呼吸性醌。这些特性类似于颤杆菌种的特性。但是，菌株J115是非运动性的，不具有鞭毛，且具有不同的细胞脂肪酸组成。另外，与属于颤杆菌属的种相反，菌株J115不能利用葡萄糖和木糖，但是能够发酵肌-肌醇。在系统发生上，菌株J115形成进化枝颤杆菌属-颤螺菌属的单独分支。这两个子进化枝已经被接受作为两个单独的属。基于上述的它的系统发生位置以及生化和生理学特性，菌株J115与最接近的培养属成员(即反刍颤杆菌和Oscillibactervalericigenes)明显不同。因此，菌株J115代表新属的一个新种，为其提议的名称Dysosmobacter welbionis新属新种(gen.nov.sp.nov.)。
实施例2:Dysosmobacter新属的描述
Dysosmobacter细胞是专性厌氧的，无色素的，不形成孢子的，非运动性的，革兰氏染色阴性的。细胞形成主要为1.8-3.0μm的直棒，但是经常形成伸长的棒，无论生长期。不产生呼吸性甲基萘醌。细胞壁中的诊断性二氨基酸是内消旋-2,6-二氨基庚二酸。该属是瘤胃球菌科的一个成员。典型种是Dysosmobacter welbionis。
实施例3:Dysosmobacter welbionis新种的描述
除了在属描述中的那些以外，Dysosmobacter welbionis还表现出下述特征：在厌氧条件下在37℃温育72h后，在固体改良YCFA上的菌落为点状、膏状、半透明的、圆形的、边缘光滑的、略微凸出的且光滑的。2％胆汁或2％NaCl的存在抑制生长。七叶甙不被水解。不产生吲哚。硝酸盐没有被还原。明胶不被消化。不产生尿素酶。不产生过氧化氢酶。酸是由肌-肌醇产生，而不是由D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-核糖和D-木糖产生。关于精氨酸二水解酶和谷氨酸脱羧酶获得阳性反应。来自API 20A和Rapid ID 32A的所有其它测试均为阴性(即碱性磷酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、N-乙酰基氨基葡糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、精氨酸芳基酰胺酶、脯氨酸芳基酰胺酶、亮氨酰基-甘氨酸芳基酰胺酶、苯丙氨酸芳基酰胺酶、焦谷氨酸芳基酰胺酶、酪氨酸芳基酰胺酶、丙氨酸芳基酰胺酶、甘氨酸芳基酰胺酶、组氨酸芳基酰胺酶、丝氨酸芳基酰胺酶)。酸是由肌-肌醇产生，而不是由D-阿东糖醇、苦杏仁苷、D/L-阿拉伯糖、D/L-阿糖醇、熊果苷、D-纤维二糖、卫矛醇、赤丁四醇、D-果糖、D/L-岩藻糖、D-半乳糖、龙胆二糖(gentibiose)、D-葡萄糖、甘油、糖原、菊粉、D-乳糖、来苏糖、D-麦芽糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-松三醇、D-蜜二糖、甲基-αD-吡喃葡萄糖苷、甲基-αD-吡喃甘露糖苷、甲基-βD-木聚糖吡喃糖苷、N-乙酰基(acethyl)葡糖胺、D-棉子糖、L-鼠李糖、D-核糖、D-蔗糖、水杨苷、D-山梨醇、L-山梨糖、淀粉、塔格糖、D-海藻糖、D-松二糖、木糖醇和D/L-木糖)产生。来自肌-肌醇的主要发酵终产物是丁酸盐(或丁酸)。典型菌株的DNA GC含量是58.92mol％。主要细胞脂肪酸是饱和支链脂肪酸和DMA。主要DMA脂肪酸是C18:0DMA，且主要饱和支链脂肪酸是异-C15:0和反异-C15:0。种典型菌株是从人粪便分离的J115(于2018年3月14日作为LMG P-30603保藏在BCCM/LMG)。菌株J115因此在本文中也被称作菌株J115T。
实施例4:对有关分类单位的描述的修改
在将J115的特征与相关种Oscillibacter valericigenes和反刍颤杆菌的典型菌株的特征进行对比的过程中观察到的结果，导致对先前公布的相关属颤杆菌属以及相关种Oscillibacter valericigenes和反刍颤杆菌的描述进行了必要更新。
修改的属颤杆菌属的描述
该描述由Iino等人(Int J Syst Evol Microbiol 2007；57:1840-5)给出，进行以下修改。谷氨酸脱羧酶和精氨酸二水解酶阳性。碱性磷酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、N-乙酰基氨基葡糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、精氨酸芳基酰胺酶、脯氨酸芳基酰胺酶、亮氨酰基-甘氨酸芳基酰胺酶、苯丙氨酸芳基酰胺酶、焦谷氨酸芳基酰胺酶、酪氨酸芳基酰胺酶、丙氨酸芳基酰胺酶、甘氨酸芳基酰胺酶、组氨酸芳基酰胺酶、丝氨酸芳基酰胺酶阴性。不从色氨酸产生吲哚。明胶不被消化。
修改的Oscillibacter valericigenes的描述
该描述由Iino等人(Int J Syst Evol Microbiol 2007；57:1840-5)给出，进行以下修改。七叶甙不被水解。允许生长的胆汁浓度范围是0-1％。从塔格糖产生酸。不从D/L-阿拉伯糖和D-核糖产生酸。
修改的反刍颤杆菌的描述
该描述由Lee等人(Int J Syst Evol Microbiol 2013；63:1942-6)给出，进行以下修改。七叶甙被水解。允许生长的胆汁浓度范围是0-2％。从D-阿拉伯糖和D-松三醇产生酸。
实施例5:Dysosmobacter welbionis的施用对代谢、进食行为和肠屏障的影响.
材料和方法
小鼠
将一组10-周龄C57BL/6J小鼠(30只小鼠,n＝10/组)(Janvier Labs,法国)以2只小鼠/笼子的组圈养，自由进食和饮水。给小鼠饲喂对照饮食(CT)(AIN93Mi；Researchdiet,New Brunswick,NJ,USA)或高脂肪饮食(HFD)(60％脂肪和20％碳水化合物(kcal/100g),D12492,研究饮食,New Brunswick,NJ,USA)。以悬浮于无菌厌氧磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水中的1.109cfu/0.2mL的剂量通过经口管饲法用Dysosmobacter welbionis的口服施用处理小鼠(HFD-Dysosmobacter J115)，并用等体积的无菌厌氧磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水的经口管饲法处理对照组(对照和HFD)。处理持续8周。
将D.welbionis J115(于2018年3月14日作为LMG P-30603保藏在BCCM/LMG)如在实施例1中所述在富含肌醇的改良YCFA培养基中厌氧培养，且然后洗涤和悬浮于厌氧磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水中至1.109cfu/0.2mL的终浓度。
每周记录一次食物和水摄入量。通过使用7.5MHz时域-核磁共振(TD-NMR)(LF50minispec,Bruker,Rheinstetten,德国)评估身体组成。
所有小鼠实验均已获当地伦理委员会批准并按照其指南进行。根据关于实验动物保护的比利时法律(2010年4月6日)，指定圈养条件(协议号LA1230314)。
Dysosmobacter welbionis J115T培养和计数
如以前描述的(Le Roy等人，公开在Int J Syst Evol Microbiol,2019,DOI10.1099/ijsem.0.003547)，在富含肌醇的改良YCFA培养基中厌氧性地培养D.welbionis J115T(LMG P-30603)。
组织取样
在放血和组织取样之前，将动物用异氟烷(
Figure BDA0002962170110000741
Abbott,Queenborough,Kent,英国)麻醉，然后通过颈椎脱位处死小鼠。解剖肠段(十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)，浸入液氮中，并在-80℃保存用于进一步分析。
RNA制备和实时qPCR分析
使用TriPure试剂(Roche)从组织制备总RNA。通过在Agilent 2100生物分析仪(Agilent RNA 6000Nano Kit,Agilent)上运行1μL每个样品，进行总RNA的定量和完整性分析。
通过使用反转录系统试剂盒(Promega,Leiden,荷兰)对1μg总RNA进行反转录来制备cDNA。根据生产商的说明书，使用用于检测的Mesa Fast qPCRTM(Eurogentec,Seraing,比利时)，用StepOnePlusTM实时PCR系统和软件(Applied Biosystems,Den Ijssel,荷兰)进行实时PCR。RPL19被选为持家基因。所有样品均在单个96孔反应板中一式两份运行，并根据2-ΔΔCt方法分析数据。通过分析在扩增结束时进行的解链曲线，检查扩增产物的身份和纯度。靶向的小鼠基因的引物序列呈现在下表7中。
表7:用于通过qPCR测量mRNA表达水平的引物对的核苷酸序列.
Figure BDA0002962170110000751
肠能量吸收
实验开始后六周，收集了2个七天时段的粪便。在相同时间期间监测食物摄入。将粪便在60℃干燥2小时并称重。通过炸弹量热法(C1,IKA,USA)确定饮食和粪便的总能量。基于摄入的能量和排泄的能量计算肠道净吸收，并代表在粪便输出中未回收的摄入能量的比例。
统计分析
将数据表示为平均值±s.e.m.。组之间的差异通过单因素方差分析(ANOVA)、随后逐对对比进行评估，并使用Benjamini、Krieger和Yekutieli的两阶段提升方法测试假发现率。通过Pearson或非参数Spearman检验评估关联，取决于变量是否通过Shapiro-Wilk正态性检验。使用用于Windows的GraphPad Prism 7.00版(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)分析数据。当p<0.05时，结果被认为是统计上显著的。
结果
为了破译Dysosmobacter welbionis是否以及如何影响宿主代谢健康，在八周期间向高脂肪饲喂的小鼠口服施用细菌J115。结果显示，每天补充109D.welbionis细胞减少了29％(即1.5克)的高脂肪诱导的体重增加(图6和图7)。此外，结果还显示，D.welbionis施用在实验过程中显著减少了食物摄入，并因此使总能量摄入减少了5％(图8和图9)。为了验证该减少的食物摄入确实导致可用于宿主代谢的能量的减少，收集了2个七天时段的粪便，并通过炸弹量热法测量了那些粪便中所含的总能量。D.welbionis施用减少粪便中的能量输出(图10)，但是，肠道净吸收仍比HFD小鼠中低7.7％(图11)。此外，D.welbionis补充的小鼠的体重增加与食物摄入之比比HFD小鼠中低15.5％(图12)。这指示，D.welbionis减少了将食物能量转化为体重的能力。综上，这些结果显示，D.welbionis通过两种方式阻止高脂肪饮食诱导的体重增加：食物摄入的减少，和储存吸收的能量的能力的下降。
胰高血糖素-样肽-1(GLP1)是血液中由肠道分泌的一种蛋白，其调节人和动物两者中的饱感并因此调节食物摄入。GLP1由胰高血糖素原基因编码，其由肠粘膜层的L-细胞表达。测量了胰高血糖素原基因在回肠中的表达，并发现D.welbionis施用使胰高血糖素原回肠表达增加了26％(图13)。
由于肠道小生物群产生的短链脂肪酸(SCFA)对宿主代谢和免疫具有调节作用(无论是局部还是外围)，在体外测量了D.welbionis的SCFA产生。SCFA是由肠道细菌进行的碳水化合物发酵的最终产物，已知它们活化G蛋白偶联受体(GPCR)41和43，它们位于L-细胞的顶膜。GPCR41/43活化通过刺激紧密连接蛋白的表达而导致肠道屏障的增强。紧密连接蛋白是在肠上皮细胞的侧膜处发现的蛋白，并且它们的连接确保上皮的完整性。D.welbionis产生了大量的SCFA，尤其是丁酸盐(图14)。因此，发明人假设，D.welbionis施用增强了肠屏障，并测量了编码紧密连接蛋白闭合蛋白和密蛋白3的基因的mRNA表达(图15和未显示的数据)。与此假设一致，在用D.welbionis处理的小鼠的回肠中发现了闭合蛋白和密蛋白3的表达的增加。
结论
总之，这些观察结果都指向D.welbionis在宿主生物体的肠上皮屏障的代谢和完整性中的作用。
更具体地说，109J115细胞在小鼠中的每日施用导致与高脂肪饮食相关的几种有害后果的改善：体重增加的减少，食物摄入的减少，单位食物摄入的体重增加的减少，肠道中能量吸收的减少，和胰高血糖素原mRNA表达的增加。这些观察结果指向J115的施用对代谢疾病(特别是肥胖)和摄食行为病症的治疗的有益作用。
另外，109J115细胞在小鼠中的每日施用增加了SCFA的量和紧密连接标志物的表达，表明与J115的施用有关的肠屏障的增强。这些观察结果指向J115的施用对治疗与功能失调性肠屏障有关的疾病(特别是肠炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、食物变态反应、乳糜泻、溃疡、感染、非酒精性脂肪性肝炎、结肠癌)的有益作用。
实施例6:D.welbionis的施用对GLP-1产生和分泌的影响
材料和方法
体外GLP-1产生测定
从第17到28代使用来自肠道鼠L细胞系GLUTag细胞的肠内分泌细胞。使细胞在37℃在5％CO2/95％空气气氛中在补充了10％(v/v)失活FBS和1％(v/v)青霉素/链霉素的DMEM GlutaMAX中生长。将GLUTag细胞(1.8×105个细胞/孔)以500μL/孔接种到24-孔细胞培养板中，并允许粘附24小时。第二天，在有50μM终浓度的DPP-IV抑制剂(二肽基肽酶-4)存在下用浓度范围为1.107-2.109个细胞/mL的D.welbionis J115T处理细胞2小时。用MesoScale Discovery ELISA试剂盒(MesoScale,Gaithersburg,USA)确定总GLP-1(胰高血糖素样肽-1)浓度，并表示为在上清液中检测到的GLP-1的量以及在培养基加细胞中的GLP-1的总量。
结果
由于肠内分泌细胞分泌的GLP-1不仅有助于增强肠道屏障，而且还减少食物摄入，因此我们试图确认D.welbionis J115T触发肠内分泌细胞的GLP-1产生和分泌。因此，使来自肠鼠L细胞系GLUTag的细胞经受递增浓度的D.welbionis J115T。1.107个细胞/mL的D.welbionis J115T没有使总GLP-1的细胞外浓度增加，但是，当暴露于增加浓度的D.welbionis J115T诸如分别1.108、5.108、1.109和2.109个细胞/mL时，总GLP-1的细胞外浓度增加16.2％、79.5％、119.69％和199.7％(图16)。该结果证实，D.welbionis J115T诱导肠内分泌细胞的GLP-1分泌。为了破译D.welbionis J115T是否也提高了GLP-1的产生，测量了在攻击过程中由GLUtag细胞产生的GLP-1的总量，即细胞内和细胞外GLP-1量的总和。GLP-1的总量不受1.107个细胞/mL影响，但1.108、5.108、1.109和2.109个细胞/mL的浓度分别使GLP-1的总量增加了32.9％、19.5％、38.5％和54.3％(图17)。因此，显示D.welbionisJ115T增加胰高血糖素-样肽(例如，GLP1和GLP-2)的内源性产生。
结论
与在D.welbionis J115T施用后在小鼠末端回肠中观察到的胰高血糖素原表达的增加一致地，观察到暴露于D.welbionis J115T后分泌的和总的GLP-1的剂量依赖性增加。由于GLP-2产生与GLP-1产生的增加有关(Drucker等人,Best Pract Res Clin EndocrinolMetab.2004年12月；18(4):531-54)，这些结果指示D.welbionis J115T对GLP-1和GLP-2产生和分泌的刺激效应作用。
GLP-1与能量摄入的减少、较高的能量消耗、较高的胰岛素分泌、较低的胰岛素抗性和饱感有关。GLP-2与肠道屏障的增强、小肠肠道屏障的增殖和细胞保护途径的诱导有关。因此，这些观察结果也指向J115的施用对于治疗与功能失调性肠屏障和/或进食障碍相关的疾病的有益作用。
实施例7:剂量和活力对与D.welbionis施用有关的作用的影响
材料和方法
Dysosmobacter welbionis J115T培养和计数
如以前描述的(Le Roy等人，公开在Int J Syst Evol Microbiol,2019,DOI10.1099/ijsem.0.003547)，使D.welbionis J115T(LMG P-30603)在富含肌醇的改良YCFA培养基中厌氧性地生长。
每天制备D.welbionis J115T的新鲜培养物施用给属于HFD-J115新鲜组的小鼠。将培养物转移进厌氧室内的50mL管中，然后以5000g离心20分钟。然后，除去上清液，并将沉淀物重新悬浮在适当体积的在磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水中的15％海藻糖中，以得到从培养物的光密度计算出的期望终浓度(以细胞数/mL计)。
在实验开始之前以一批制备D.welbionis J115T的冷冻悬浮液，且然后冷冻，每天将等分试样解冻以每天施用给小鼠，并被描述为HFD J115冷冻组。简而言之，将培养物转移进厌氧室内的50mL管中，然后以5000g离心20min。然后，除去上清液，并将沉淀重新悬浮于适当体积的在磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水中的15％海藻糖中，以获得期望的终浓度。最后，将悬浮液转移到厌氧无菌小瓶中并在-20℃储存。
通过在厌氧磷酸盐-碳酸盐缓冲液中对悬浮液进行1:10系列稀释，计数新鲜和冷冻悬浮液中的活细菌。然后将100μL每种稀释液一式三份铺在预还原的琼脂YCFA培养皿上。在厌氧罐中在37℃温育5天后，对菌落计数。
小鼠
将一组10-周龄C57BL/6J小鼠(48只小鼠,n＝12/组)(Janvier Labs,法国)按2只小鼠/笼子的组圈养在SPF(无特定病原体)环境中，自由获得食物和水。给小鼠饲喂对照饮食(CT)或高脂肪饮食(HFD)。一组小鼠通过经口管饲法用每日制备的D.welbionis J115T新鲜培养物的口服施用进行处理，其剂量为5.109细菌/0.2mL(对应于2.109cfu/0.2mL)，悬浮于15％海藻糖在磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水中的无菌厌氧溶液中(HFD J115新鲜组)。另一组小鼠通过经口管饲法用D.welbionis J115T的冷冻溶液处理，其剂量为5.109细菌/0.2mL(对应于3,5.108cfu/mL)，悬浮于15％海藻糖在磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水中的无菌厌氧溶液中(HFD J115冷冻组)。HFD和对照组用等体积的在磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水中的15％海藻糖的经口管饲法处理(对照和HFD)。处理持续13周。6h禁食时段后对小鼠实施安乐死。
每周记录一次食物和水摄入量。通过使用7.5MHz时域-核磁共振(TD-NMR)(LF50minispec,Bruker,Rheinstetten,德国)评估身体组成。
肠能量吸收
实验开始后六周，收集了2个七天时段的粪便。在相同时间期间监测食物摄入。将粪便在60℃干燥2小时并称重。通过炸弹量热法(C1,IKA,USA)确定饮食和粪便的总能量。基于摄入的能量和排泄的能量计算肠道净吸收，并代表在粪便输出中未回收的摄入能量的比例。
结果
为了破译Dysosmobacter welbionis J115T的剂量和/或活力是否影响针对HFD诱导的肥胖和代谢改变的保护，以及冷冻细菌是否与日常培养的细菌一样活跃，每天向HFD饲喂的小鼠施用5.109新鲜的和冷冻的细菌13周。每天新鲜施用的制备之前和之后的cfu计数表明40％的细菌存活，因此5.109细胞剂量对应于2.109活菌，即可培养的细菌(图18)。相反，在冷冻细菌的制备之前和之后的计数表明仅7％的细菌存活，因此5.109细胞剂量对应于3.5 108可培养的细菌(图18)。
结果显示，5.109新鲜制备的细菌的每天补充分别在处理8周和13周后使HFD诱导的重量增加减少了24.7％和26.8％(即，3.5g和4.9g)(图19和图20)。类似地，5.109冷冻细菌的每天补充分别在处理8周和13周后使HFD诱导的重量增加减少了22.8％和33.3％(即，3.1g和5.8g)(图19和图20)。新鲜和冷冻制品的作用程度在处理8周后是相似的，但在研究结束时(13周)，对于冷冻制品而言略高，尽管不是统计上显著的。由于具有相同总量但不同活力水平的D.welbionis J115T制品对小鼠发挥相同的生理作用，因此看来活力并不是获得抗肥胖作用的必要特征。换句话说，死的、不可培养的D.welbionis J115T细胞具有与活的、可培养的D.welbionis J115T细胞相同的有益特性。
新鲜的和冷冻的D.welbionis J115T施用在实验过程中显著减少了食物摄入并因此使总能量摄入减少了7.9％和9.0％(图21)。为了验证这种食物摄入减少确实导致可用于宿主代谢的能量的减少，收集了2个七天时段的粪便，并通过炸弹量热法测量了那些粪便中所含的总能量。粪便中的能量输出不受新鲜的或冷冻的D.welbionis施用影响(图22和图23)，但是，吸收的卡路里量比HFD小鼠中低8.2％和9.5％(图24)。此外，在新鲜的和冷冻的D.welbionis补充的小鼠中体重增加与食物摄入之比分别比HFD小鼠中低19.5％和25.6％(图25)。这指示，D.welbionis降低了将食物能量转化为体重的能力。总之，该结果显示D.welbionis通过两个互补机制防止高脂肪饮食诱导的体重，即食物摄入减少和储存吸收的能量的能力降低。
结论
这些结果证实了在实施例5中得出的观察结果，即J115的施用导致与高脂肪饮食有关的几种有害后果的改善：体重增加的减少，食物摄入的减少，单位食物摄入的体重增加的减少，和肠道中能量吸收的减少。这些观察结果指向J115的施用对代谢疾病(特别是肥胖)和进食障碍的治疗的有益作用。对于5.109个J115细胞/小鼠的每日剂量证实了这些作用，并且在3.5.108-2.109个活的/可培养的J115细胞/小鼠/天的范围内观察到。值得注意的是，包含7％活的/可培养的细胞的冷冻J115细胞的施用与包含40％活的/可培养的细胞的非冷冻制品一样有效。这提示，就与高脂肪饮食相关的几种有害后果而言，非活的J115细胞也能够改善健康：体重增加的减少，食物摄入的减少，单位食物摄入的体重增加的减少，和肠道中能量吸收的减少。
实施例8:D.welbionis施用对脂肪组织的影响
材料和方法
Dysosmobacter welbionis J115T培养和计数
参见实施例7中的对应部分。
小鼠
参见实施例7中的对应部分。
组织取样
在放血和组织取样之前，将动物用异氟烷(
Figure BDA0002962170110000801
Abbott,Queenborough,Kent,英国)麻醉，然后通过颈椎脱位处死小鼠。解剖肠段(十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)，浸入液氮中，并在-80℃保存用于进一步分析。
皮下和肠系膜脂肪组织中的脂肪细胞直径
将5μm的石蜡切片用苏木精和伊红染色。使用SCN400载片扫描仪和Digital ImageHub软件(Leica Biosystems,Wetzlar,德国)获得图像。使用Fiji和Adiposoft软件从每个样品的五个视野计算脂肪细胞大小和分布。
结果
肥胖与脂肪沉积物扩张和脂肪组织功能紊乱有关，其特征是脂肪细胞肥大、脂解作用受损和促炎表型，这促进胰岛素抗性和异位脂肪沉积。结果显示，新鲜的和冷冻的5.109D.welbionis J115T细胞的每天补充使高脂肪诱导的脂肪组织重量增加减少了20.0％和24.2％(即，3.1克和3.8克)(图26)。这对应于肠系膜、皮下(腹股沟)和附睾脂肪沉积物的重量的显著降低(图27)。由于脂肪细胞肥大是脂肪细胞功能障碍特征性的，因此通过组织学和图像分析在皮下(SCAT)和肠系膜(MAT)脂肪组织中测量了脂肪细胞直径。新鲜的和冷冻的D.welbionis J115T处理显著增加了在SCAT中的小脂肪细胞(直径小于50μm)的比例，并减少了大脂肪细胞(直径大于70μm)的比例(图28和图29)。内脏脂肪组织功能障碍尤其与代谢改变有关，因此还测量了MAT中的脂肪细胞大小和分布。新鲜的和冷冻的D.welbionisJ115T细胞的每天补充显著增加了MAT中的小脂肪细胞的比例并降低了大脂肪细胞的比例(图30和图31)。引人注目的是，D.welbionis J115T处理完全消除了HFD诱导的MAT脂肪细胞肥大，因为在对照饮食饲喂的小鼠中和在用新鲜的或冷冻的D.welbionis J115T处理的HFD饲喂的小鼠中，脂肪细胞大小分布是相同的。
结论
这些结果指示，J115的施用导致与高脂肪饮食相关的几种有害后果的改善：减少脂肪组织(包括肠系膜、皮下(腹股沟)和附睾脂肪沉积物)的重量，减少脂肪细胞肥大(包括在SCAT和MAT中)。这些观察结果指向J115的施用对于代谢疾病(尤其是肥胖、代谢综合征、高血压、异位脂肪沉积、2型糖尿病和血脂异常)的治疗的有益作用。对于5.109个J115细胞/小鼠的每日剂量观察到这些作用，并在3.5.108-2.109个活的/可培养的J115细胞/小鼠/天的范围内观察到。值得注意的是，包含7％活的/可培养的细胞的冷冻J115细胞的施用与包含40％活的/可培养的细胞的非冷冻制品一样有效。这提示，就与高脂肪饮食相关的几种有害后果而言，非活J115细胞也能够改善健康：减少脂肪组织(包括肠系膜、皮下(腹股沟)和附睾脂肪沉积物)的重量，减少脂肪细胞肥大(包括在SCAT和MAT中)。
实施例9:D.welbionis施用对代谢健康的影响
材料和方法
Dysosmobacter welbionis J115T培养和计数
参见实施例7中的对应部分。
小鼠
参见实施例7中的对应部分。
口服葡萄糖耐量测试(OGTT)
处理13周后，用经口管饲葡萄糖负荷(2g葡萄糖/kg体重)处理禁食6小时的小鼠。在口服葡萄糖负荷之前30分钟和即将口服的时间0，且然后在口服葡萄糖负荷之后15、30、60、90和120min，测量血液葡萄糖。在从尾静脉尖端收集的血液样品上用葡萄糖计(AccuCheck,Roche,瑞士)测定血液葡萄糖。根据生产商的说明书，使用ELISA试剂盒(Mercodia,Uppsala,瑞典)测定血浆胰岛素浓度。
禁食瘦素浓度
使用多路免疫测定试剂盒(小鼠糖尿病测定,Bio-Plex Pro,Bio-Rad,比利时)测定循环瘦素浓度，并使用Luminex技术(Bioplex,Bio-Rad,比利时)测量。
结果
为了更好地表征D.welbionis J115T处理对葡萄糖代谢和代谢健康的影响，在12周的HFD和新鲜的和冷冻的D.welbionis J115T补充后进行口服葡萄糖耐量测试。在葡萄糖负荷后15分钟，禁食血浆葡萄糖在处理的小鼠和未处理的小鼠中是相似的。但是，在补充新鲜的和冷冻的D.welbionis J115T的小鼠中，血浆葡萄糖的下降更快(图32)。另外，尽管血浆葡萄糖水平相似，但在葡萄糖负荷之前和之后15分钟血浆胰岛素水平趋于降低(图33)，表明新鲜的和冷冻的D.welbionis J115T可能改善了胰岛素敏感性。与更好的代谢健康相一致，新鲜的和冷冻的D.welbionis J115T显著降低了禁食血浆瘦素水平(图34)。
结论
这些结果指示，J115的施用导致与高脂肪饮食相关的几种有害后果的改善：葡萄糖耐量的降低，胰岛素敏感性的降低，和禁食血浆瘦素水平的降低。这些观察结果指向J115的施用用于治疗代谢疾病(尤其是肥胖、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征、2型糖尿病、1型糖尿病、血脂异常、改变的内源性葡萄糖产生)的有益作用。对于5.109个J115细胞/小鼠的每日剂量观察到这些作用，并且在3.5.108-2.109个活的/可培养的J115细胞/小鼠/天的范围内观察到。值得注意的是，包含7％活的/可培养的细胞的冷冻J115细胞的施用与包含40％活的/可培养的细胞的非冷冻制品一样有效。这提示，就与高脂肪饮食相关的几种有害后果而言，非活的J115细胞也能够改善健康：葡萄糖耐量的降低，胰岛素敏感性的降低和禁食血浆瘦素水平的降低。
实施例10:D.welbionis施用对棕色和皮下脂肪组织的影响
材料和方法
Dysosmobacter welbionis J115T培养和计数
参见实施例7中的对应部分。
小鼠
参见实施例7中的对应部分。关于在图36和37中呈现的实验，将一组10-周龄C57BL/6J小鼠(14小鼠,n＝7/组)(Janvier Labs,法国)单个圈养，自由接近食物和水。给小鼠饲喂高脂肪饮食(HFD)。一组小鼠通过经口管饲法用D.welbionis J115T的冷冻溶液处理，其剂量为5.109细菌/0.2mL(对应于3,5.108cfu/mL)，悬浮于15％海藻糖在磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水中的无菌厌氧溶液中(HFD J115冷冻组)。通过经口管饲法用等体积的在磷酸盐-碳酸盐缓冲盐水中的15％海藻糖处理HFD组(HFD)。处理持续3周。在实验的最后一天，使用啮齿动物直肠温度计测量小鼠的温度。在早晨对小鼠实施安乐死，没有禁食时段。
组织取样
参见实施例8中的对应部分。
RNA制备、实时qPCR和RNAseq分析
如在实施例5的对应部分中所述实现RNA制备和qPCR分析。使用下面表8中呈现的引物。
表8:用于通过qPCR测量mRNA表达水平的引物对的核苷酸序列.
Figure BDA0002962170110000831
Figure BDA0002962170110000841
对于RNAseq分析，使用带有RNA 6000Nano LabChip试剂盒的Agilent生物分析仪2100系统测定来自棕色脂肪组织(BAT)和皮下脂肪组织(SCAT)的RNA的完整性。除去在0-10范围内的量表上具有小于8的RNA完整性数字的BAT样品，以及具有小于6.5的RNA完整性数字的SCAT样品。然后，将样品合并(HFD合并物和HFD-J115合并物)至50ng/μL的终浓度。样品已经由Eurofins Genomics测序，其由以下内容组成：纯化含有聚腺苷酸的mRNA分子，然后mRNA片段化，随机引发cDNA合成(链特异性的)，接头连接和接头特异性的PCR扩增，以及最后具有2x 150碱基对的读出长度的配对末端Illumina测序。得到8000-9000万读出对，并使用RNA-STAR和htseq模块在Galaxy服务器上分析。
结果
D.welbionis J115T降低了将食物能量转化为体重的能力。这种现象可能是能量消耗增加的结果。棕色脂肪组织(BAT)是一种特别具有代谢活性的脂肪沉积物。实际上，它是不发抖产热的主要场所，从而控制全身温度、能量消耗和身体脂肪。结果显示，5.109新鲜制备的和冷冻的细菌的每天补充在处理13周后分别使BAT重量降低了24.7％和26.8％(即，61.6mg和56.4mg)(图35)。为了确认D.welbionis J115T通过BAT代谢的调节对体温和能量消耗的影响，将一组10-周龄HFD饲喂的C57BL/6J小鼠用媒介物或5.109冷冻的D.welbionisJ115T细胞处理3-周(14只小鼠,n＝7/组,实验3)。用冷冻的D.welbonis J115T处理的小鼠的体温比用HFD饲喂并用媒介物处理的对照小鼠的体温高0.27℃(39.0℃相对于38.73℃,图36)。另外，那些小鼠的BAT重量与体温负相关(图37)。纤维化和炎症逐渐被视为脂肪组织功能障碍的诱因。为了确定在用D.welbionis J115T处理的小鼠中观察到的脂肪组织代谢改善是否由较低的炎症和纤维化水平引起，在HFD组和HFD-J115-冷冻组的BAT和SCAT中进行了RNAseq分析。与细胞外基质(具有过于丰富的纤维化)有关的22个基因在用冷冻的D.welbionis J115T处理的小鼠的BAT和SCAT中被下调(表9)。
表9:BAT和SCAT中的RNAseq分析，代表了下述小鼠的与纤维化和细胞外基质有关的基因的相对表达：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食的小鼠，相对于饲喂高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组).
Figure BDA0002962170110000851
因此，与HFD饲喂的小鼠相比，50个与炎性应答基因本体论有关的基因除了一个以外在用D.welbionis J115T处理的小鼠的BAT中都被下调，表明D.welbionis J115T保护脂肪组织免于HFD诱导的炎症和纤维化(图38)。还通过qPCR测量了与炎症(F4/80，巨噬细胞浸润的标志物)和纤维化(胶原A1，细胞外基质的一种组分)有关的两个基因的相对mRNA表达，并证实这些基因与ND相比被HFD上调，并由新鲜的和冷冻的D.welbionis J115T归一化(图39和图40)。
结论
这些结果指示，J115的施用导致与高脂肪饮食相关的几种有害后果的改善:减少棕色脂肪组织的重量，减少棕色和皮下脂肪组织中的纤维化，以及减少棕色脂肪组织中的炎症。这些观察结果指向J115的施用用于治疗代谢疾病(尤其是肥胖、脂肪组织炎症、脂肪组织纤维化和异常的脂肪积累、改变的脂解、高脂肪储存)的有益作用。对于5.109个J115细胞/小鼠的每日剂量观察到这些作用，并且在3.5.108-2.109个活的/可培养的J115细胞/小鼠/天的范围内观察到。值得注意的是，包含7％活的/可培养的细胞的冷冻J115细胞的施用与包含40％活的/可培养的细胞的非冷冻制品一样有效。这提示，就与高脂肪饮食相关的几种有害后果而言，非活的J115细胞也能够改善健康：减少棕色脂肪组织的重量，减少棕色和皮下脂肪组织中的纤维化，以及减少棕色脂肪组织中的炎症。
实施例11:D.welbionis菌株J115T施用对TLR2信号传递和肠屏障的影响
材料和方法
Dysosmobacter welbionis J115T培养和计数
参见实施例7中的对应部分。
小鼠
参见实施例7中的对应部分。
组织取样
参见实施例8中的对应部分。
RNA制备、实时qPCR和RNAseq分析
如在实施例5和10的对应部分中所述，实现RNA制备、qPCR分析和。将下面表10中呈现的引物用于dPCR分析。
表10:用于通过qPCR测量mRNA表达水平的引物对的核苷酸序列.
Figure BDA0002962170110000861
人HEK-Blue hTLR2细胞系的体外培养和刺激.
为了免疫受体刺激分析，使用了HEK-Blue hTLR2细胞系(Invivogen,CA,USA)。用其配体对hTLR2的刺激激活NFκB，这诱导分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的产生，其水平使用QUANTI-Blue比色酶测定法和分光光度计(Spectramax，Molecular Devices，CA，USA)进行测量。使用补充了4.5g/lD-葡萄糖、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、100μg/mL Normocin、2mM L-谷氨酰胺和10％(v/v)的热失活FBS的DMEM作为维持培养基，使HEK-Blue hTLR2细胞系生长并培养直到70-80％汇合。如下进行免疫应答实验：将HEK-hTLR2细胞接种在平底96-孔平板中(50 000个细胞/200μL孔)，并通过添加20μl细菌悬浮液或作为阳性对照的Pam3CSK4(合成的三酰化脂肽,Invivogen,CA,USA)来刺激它们。将96-孔平板在37℃在5％CO2/95％空气气氛中温育24小时。将180μL QUANTI-Blue(Invivogen)加入20μL诱导的HEK-Blue hTLR2上清液中后1小时，通过测量OD600来检测SEAP分泌。
结果
已知肠道中toll-样受体2(TLR2)的刺激增强屏障功能并改善代谢健康。结果显示，冷冻的D.welbionis J115T以剂量依赖性的方式特异性地激活表达TLR2的细胞(图41)。EC50是半数最大有效浓度，并表示在暴露2h后诱导基线至最大值之间的一半应答的细菌浓度。在D.welbionis J115T的情况下，此EC50是3.9.105个细胞/mL，这是一个相对低的浓度，并指示D.welbionis J115T是TLR2的强效激活剂(图42)。已知TLR2信号传递与屏障功能增强有关。实际上，空肠中的RNAseq分析表明，在用D.welbionis J115T处理的小鼠的空肠中，编码抗微生物肽和紧密连接蛋白的基因的表达被上调(表11)。
表11:空肠中的RNAseq分析，代表了下述小鼠的与紧密连接蛋白和抗微生物肽有关的基因的相对表达：通过每日经口管饲5.109个D.welbionis J115T细胞的冷冻悬浮液处理并饲喂HF-饮食的小鼠，相对于饲喂高脂肪饮食(HFD)并通过每日经口管饲等体积的在厌氧PBS-碳酸盐缓冲盐水中的15％无菌海藻糖持续13-周处理的小鼠(n＝12/组).
Figure BDA0002962170110000871
Figure BDA0002962170110000881
还通过qPCR测量了防卫素α的相对mRNA表达，并证实该基因被新鲜的和冷冻的D.welbionis J115T上调(图43)。
结论
这些结果指示，J115的施用导致与高脂肪饮食相关的几种有害后果的改善：紧密连接相关基因的表达的增加，和抗微生物肽的表达的增加。此外，J115是TLR2的强激活剂。TLR2的激活促进抗炎途径，从而增强肠屏障(Oppong等人,Infect Immun.2013年2月；81(2):478-86)。这些观察结果指向J115的施用用于治疗与功能失调性肠屏障相关的疾病(尤其是肠炎、食物变态反应、乳糜泻、结肠炎、溃疡、感染、肝疾病、脂肪性肝炎)的有益作用。对于5.109个J115细胞/小鼠的每日剂量观察到这些作用，并且在3.5.108-2.109个活的/可培养的J115细胞/小鼠/天的范围内观察到。值得注意的是，包含7％活的/可培养的细胞的冷冻J115细胞的施用与包含40％活的/可培养的细胞的非冷冻制品一样有效。这表明就与高脂肪饮食相关的几种有害后果而言，非活的J115细胞也能够改善健康：紧密连接相关基因的表达的增加，抗微生物肽的表达的增加，以及TLR2信号传递的有效激活。
实施例12:D.welbionis在人肠道小生物群中的比例与体重负相关.
材料和方法
通过qPCR定量大便中的Dysosmobacter属
使用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen,德国)从人大便提取基因组DNA，其包括珠打步骤。测定DNA浓度，并使用NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific,USA)检查纯度(A260/A280)。在pH 8的TE缓冲液中将样品稀释至10和0.1ng/μL的终浓度。通过从纯培养物稀释基因组DNA，在每个平板上包括一条标准曲线。通过铺板确定细胞计数，并在DNA提取之前表示为cfu。将大便中的Dysosmobacter属量表示为总细菌的百分比。如实施例5所述，用对Dysosmobacter种特异性的引物和允许从所有细菌扩增的引物进行qPCR(表12)。
表12:用于人大便中的Dysosmobacter属比例的引物对的核苷酸序列
Figure BDA0002962170110000891
结果
通过qPCR测量了62个个体的粪便小生物群中的Dysosmobacter属的相对丰度，所述个体具有在18.0-50.7kg.m-2范围内的身体质量指数(BMI)。结果显示，在该组群中Dysosmobacter属相对丰度的对数与BMI负相关，具有低于0.0001的p值(图44)。结合用小鼠模型获得的临床前数据，该结果证实，属于Dysosmobacter属的细菌和具体地D.welbionisJ115T保护免于肥胖，并有助于苗条和代谢健康。在具有低于25的BMI的受试者中，Dysosmobacter的比例为2.45％。在具有25-30范围内的BMI的受试者中，Dysosmobacter的比例为1.5％。在具有30-35范围内的BMI的受试者中，Dysosmobacter的比例为0.85％。在具有35-40范围内的BMI的受试者中，Dysosmobacter的比例为0.5％。
结论
这些观察结果提示Dysosmobacter属的细菌和具体地D.welbionis J115T在人肠道小生物群的存在的积极贡献。观察到的负相关不限于肥胖患者(BMI高于30)，其还包括健康受试者(BMI低于30和BMI低于25)。这些观察结果再次指向J115的施用用于治疗代谢疾病(尤其是肥胖)的有益作用。使用健康受试者进行的关联还指向J115的施用在健康受试者中的有益作用，以改善健康状况和用于美容目的，特别是促进体重减轻和/或防止体重增加。
Figure BDA0002962170110000911
由受理局填写
Figure BDA0002962170110000912
由国际局填写
Figure BDA0002962170110000913

Claims (15)

1.一种分离的属于Dysosmobacter属的细菌和/或其变体和/或其片段。
2.根据权利要求1的分离的细菌，其中所述细菌属于Dysosmobacter welbionis种和/或其变体。
3.根据权利要求1或2的分离的细菌，其中所述分离的细菌的16S rRNA基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约90％同一性。
4.根据权利要求1-3中的任一项的分离的细菌，其中所述细菌能够发酵肌-肌醇。
5.根据权利要求1-4中的任一项的分离的细菌，其中所述细菌是于2018年3月14日作为LMG P-30603保藏在BCCM/LMG的菌株J115和/或其变体。
6.根据权利要求1-5中的任一项的分离的细菌，其中所述细菌是巴氏灭菌的。
7.根据权利要求1-6中的任一项的分离的细菌，其中所述细菌是冷冻的。
8.一种组合物，其包含根据权利要求1-7中的任一项的分离的细菌和/或其片段。
9.一种药物组合物，其包含根据权利要求8的组合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
10.一种营养制品组合物，其包含根据权利要求8的组合物和至少一种营养制品可接受的赋形剂。
11.一种美容组合物，其包含根据权利要求8的组合物和至少一种美容上可接受的赋形剂。
12.根据权利要求1-7中的任一项的分离的细菌、根据权利要求8的组合物或根据权利要求9的药物组合物，其用于用作药物。
13.根据权利要求1-7中的任一项的分离的细菌、根据权利要求8的组合物或根据权利要求9的药物组合物，其用于在有此需要的受试者中治疗与胃肠小生物群有关的病症。
14.根据权利要求13所用的分离的细菌、组合物或药物组合物，其中所述与胃肠小生物群有关的病症是代谢疾病，优选地选自肥胖、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、糖尿病、葡萄糖耐受不良、异常的脂质代谢、高血糖症、血脂异常、高胆固醇、升高的LDL-胆固醇、降低的HDL-胆固醇和升高的甘油三酯。
15.根据权利要求1-7中的任一项的分离的细菌、根据权利要求8的组合物、根据权利要求10的营养制品组合物或根据权利要求11的美容组合物用于在受试者中促进重量减轻、减少食物摄入、增加肌肉量、减少脂肪量、增加饱感和/或减少与食物摄入有关的重量增加的用途。
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