CN114350630A

CN114350630A - L-泛解酸内酯脱氢酶、突变体及其应用

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Publication number: CN114350630A
Application number: CN202210111360.3A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 杨青; 朱芳莹; 张晓建; 郑裕国; 马石金; 杜军; 吴慧
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-01-29
Filing date: 2022-01-29
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2042-01-29
Also published as: CN114350630B

Abstract

一种具有较好水溶性的L‑泛解酸内酯脱氢酶TpLPLDH、突变体及其编码基因，以及其在生物催化制备D‑泛酸前体中间物酮泛解酸内酯中的应用。所述L‑泛解酸内酯脱氢酶TpLPLDH氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种新的具有L‑泛解酸内酯脱氢酶活性的蛋白质，该蛋白质具有L‑泛解酸内酯脱氢酶的作用，能够催化L‑泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，并且该蛋白质溶解性很好，在水性溶剂（例如磷酸缓冲液）中几乎全部溶解。本发明提供一种具有L‑泛解酸内酯脱氢酶活性的突变体，在终浓度为1mM的底物L泛解酸内酯的体系中于30℃，1200 rpm中反应30min后，该突变体相比于野生型对底物的转化率提高到1.84倍，酶活相比于野生型提高到1.12倍。

Description

L-泛解酸内酯脱氢酶、突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-泛解酸内酯脱氢酶TpLPLDH、突变体及其编码基因，以及其在生物催化制备D-泛酸前体中间物酮泛解酸内酯中的应用。

背景技术

泛酸是水溶性维生素B族的一种，也是生物正常生长必需的营养物质之一。泛酸在生物体组织中作为功能性基团而成为辅酶Ａ和酰基载体蛋白（ACP）的组成部分。辅酶A是有关碳水化合物、脂肪和氨基酸代谢中许多可逆乙酰化反应的一个重要辅酶，对于各种组织内的内源代谢能量交换都很重要。泛酸的主要功能包括促进养分的利用、促进脂肪酸的合成和分解以及参与柠檬酸循环等。泛酸分子具有旋光性,仅D-泛酸才具有维生素活性。由于D-泛酸是一种不稳定的、吸湿性极强的油,不能被人体直接吸收，所以常用它的衍生物——D-泛酸钙、D-泛醇和泛硫乙胺。其中主要的产品是D-泛酸钙。泛酸钙广泛应用于饲料、医药、食品等工业。目前行业内都是通过β-氨基丙酸钙与D-泛解酸内酯合成D-泛酸钙。

D-泛解酸内酯，也称为（R）-泛解酸内酯，为D-泛解酸的γ-内酯，是合成D-泛酸的关键手性中间体。合成D-泛解酸内酯的合成是以DL-泛解酸内酯为底物采用化学法或者水解酶拆分法制备。化学法合成途径由于存在诸多环境污染问题和危险试剂使用等因素受到诸多限制。水解酶拆分法采用L-泛解酸内酯水解酶选择性水解混旋泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯生成D-泛解酸，接着分离D-泛解酸和L-泛解酸内酯，分离后的D-泛解酸经酸化成环形成D-泛解酸内酯，而L-泛解酸内酯经消旋化后回用。水解酶催化的手性拆分法尽管工艺成熟，但仍然存在步骤较长、酸碱耗用高等问题。开发更为直接、高效、环保的D-泛解酸内酯生物不对称制备方法替代现有的手性拆分技术将具有重要的应用价值。

利用L-泛解酸内酯脱氢酶选择性还原制备酮泛解酸内酯，并进而制备D-泛解酸内酯通路更为简捷，与现有的水解酶催化通路相比，工艺更为简单，混旋的底物经生物催化直接得到光学纯产物，不需要消旋步骤，也不需要内酯和酸的分离步骤；在基因工程菌内构建辅酶循环系统，可不需要外加辅酶；以基因工程菌作为整细胞催化剂不需要酶的分离纯化步骤等优点，成为D-泛解酸内酯绿色制造的重要研究方向。该技术包括两种途径，第一种是以混旋的DL-泛解酸内酯为底物，利用立体选择性专一的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯在D-酮基泛解酸内酯还原酶催化下不对称生成D-泛解酸内酯；第二种途径也是先以L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯自发水解形成酮基泛解酸，然后在D-酮基泛解酸还原酶的作用下生成D-泛解酸，接着D-泛解酸在酸的作用下闭环形成D-泛解酸内酯。氧化还原酶不对称合成D-泛解酸内酯的方法是一种非常有前景的生物水解酶法替代者。氧化还原法中L-泛解酸内酯的脱氢是其关键步骤之一，L-泛解酸内酯脱氢酶是催化该反应的关键酶。

目前已知的L-泛解酸内酯脱氢酶数量不多，研究较多的有源自红串红球菌和星状诺卡氏菌的L-泛解酸内酯脱氢酶（SiD，Urano N，et al. Applied Microbiology andBiotechnology, 2012, 95:431-440）。源自红串红球菌的L-泛解酸内酯脱氢酶在大肠杆菌系统中可溶性表达较少，限制了酶对底物的催化能力。以红串红球菌L-泛解酸内酯脱氢酶基因在相同的红串红球菌中增强表达的基因工程菌AKU2103为生物催化剂，催化0.768 M的L-泛解酸内酯脱氢，反应144 h，转化率为91.9％。源自星状诺卡氏菌的L-泛解酸内酯脱氢酶虽然有较详细地酶学性质研究（Kataoka M, et al. European Journal ofBiochemistry 1992, 204,799-806），但该蛋白在大肠杆菌中表达容易形成包涵体，酶活较低，该酶测试催化底物L-泛解酸内酯的Km为26.8 mM，该酶的酶活为 4.22 U/mg。发明专利“源自Nocardia farcinica的L-泛解酸内酯脱氢酶及其应用”（申请号：CN201910366852.5），该专利中只是成功表达蛋白，与来自酿酒酵母的醛酮还原酶和来自微小杆菌的葡萄糖脱氢酶一起催化底物L-泛解酸内酯生成最终底物D-泛解酸内酯，在不添加NADPH的情形下，L-泛解酸内酯无法完全转化。添加NADPH后，反应24 h，D-泛解酸内酯得率大于99％，产物e .e .值大于98％。关于L-泛解酸内酯脱氢酶来源少，信息少，且被报道的酶表达时包涵体严重，限制其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较好水溶性的L-泛解酸内酯脱氢酶TpLPLDH、突变体及其编码基因，以及其在生物催化制备D-泛酸前体中间物酮泛解酸内酯中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种L-泛解酸内酯脱氢酶TpLPLDH，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

一种L-泛解酸内酯脱氢酶突变体，由SEQ ID NO.1所示氨基酸（编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）第29位氨基酸经单点突变而得。

优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示（第29位丙氨酸突变成丝氨酸），其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

经大量前期筛选工作，本发明发现一种源自微生物Thermorudis peleae的蛋白质，其具有L-泛解酸内酯脱氢酶活性，现有技术尚未报道其具有该功能，该蛋白质能够催化L-泛解酸内酯生成酮基泛解酸内酯。该具有L-泛解酸内酯脱氢酶活性的蛋白质的溶解度很好，从而能够充分溶解在催化反应液中，在应用于催化相关反应时催化活性能够充分发挥。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有本发明所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还涉及编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶TpLPLDH及其突变体的基因。

由于核苷酸序列的特殊性，任何本发明所示多核苷酸的变体，只要其与前述多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

本发明还涉及所述L-泛解酸内酯脱氢酶及其突变体在生物催化制备D-泛酸前体中间物酮泛解酸内酯中的应用。

具体的，所述应用为：以含所述L-泛解酸内酯脱氢酶或突变体编码基因的工程菌株经过诱导表达后获得的湿菌体为催化剂，以L-泛解酸内酯为底物，于磷酸缓冲液中，在28~32℃、100~200 rpm条件下进行反应，反应结束后反应液乙酸乙酯萃取，于有机相中获得所述酮泛解酸内酯。萃取液离心后吸取上层有机相于离心管中，加入无水硫酸钠除水，再离心取上清转移入气相样品瓶中用于气相色谱检测。采用气相色谱仪检测底物L-泛解酸内酯和产物酮泛解酸内酯的浓度。气相检测条件：色谱柱安捷伦CycloSil-B （30 m×0.25 mm,0.25 μm），载气：氦气，流速：0.5 mL/min，进样口、检测器温度：250 ^oC；进样量：1 μL；分流比：30:1；程序：175 ^oC，8 min。L-泛解酸内酯和酮泛解酸内酯保留时间分别为：9.2 min和6.6 min。

所述以湿菌体重量计为5~10 g/L磷酸缓冲溶液，所述底物的初始浓度为100~1000mM缓冲溶液。

所述湿菌体可按如下方法制备：将含有所述L-泛解酸内酯脱氢酶或突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃，180 rpm下下培养8h获得种子液，种子液再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有终浓度50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37 ℃，180 rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6~0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000 rpm离心10 min，弃去上清液，收集获得湿菌体。

本发明还涉及含有所述编码基因的载体和基因工程菌。所述重组载体包含适合在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。优选的表达载体为pET28b。基因工程菌构建方法具体为：将羰基还原酶突变体编码基因同表达载体pET28b连接，构建了含有羰基还原酶突变体编码基因的异源表达重组质粒，将表达重组质粒转化至宿主菌中，获得含有重组质粒的重组基因工程菌。

构建含有所述羰基还原酶突变体编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌（优选大肠杆菌E. coli BL21（DE3））中，对获得的重组基因工程菌进行诱培养，培养液分离得到含有重组羰基还原酶突变体的菌体细胞，破碎后获得的羰基还原酶粗酶液进行纯化，即可获得突变体羰基还原酶纯酶。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种新的具有L-泛解酸内酯脱氢酶活性的蛋白质，该蛋白质具有L-泛解酸内酯脱氢酶的作用，能够催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，并且该蛋白质溶解性很好，在水性溶剂（例如磷酸缓冲液）中几乎全部溶解。本发明提供一种具有L-泛解酸内酯脱氢酶活性的突变体，在终浓度为1 mM的底物L泛解酸内酯的体系中于30 ℃，1200 rpm中反应30 min后，该突变体相比于野生型对底物的转化率提高到1.84倍，酶活相比于野生型提高到1.12倍。

附图说明

图1为本发明实施例3的L-泛解酸内酯的滞留时间的气相图谱；

图2为本发明实施例3的酮泛解酸内酯的滞留时间的气相图谱；

图3为本发明实施例3的气相色谱（pA）与L-泛解酸内酯相应浓度（mM）的标准曲线；

图4为本发明实施例3的气相色谱（pA）与酮泛解酸内酯相应浓度（mM）的标准曲线；

图5为本发明实施例3的TpLPLDH催化底物L-泛解酸内酯生成产物酮泛解酸内酯的气相图谱；

图6为本发明实施例3的TpLPLDH^A29S催化底物L-泛解酸内酯生成产物酮泛解酸内酯的气相图谱；

图7为本发明实施例4的不同序列的L-泛解酸内酯脱氢酶TpLPLDH和TpLPLDH^A29S的SDS-PAGE图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例：

实施例1：L-泛解酸内酯脱氢酶工程菌的构建

L-泛解酸内酯脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，进行密码子优化后的基因SEQID NO.3构建到表达载体pET 28a上，并在C端添加6*his标签便于后续的蛋白表达。构建过程如下：

1.以F-1和R-1为引物（表1），以TpLPLDH为模板扩展基因片段1；

2.以F-2和R-2为引物（表1），以pET 28a为模板扩征载体片段2；

3.纯化片段1和片段2，使用NcoI和XhoI酶切纯化后的片段1和片段2；

4.用T4 ligase连接酶连接纯化后的片段1和片段2，酶连产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞；

5.挑取单菌落于含50 μg/μl卡那霉素的液体培养基中于37 ℃，180 rpm的摇床中培养过夜，并进行测序分析；

6.获得的质粒命名为pET 28a-TpLPLDH，获得的工程菌株命名为E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH。

表1：pET 28a-TpLPLDH载体构建的引物设计

引物名称	引物序列（5’-3’）
		F-1	CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCAAGCACCCGTGAC
F-2	CTCGAGTGAGATCCGGCTG
		R-1	CAGCCGGATCTCACTCGAGTTAGTGATGATGATGATG
R-2	GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC

实施例2：突变文库的构建和突变体选择

对上述构建的表达质粒pET 28a-TpLPLDH为模板，对其位点29位的丙氨酸进行饱和突变。构建过程如下：

1.以下表格2的25-29-F和25-29-R为引物，以pET 28a-TpLPLDH为模板扩展含突变基因的整个质粒；

2.反应体系：PCR反应体系（25 µL）：1 µL正向引物（100 μM），1 µL反向引物（100 µM），12.5 µL 2×Phanta缓冲液，0.5 µL dNTP混合物（各10 mM），1 µL质粒模板，0.5 µL DNA聚合酶Phanta（诺唯赞，中国）和8.5 µL超纯水；

3.反应程序：95 ℃预变性5 min，然后30个循环（95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸7 s），72 ℃终延伸10 min，16 ℃保温；

4.PCR产物加入1 µL DpnI（NEB，USA）和2.5 µL Buffer，于37 ℃条件下反应30min；

5.转化到E. coli BL21（DE3）中，获得工程菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH的各种突变体。

表2：TpLPLDH突变体引物设计

引物名称	引物序列（5’-3’）
		25-29-R	GTAGTACACGCTCCACGGC
25-29-F	CCGTGGAGCGTGTACTACNNKATTGTTGCGGGCTCGGAACG

对上述获得的E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH的各种突变体进行筛选：

1. 将上述获得的各种突变体的单菌落接种于96孔板中，加入1000 μL LB 培养基（含50 μg/mL的卡那霉素），在37 ℃，180 rpm条件下培养10 h，获得种子液；

2. 各转接50 μL种子液于另一块新的96孔板（加有1000 μL含50 μg/mL的卡那霉素的LB 培养基）中，37 ℃，180 rpm振荡培养4 h后，加入IPTG（终浓度 0.10 mM），转至28℃培养12 h；

3. 所得的细胞通过96孔板离心机，4000 rpm，4 ˚C下离心10 min，得到突变体的湿菌体；

4. 将含湿菌体的96孔板每个孔中加入300 μL磷酸缓冲溶液（50 mM pH 7.0）重悬细胞，再取100 μL菌悬液加至96孔酶标板的对应位置，分别加入终浓度为100 μM 的2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），再分别加入终浓度为200 μM L-泛解酸内酯起始反应；

5. 在酶标仪Kinetics（MD SpectraMax M5，USA）模式下，在温度30 ℃间隔30 s测定5 min内OD₆₀₀吸光值的变化；

6. 突变体酶活越高，OD₆₀₀的下降越多，从而筛选出突变文库内活力相对较高的突变体；

7. 将获得的活力最高的突变体E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH^A29S与未突变的菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH进行发酵测试。

实施例3：突变体底物催化能力测试

挑取实施例1的工程菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH和实施例1构建的突变菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH^A29S的单菌落培养到含有50 μg/μL卡那霉素的LB培养基中于37 ℃，180 rpm的摇床中培养过夜。将子液以10%的接种量转接到含有50μg/μL 卡那霉素的100 mL LB液体培养基中，于37℃，180 rpm的摇床中培养2-2.5 h，使菌株的OD₆₀₀达到0.6-0.8之间。向培养基中加入终浓度0.1 mM异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）于28℃，180 rpm中诱导12 h。然后在4 ^oC、12000rpm离心10 min，获得含L-泛解酸内酯脱氢酶活性蛋白质TpLPLDH和TpLPLDH^A29S的湿菌体；

每种菌株以pH 7.0、50 mM的磷酸缓冲液（0.2 M Na₂HPO₄，0.2 M NaH₂PO₄）为反应介质溶解终浓度为10 g/L的湿菌体，加入终浓度为1 mM的底物L-泛解酸内酯，样品于30℃，1200 rpm的恒温震荡仪中反应30 min。取200 µL的反应液用相同体积6 M HCl终止反应，加入200 μL 乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相。萃取液离心后吸取上层有机相于离心管中，加入无水硫酸钠除水，再离心取上清转移入气相样品瓶中用于气相色谱检测。采用GC检测L-泛解酸内酯和L-泛解酸内酯的浓度和转化率。气相检测条件：色谱柱安捷伦CycloSil-B（30 m×0.25 mm, 0.25 μm），载气：氦气，流速：0.5 mL/min，进样口、检测器温度：250 ^oC；进样量：1 μL；分流比：30:1；程序：175 ^oC，8 min。L-泛解酸内酯和酮泛解酸内酯保留时间分别为：9.2 min和6.6 min。

底物L-泛解酸内酯和产物酮泛解酸内酯的气相图谱如图1和图2所示。

气相色谱的峰面积（pA）与底物L-泛解酸内酯对应的浓度（mM）的标准曲线为y=79.93x+28.746，R²=0.995，标准曲线为图3所示。

气相色谱的峰面积（pA）与产物酮泛解酸内酯对应的浓度（mM）的标准曲线为y=73.80x+6.7432，R²=0.9991，标准曲线为图4所示。

工程菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH和突变菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH^A29S的气相图谱如图5和图6所示。

由数据显示终浓度为1 mM的底物L-泛解酸内酯在反应30 min后，E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH对底物的转化率是6.22%，突变菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH^A29S对底物的转化率达到11.40%，对比未突变蛋白，突变蛋白在该反应条件下对底物转化率提高到1.84倍。

实施例4：L-泛解酸内酯脱氢酶的蛋白电泳鉴定

将实施例3的表达具有L-泛解酸内酯脱氢酶活性的蛋白质的TpLPLDH和TpLPLDH^A29S的湿菌体用0.9 g/mL生理盐水洗涤两次。按照湿菌体总量10 g/L的量加入pH7.0、100 mM磷酸缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎10 min，超声破碎条件：振幅20%，破碎1 s、暂停2 s，取破碎混合液，12000 rpm，4 ^oC下离心10 min，收集上清液（superntant）和沉淀（sediment），用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定蛋白质的大小和可溶性表达的情况。结果如图7所示，结果表明，表达L-泛解酸内酯脱氢酶活性的蛋白质溶解性很好，几乎全部溶解在上清液中。

实施例5：L-泛解酸内酯脱氢酶的活性测试

实例3中表达的含L-泛解酸内酯脱氢酶活性蛋白质TpLPLDH和TpLPLDH^A29S的湿菌体；每种湿菌体终浓度5 g/L，pH 7.0、50 mM的磷酸缓冲液（0.2 M Na₂HPO₄，0.2 M NaH₂PO₄）为反应介质溶解终浓度为5 g/L的湿菌体，一份加入终浓度为10 mM的底物L-泛解酸内酯，样品于30 ℃，1200 rpm的恒温震荡仪中反应。

反应10 min后取100 µL的反应液用相同体积6 M HCl终止反应，加入200 μL乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相。萃取液离心后吸取上层有机相于离心管中，加入无水硫酸钠除水，再离心取上清转移入气相样品瓶中用于气相色谱检测。采用气相色谱仪检测L-泛解酸内酯和L-泛解酸内酯的浓度计算酶活，酶活定义为：在30 ℃条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需全细胞湿重量为一个活力单位（U）。

由数据显示终浓度为10 mM的底物L-泛解酸内酯在反应10 min后，E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH的酶活是8.02 U/g，突变菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28b-TpLPLDH^A29S的底酶活是8.99 U/g，对比未突变蛋白，突变蛋白在该反应条件下对底物转化率提高到1.12倍。

实施例6：L-泛解酸内酯脱氢酶的底物特异性考察

将实施例3的表达具有L-泛解酸内酯脱氢酶活性的蛋白质的TpLPLDH和TpLPLDH^A29S的湿菌体作为生物催化剂。分别以10 mM的D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯、DL-泛解酸内酯为底物，考察源自的底物特异性。反应体系1 mL，含有：10 g/L湿菌体，10 mM底物和200 mM磷酸缓冲液（pH 7.0）。恒温震荡仪上维持反应条件为30 ℃，1200 rpm。反应30min后，取200 μL反应液加入等体积6 M盐酸终止反应，加入适量的无水硫酸钠。加入200 μL乙酸乙酯充分萃取两次。萃取液离心后吸取上层有机相于离心管中，加入无水硫酸钠除水，再离心取上清转移入气相样品瓶中用于气相色谱检测。底物特异性结果如表3所示，结果发现蛋白质的TpLPLDH和TpLPLDH^A29S不能催化D-泛解酸内酯、D-泛解酸和L-泛解酸，能催化L-泛解酸内酯和DL-泛解酸内酯。上述结果表明，蛋白质的TpLPLDH和TpLPLDH^A29S的L-泛解酸脱氢酶活性专一地作用于L-泛解酸内酯的脱氢反应。如表3所示：

表3：源自Thermorudis peleae的L-泛解酸脱氢酶活性蛋白质的底物特异性

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> L-泛解酸内酯脱氢酶、突变体及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 408

<212> PRT

<213> Thermorudis peleae

<400> 1

Met Ala Ser Thr Arg Asp Trp Phe Glu Ser Ile Ala Glu Ala Gln Arg

1 5 10 15

Arg Ala Lys Lys Arg Leu Pro Trp Ser Val Tyr Tyr Ala Ile Val Ala

20 25 30

Gly Ser Glu Arg Gly Ile Thr Leu Ser Asp Asn Val Ala Ala Phe Ser

35 40 45

Glu Leu Gly Leu Met Pro Arg Val Ala Ala Ala Pro Gln Ser Arg Gly

50 55 60

Gln Thr Thr Ala Val Leu Gly Glu Gln Ile Ser Leu Pro Val Ile Ile

65 70 75 80

Ala Pro Thr Gly Val Gln Ala Val Thr Pro Glu Gly Glu Val Ala Val

85 90 95

Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ile Met Met Leu Ser Ser Phe

100 105 110

Ala Ser Lys Pro Ile Glu Glu Val Ile Ala Ala Asn Pro Arg Thr Phe

115 120 125

Phe Gln Ile Tyr Trp Leu Gly Ser Arg Glu Arg Ile Leu Ala Arg Leu

130 135 140

Glu Arg Val Lys Asn Ala Gly Ala Lys Gly Leu Val Val Thr Leu Asp

145 150 155 160

Trp Ser Phe Ala Thr Arg Arg Asp Trp Gly Ser Pro Pro Leu Pro Glu

165 170 175

Arg Tyr Asp Phe Lys Thr Leu Val Lys Phe Ala Pro Gln Gly Ile Ala

180 185 190

Arg Pro Gly Trp Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gln Gly Gly Leu Pro Gly

195 200 205

Leu Glu Val Pro Asn Leu Thr Val Pro Gly Glu Glu Pro Pro Thr Phe

210 215 220

Phe Gly Ala Tyr Trp Glu Trp Met Gln Thr Pro Pro Pro Thr Trp Ser

225 230 235 240

Asp Ile Ala Trp Leu Arg Glu Gln Trp Gly Gly Arg Phe Val Val Lys

245 250 255

Gly Ile Leu His Pro Asp Asp Ala Arg Arg Ala Val Glu Ile Gly Val

260 265 270

Asp Ala Ile Ile Val Ser Asn His Gly Gly Asn Asn Leu Asp Gly Ala

275 280 285

Pro Ala Thr Ile Arg Ala Leu Pro Ser Ile Val Asp Ala Val Gly Asp

290 295 300

Arg Val Glu Val Leu Leu Asp Gly Gly Ile Arg Arg Gly Ser Asp Val

305 310 315 320

Val Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Arg Ala Val Leu Ile Gly Arg Ala

325 330 335

Tyr Leu Trp Gly Leu Ala Ala Asn Gly Glu Ala Gly Val Arg Asn Val

340 345 350

Leu Asp Leu Leu Arg Ser Gly Ile Asp Glu Thr Leu Leu Gly Ile Gly

355 360 365

Arg Ala Ser Ile His Asp Leu Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Pro Pro

370 375 380

Gly Phe Thr Cys Gly Pro Gly Pro Thr Val Thr Arg Leu Arg Arg His

385 390 395 400

Ser Thr Glu Val Pro Glu Pro Thr

405

<210> 2

<211> 1227

<212> DNA

<213> Thermorudis peleae

<400> 2

atggcgagca cgcgagactg gttcgaatca atcgctgagg cacagcggcg ggcgaagaag 60

cggctgccgt ggtcggtcta ctacgcgatc gttgcgggga gcgagcgtgg catcacattg 120

agcgacaacg tagctgcttt cagcgagctg ggtcttatgc cgcgagtcgc tgccgctccc 180

cagtctcgcg gtcagacgac ggcagtgctg ggcgagcaga tctctctgcc ggtcattatc 240

gcgccgaccg gcgtgcaggc ggtgacaccg gagggcgagg tggccgtcgc gcgcgcggcg 300

gcagcggcgg gcaccatcat gatgctcagc tcgttcgcca gcaagccgat tgaagaggtc 360

attgctgcta acccgcgaac gttcttccag atctactggc tcggaagccg cgagcgcatc 420

ctggcgcgac tggagcgcgt caagaacgct ggggcaaagg gattggttgt gacgctggac 480

tggtcgttcg ccacccgccg cgattgggga agcccaccgc tgccggaacg atacgatttc 540

aagacgctcg tgaagttcgc gccgcagggc attgcccgcc ccggctggct gctgcgctat 600

ctgcgtcagg ggggactccc cggcctcgag gtgcccaacc tgactgtgcc gggagaggag 660

cctccgacat tcttcggcgc ctactgggaa tggatgcaga cccccccgcc cacgtggtca 720

gatatcgcct ggctgcgcga acagtggggc ggcaggttcg tcgtcaaggg aatcctgcat 780

ccagacgatg ccaggcgcgc ggtcgagatc ggggtcgacg ccatcattgt gtccaaccat 840

ggtgggaata acctcgacgg cgccccggcg accatccggg ccttaccctc gatcgtcgac 900

gccgtcggtg accgggtcga ggtgctgctc gacggcggca tccgacgcgg cagcgatgtg 960

gtcaaagcac ttgcgctcgg tgcccgcgcc gtgctgatcg gtcgagcata tctttggggc 1020

ctagccgcca acggtgaggc cggggttcgt aatgtgctcg atctgttgcg cagcgggatc 1080

gatgagacgc tgctcggcat cgggcgcgcc tcgatccatg atctcacccc gggagatgtc 1140

atcgtaccac caggcttcac ctgcggcccg ggtccgaccg tgacgcgcct gcgccgccac 1200

tctaccgaag tgcccgagcc aacatga 1227

<210> 3

<211> 1227

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atggcaagca cccgtgactg gtttgaaagc attgcggaag cgcagcgccg cgccaaaaag 60

cgtctgccgt ggagcgtgta ctacgcaatt gttgcgggct cggaacgtgg cattacgctg 120

agtgataatg ttgcagcgtt tagtgaactg ggactgatgc cgcgtgttgc agcagcacct 180

caaagccgtg gtcagaccac cgcagttctg ggtgaacaga ttagcctgcc ggttattatt 240

gcaccgaccg gtgttcaggc agtgactccg gaaggggaag ttgcggttgc acgtgcagca 300

gcagcagcgg gtaccattat gatgctgagc agctttgcgt caaaacctat tgaagaggtt 360

attgcagcga atccacgtac cttttttcag atttattggc tgggtagtcg tgaacgtatt 420

ctggcacgtc tggagcgcgt taaaaatgca ggtgcaaaag gcctggtggt tacactggac 480

tggagttttg caacacgtcg tgattggggg agcccgcctc tgccggaacg ttatgacttt 540

aaaaccctgg ttaaatttgc accgcagggt attgcacgtc ctgggtggct gctgcgttat 600

ctgcgtcagg ggggtctgcc gggtctggaa gtgccgaatc tgaccgttcc gggtgaggag 660

ccgccgacct tctttggtgc ttattgggaa tggatgcaga caccgccgcc gacctggtct 720

gatattgcat ggctgcgtga gcagtggggt ggtcgctttg tggttaaagg tattctgcac 780

cctgatgatg cgcgtcgtgc ggtggaaatt ggggtagacg caattattgt ttctaatcat 840

ggtggtaata acctggatgg tgcgccggcg accattcgtg cactgccgag cattgttgat 900

gcggttggtg atcgtgttga ggtgctgctg gatggtggta ttcgtcgtgg tagcgatgtt 960

gttaaagcac tggcactggg tgctcgtgcg gttctgattg gtcgtgctta tctgtggggg 1020

ctggcggcga atggtgaggc gggtgttcgt aatgttctgg atctgctgcg tagtggtatt 1080

gatgagaccc tgctgggtat tggtcgtgca agtattcatg atctgacccc tggtgatgtt 1140

attgttccgc cgggttttac atgtggtccg ggtcctaccg ttactcgtct gcgtcgtcat 1200

agtaccgaag ttccggaacc gacctga 1227

<210> 4

<211> 408

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Met Ala Ser Thr Arg Asp Trp Phe Glu Ser Ile Ala Glu Ala Gln Arg

1 5 10 15

Arg Ala Lys Lys Arg Leu Pro Trp Ser Val Tyr Tyr Ser Ile Val Ala

20 25 30

Gly Ser Glu Arg Gly Ile Thr Leu Ser Asp Asn Val Ala Ala Phe Ser

35 40 45

Glu Leu Gly Leu Met Pro Arg Val Ala Ala Ala Pro Gln Ser Arg Gly

50 55 60

Gln Thr Thr Ala Val Leu Gly Glu Gln Ile Ser Leu Pro Val Ile Ile

65 70 75 80

Ala Pro Thr Gly Val Gln Ala Val Thr Pro Glu Gly Glu Val Ala Val

85 90 95

Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ile Met Met Leu Ser Ser Phe

100 105 110

Ala Ser Lys Pro Ile Glu Glu Val Ile Ala Ala Asn Pro Arg Thr Phe

115 120 125

Phe Gln Ile Tyr Trp Leu Gly Ser Arg Glu Arg Ile Leu Ala Arg Leu

130 135 140

Glu Arg Val Lys Asn Ala Gly Ala Lys Gly Leu Val Val Thr Leu Asp

145 150 155 160

Trp Ser Phe Ala Thr Arg Arg Asp Trp Gly Ser Pro Pro Leu Pro Glu

165 170 175

Arg Tyr Asp Phe Lys Thr Leu Val Lys Phe Ala Pro Gln Gly Ile Ala

180 185 190

Arg Pro Gly Trp Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gln Gly Gly Leu Pro Gly

195 200 205

Leu Glu Val Pro Asn Leu Thr Val Pro Gly Glu Glu Pro Pro Thr Phe

210 215 220

Phe Gly Ala Tyr Trp Glu Trp Met Gln Thr Pro Pro Pro Thr Trp Ser

225 230 235 240

Asp Ile Ala Trp Leu Arg Glu Gln Trp Gly Gly Arg Phe Val Val Lys

245 250 255

Gly Ile Leu His Pro Asp Asp Ala Arg Arg Ala Val Glu Ile Gly Val

260 265 270

Asp Ala Ile Ile Val Ser Asn His Gly Gly Asn Asn Leu Asp Gly Ala

275 280 285

Pro Ala Thr Ile Arg Ala Leu Pro Ser Ile Val Asp Ala Val Gly Asp

290 295 300

Arg Val Glu Val Leu Leu Asp Gly Gly Ile Arg Arg Gly Ser Asp Val

305 310 315 320

Val Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Arg Ala Val Leu Ile Gly Arg Ala

325 330 335

Tyr Leu Trp Gly Leu Ala Ala Asn Gly Glu Ala Gly Val Arg Asn Val

340 345 350

Leu Asp Leu Leu Arg Ser Gly Ile Asp Glu Thr Leu Leu Gly Ile Gly

355 360 365

Arg Ala Ser Ile His Asp Leu Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Pro Pro

370 375 380

Gly Phe Thr Cys Gly Pro Gly Pro Thr Val Thr Arg Leu Arg Arg His

385 390 395 400

Ser Thr Glu Val Pro Glu Pro Thr

405

<210> 5

<211> 1227

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atggcaagca cccgtgactg gtttgaaagc attgcggaag cgcagcgccg cgccaaaaag 60

cgtctgccgt ggagcgtgta ctacagtatt gttgcgggct cggaacgtgg cattacgctg 120

agtgataatg ttgcagcgtt tagtgaactg ggactgatgc cgcgtgttgc agcagcacct 180

caaagccgtg gtcagaccac cgcagttctg ggtgaacaga ttagcctgcc ggttattatt 240

gcaccgaccg gtgttcaggc agtgactccg gaaggggaag ttgcggttgc acgtgcagca 300

gcagcagcgg gtaccattat gatgctgagc agctttgcgt caaaacctat tgaagaggtt 360

attgcagcga atccacgtac cttttttcag atttattggc tgggtagtcg tgaacgtatt 420

ctggcacgtc tggagcgcgt taaaaatgca ggtgcaaaag gcctggtggt tacactggac 480

tggagttttg caacacgtcg tgattggggg agcccgcctc tgccggaacg ttatgacttt 540

aaaaccctgg ttaaatttgc accgcagggt attgcacgtc ctgggtggct gctgcgttat 600

ctgcgtcagg ggggtctgcc gggtctggaa gtgccgaatc tgaccgttcc gggtgaggag 660

ccgccgacct tctttggtgc ttattgggaa tggatgcaga caccgccgcc gacctggtct 720

gatattgcat ggctgcgtga gcagtggggt ggtcgctttg tggttaaagg tattctgcac 780

cctgatgatg cgcgtcgtgc ggtggaaatt ggggtagacg caattattgt ttctaatcat 840

ggtggtaata acctggatgg tgcgccggcg accattcgtg cactgccgag cattgttgat 900

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gttaaagcac tggcactggg tgctcgtgcg gttctgattg gtcgtgctta tctgtggggg 1020

ctggcggcga atggtgaggc gggtgttcgt aatgttctgg atctgctgcg tagtggtatt 1080

gatgagaccc tgctgggtat tggtcgtgca agtattcatg atctgacccc tggtgatgtt 1140

attgttccgc cgggttttac atgtggtccg ggtcctaccg ttactcgtct gcgtcgtcat 1200

agtaccgaag ttccggaacc gacctga 1227

Claims

1.一种L-泛解酸内酯脱氢酶TpLPLDH，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。

2.一种L-泛解酸内酯脱氢酶突变体，由SEQ ID NO.1所示氨基酸第29位氨基酸经单点突变而得。

3.如权利要求2所述的L-泛解酸内酯脱氢酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.编码权利要求1所述L-泛解酸内酯脱氢酶TpLPLDH的基因。

5.编码权利要求2或3所述L-泛解酸内酯脱氢酶突变体的基因。

6.权利要求1或2所述L-泛解酸内酯脱氢酶及其突变体在生物催化制备D-泛酸前体中间物酮泛解酸内酯中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：以含所述L-泛解酸内酯脱氢酶或突变体编码基因的工程菌株经过诱导表达后获得的湿菌体为催化剂，以L-泛解酸内酯为底物，于磷酸缓冲液中，在28~32℃、100~200 rpm条件下进行反应，反应结束后反应液乙酸乙酯萃取，于有机相中获得所述酮泛解酸内酯。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述以湿菌体重量计为5~10 g/L磷酸缓冲溶液，所述底物的初始浓度为100~1000 mM缓冲溶液。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含有所述L-泛解酸内酯脱氢酶或突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃，180 rpm下培养8h获得种子液，种子液再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有终浓度50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37 ℃，180 rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6~0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000 rpm离心10 min，弃去上清液，收集获得湿菌体。