CN112409493B - 一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组融合酶及其在合成乙醛酸甲酯中的应用，所述重组融合酶是将乙醇酸氧化酶、过氧化氢酶和血红蛋白通过连接肽连接构成。本发明以乙醇酸氧化酶突变体、过氧化氢酶和血红蛋白的融合酶为生物催化剂，催化200mM乙醇酸甲酯的氧化，反应6h后产物乙醛酸甲酯的得率达95.4％，所述方法绿色高效，条件温和，副产物少；除了氧气，不需加入其它辅底物和辅酶，适合大规模工业生产。

Description

一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物催化领域，涉及一种乙醇酸氧化酶、过氧化氢酶和血红蛋白的融合酶及其在酶法合成乙醛酸甲酯中的应用。
(二)背景技术
乙醛酸甲酯是一种广泛应用于医药、化工等领域的重要中间体。作为医药中间体，乙醛酸甲酯可用于合成雷迪帕韦，雷迪帕韦可应用在治疗基因Ⅰ型的丙型肝炎感染疾病。作为化工原料，乙醛酸甲酯与异丁醛在酸性条件下以L-组氨酸作为有机催化剂发生醛醛缩合反应，再经醇脱氢酶还原，自发水解环化成D-泛解酸内酯。乙醛酸甲酯还可应用在生产铝合金门窗防晒涂料，该涂料防晒性能好，可以有效的保护铝合金门窗。乙醛酸甲酯的合成方法包括化学法和生物酶法，其中马来酸二甲酯臭氧氧化法、酒石酸二甲酯高碘酸氧化法、二甲氧基乙醛酸甲酯与乙醛酸一水化合物烷基交换法、以及丙烯酸酯过氧化氢氧化法是制备乙醛酸甲酯的常用化学方法。化学法工艺条件要求苛刻，能耗大，反应过程中需要用到强氧化剂以及强酸，污染环境且会产生大量副产物，为后续的分离纯化也带来了极大的困难。相对应地，生物催化由于其高活力、高选择性和环境友好等特点而受到了越来越多的关注。生物酶法制备乙醛酸甲酯中，作为生物催化剂的酶可以是乙醇酸氧化酶，也可以是乙醇酸脱氢酶。乙醇酸氧化酶在氧气的参与下催化乙醇酸甲酯氧化产生乙醛酸甲酯和过氧化氢；过氧化氢对酶活力有害，因而往往需要过氧化氢酶经过氧化氢进一步分解成水和氧气。乙醇酸脱氢酶在烟酰胺辅酶的作用下催化乙醇酸甲酯脱氢生成乙醛酸甲酯，该方法一般需要添加昂贵的烟酰胺辅酶以及实现高效的辅酶再生。乙醇酸氧化酶和乙醇酸脱氢酶在合成乙醛酸甲酯中的应用各有优缺点。相比较而言，乙醇酸氧化酶不需要涉及烟酰胺辅酶的添加以及辅酶再生，更具有应用潜力。目前，乙醇酸氧化酶的催化活力以及稳定性尚达不到工业化生产要求的水平，运用基因工程、蛋白质工程、反应工程等手段提高其在酶法合成乙醛酸甲酯中的催化表现，可助推酶法酶法合成乙醛酸甲酯的产业化实施。
我们选取了来自菠菜的乙醇酸氧化酶作为生物催化剂，对其基因进行定向进化，利用Fe2+显色剂构建乙醇酸氧化酶突变体的高通量筛选体系，从而筛选获得高酶活的乙醇酸氧化酶突变体M267S/S362G，并对位点M267和S362进行点饱和突变获得最优组合突变体M267T/S362G。通过将乙醇酸氧化酶突变体与过氧化氢酶和血红蛋白进行融合表达获得融合酶，该融合酶中乙醇酸氧化酶突变体在氧气参与下催化乙醇酸甲酯氧化生成乙醛酸甲酯和过氧化氢，过氧化氢由过氧化氢酶清除，血红蛋白增加溶氧，从而提高了催化活力，提升了反应的时空得率。以融合酶为生物催化剂，构建并优化了酶法氧化乙醇酸甲酯合成乙醛酸甲酯的反应体系。目前，尚未有乙醇酸氧化酶突变体M267T/S362G的报道，也未见融合表达乙醇酸氧化酶突变体M267T/S362G、过氧化氢酶和血红蛋白并应用于酶法合成乙醛酸甲酯的报道。
(三)发明内容
本发明目的在于提供一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用，本发明构建了乙醇酸氧化酶、过氧化氢酶和血红蛋白的重组融合酶，以及利用该融合酶催化合成乙醛酸甲酯，该方法具有高效、条件温和、绿色环保、高产率等优点，避免了化学法中常见的过度氧化、条件苛刻、催化剂不够环保等问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种重组融合酶，所述重组融合酶由乙醇酸氧化酶(GO)、过氧化氢酶(CAT)和血红蛋白(VsHGB)通过连接肽连接构成；所述连接肽包括连接肽GSG或连接肽GGGGS。
进一步，所述融合酶为下列之一：VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT、VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT、VsHGB-GGGGS-GO-GSG-CAT、VsHGB-GGGGS-GO-GGGGS-CAT、CAT-GSG-GO-GSG-VsHGB、CAT-GSG-GO-GGGGS-VsHGB、CAT-GGGGS-GO-GSG-VsHGB、CAT-GGGGS-GO-GGGGS-VsHGB。
进一步，所述乙醇酸氧化酶来源于菠菜，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述过氧化氢酶源自幽门杆菌，氨基酸序列如SEQID NO.6所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；血红蛋白源自透明颤菌，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
进一步，所述重组融合酶由乙醇酸氧化酶突变体(GOmut)、过氧化氢酶(CAT)和血红蛋白(VsHGB)通过连接肽连接构成；优选为VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT，是将血红蛋白以连接肽GSG连接于乙醇酸氧化酶突变体的N端，过氧化氢酶以连接肽GGGGS连接于乙醇酸氧化酶突变体的C端。所述乙醇酸氧化酶突变体(GOmut)是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第267位蛋氨酸突变为苏氨酸，第362位丝氨酸突变为甘氨酸(M267T/S362G)，其，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还涉及含重组融合酶基因的载体及所述载体构建的重组基因工程菌。所述的含重组融合酶基因的载体及重组基因工程菌的构建包括如下步骤：分别扩增乙醇酸氧化酶GO或突变体GOmut、过氧化氢酶CAT和血红蛋白VaHGB的编码基因，运用重叠PCR将三个编码基因通过连接肽GSG和GGGGS连接，构成融合基因片段。通过一步克隆法将融合基因片段连接到载体pET28a的EcoR I和Hind III位点，得到重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到所述含重组融合酶基因的重组基因工程菌。
优选的重组基因工程菌为E.coli BL21(DE3)/pET28a-VsHGB-GSG-GOmut-
GGGGS-CAT。
本发明还提供一种重组融合酶在乙醛酸甲酯合成的应用，所述应用：将含融合酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎、离心，取上清液即为粗酶液，以粗酶液为生物催化剂，加入底物乙醇酸甲酯，和/或黄素单核苷酸，以pH 6.0～10.0、50mM缓冲液为反应介质构成转化体系，在5～40℃、纯氧速率在0～3L/h条件下进行反应，反应完毕后，反应液先经乙酸乙酯萃取，萃取液再通过减压蒸馏去除乙酸乙酯获得乙醛酸甲酯。
进一步，缓冲液优选为50mM Tris-HCl(pH 8.0)。反应温度优选为15℃，所述纯氧速率优选1L/h。
进一步，所述转化体系中，粗酶液加入量以总蛋白含量计终浓度为1-5g/L，优选2g/L；所述黄素单核苷酸加入终浓度为0～0.2mM(优选0.01mM)，底物加入终浓度为50～400mM(优选200mM)。本发明“和/或黄素单核苷酸”是指黄素单核苷酸可以添加，也可以不添加。
进一步，本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含融合酶编码基因的工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.5～0.7，再加入终浓度为0.6mM的IPTG，20℃诱导12h，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和10000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。所述LB培养基组成为：5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，pH 7.0-7.5。
进一步，本发明所述粗酶液按如下方法制备：将湿菌体以1g：20mL的比例溶解到50mM的Tris-HCl(pH 8.0)中，然后再使用超声破碎仪破碎细胞，以工作2s，间隔6s，功率125W的程序破碎15min，在4℃和8000rpm下离心10min，上清即为粗酶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一系列重组融合酶，并通过对乙醇酸氧化酶的定向进化获得了更高活力的乙醇酸氧化酶突变体M267T/S362G；通过融合表达获得了一个乙醇酸氧化酶突变体、过氧化氢酶和血红蛋白的融合酶，该融合酶中乙醇酸氧化酶突变体在氧气参与下催化乙醇酸甲酯氧化生成乙醛酸甲酯和过氧化氢，过氧化氢由过氧化氢酶清除，血红蛋白增加溶氧，从而提高了催化活力，提升了反应的时空得率。在优化的反应条件下(氧气速率为1L/h，反应温度为15℃，缓冲液pH为8.0，反应时间为6h)，当底物乙醇酸甲酯浓度为200mM时，乙醛酸甲酯得率达95.37％，具有很好的工业应用前景。
(四)附图说明
图1为生物酶法合成乙醛酸甲酯的原理图。
图2为乙醇酸氧化酶编码基因的易错PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M为marker；泳道1-10为突变文库随机挑取的10个单克隆。
图3为不同H2O2浓度下的显色反应。
图4为显色法测H2O2的标准曲线。
图5为基于96孔板的显色法初筛结果，第一行第一列样品A1为对照，其余样品为突变文库样品。
图6为7种突变子与原始乙醇酸氧化酶的液相复筛结果对比图。
图7为8种不同组合融合基因的琼脂糖电泳图；泳道M为marker；泳道1-8为不同连接肽以及连接顺序的融合酶基因。
图8为重组融合酶的聚丙烯酰胺电泳图，泳道M为marker；泳道1为基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT未经诱导的细胞粗提液；泳道2-9为不同连接肽以及连接顺序的融合酶的粗酶液。
图9为融合酶催化反应产物液相色谱检测(HPLC)图谱。
图10为HPLC法测乙醇酸甲酯的标准曲线。
图11为HPLC法测乙醛酸甲酯的标准曲线。
图12为融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT粗酶液的SDS-PAGE图。M，Marker；1，对照(未经诱导的粗酶液)；2，诱导产生的融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT粗酶液。
图13为氧气速率对乙醛酸甲酯得率的影响。
图14为反应温度对乙醛酸甲酯得率的影响。
图15为缓冲液pH对乙醛酸甲酯得率的影响。
图16为底物浓度对乙醛酸甲酯得率的影响。
图17为辅酶FMN浓度对乙醛酸甲酯得率的影响。
(五)具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所述常温或室温是指25-30℃。
实施例1：乙醇酸氧化酶突变子文库的构建
对来源于菠菜中的野生型乙醇酸氧化酶GO编码基因(GenBank accessionnumber:ABY61829.1)进行密码子优化，根据密码子优化后的编码基因(核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)设计易错PCR引物，分别为GO-F，GO-R。编码基因、引物委托杭州擎科生物技术有限公司合成。
GO-F：
ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGGAAATCACCAACGTTAACG
GO-R：CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTCAGGCGAGCAACAGCACG
将GO编码基因连接在pET28a载体上，获得对应的质粒pET28a-GO。以质粒pET28a-GO为扩增模板，根据北京天恩泽基因科技有限公司的可调式易错PCR试剂盒使用方法构建突变子文库，PCR反应体系如下表1。
表1乙醇酸氧化酶GO基因的易错PCR反应体系
Figure BDA0002628888560000051
依据北京天恩泽公司可调式易错PCR手册说明对易错PCR的反应程序进行设定，易错PCR一般无需热启动与PCR后的彻底延伸处理。易错PCR扩增步骤为(1)94℃，预变性3min；(2)94℃，变性1min；(3)56℃，退火1min；(4)72℃，延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次，冷却至4℃。PCR扩增结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。
采用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切pET28a空载体，通过一步克隆法将易错PCR扩增的目的片段连接到载体上。将合成的重组表达质粒取出5μL加入到50μL E.coliBL21(DE3)感受态中，轻弹管壁混匀，冰上放置30min。42℃水浴热击45s，立即置于冰上2min。向管中加入1mL LB液体培养基，37℃摇床培养1h。将培养液4500rpm离心4min，取出800μL上清。用剩下的培养基将菌体悬浮，取100μL涂在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养箱培养12-14h，得到突变子文库，后续的突变子筛选总数大于8000个克隆。为了确定构建的突变文库是否具有合理性，将转化后的平板过夜培养后随机挑取10个单克隆进行菌落PCR验证，PCR验证电泳图如图2所示，从图可知挑取的菌落PCR结果均出现约为1100bp的清晰条带，大小与乙醇酸氧化酶GO基因的易错PCR产物一致，这表明所挑取的克隆都为阳性克隆。
实施例2：乙醇酸氧化酶突变子文库的诱导表达及其筛选验证
1、初筛
通过96深孔板将实施例1乙醇酸氧化酶突变子文库进行诱导表达，具体步骤如下：用无菌的10μL枪头将LB平板上的突变子单菌落逐个挑到每孔加有500μL含100μg/mL卡拉霉素(Kana)的LB培养基的96深孔板中，该板作为种子板，在37℃，200rpm摇床内过夜培养，获得种子液。取部分种子液用于诱导表达，种子板剩余菌液在5000rpm离心10min，除去上清后向每孔添加500μL 40％(v/v)的甘油(含100μg/mL Kana)，将其放置于-20℃保存。
取种子液以体积浓度2％的接种量接种到新的每孔含有500μL诱导培养基(含100μg/mL Kana，0.2mM IPTG的LB液体培养基)的96深孔板中，该板作为诱导表达板，在25℃，150rpm摇床中培养12h进行诱导表达，诱导结束后的菌液于8000rpm离心10min，弃去上清。加入100μL细胞裂解液(内含pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，1mg/mL溶菌酶，2mM EDTA，100mMNaCl，0.5％Triton X-100)，混匀，在常温(25-30℃)和-80℃条件下反复冻融三次进行破壁处理。于4℃，4000rpm离心20min，取破壁上清液，即粗酶液。同样条件下，对野生型乙醇酸氧化酶进行诱导表达，制得粗酶液作为对照。
往10μL粗酶液中加入终浓度为100mM的乙醇酸甲酯，充分混匀后在37℃下反应8h，反应结束后于4℃、4000rpm离心20min，取上清作为检测液。用排枪吸取20μL上清到96微孔板中，再用排枪吸取200μL指示剂(含有Fe2+离子的显色液，购自上海生工)到微孔板中，轻轻吹吸均匀，于常温下振荡转化30min，观察每孔的颜色变化(结果见图5)，用酶标仪测定每孔的OD595值。突变子显色法初筛的原理在于，乙醇酸氧化酶催化乙醇酸甲酯氧化生成乙醛酸甲酯和H2O2，H2O2氧化Fe2+成Fe3+，Fe3+在酸性条件下与显色液中的染料结合形成紫色的Fe3+-染料复合物。
将不同浓度(0、1、10、20、40、60、80、100μM)H2O2水溶液20μL与200μL指示剂(含有Fe2+离子的显色液)加入微孔板中，轻轻吹吸均匀，于常温下振荡转化30min，观察每孔的颜色变化(图3)，用酶标仪测定每孔的OD595值。显色反应的OD595值与H2O2浓度呈线性关系(图4)，线性方程为y＝0.01185x+0.13068，其中y为OD595值，x为H2O2浓度，单位μM。
根据图4，从实施例1筛选的8000多个克隆中，获得了阳性克隆7个(分别记为7-A6、13-H5、15-F10、15-G2、20-C7、22-H3和31-D12)，对应的过氧化氢浓度见表2。经测序，分别确定了对应的突变位点以及引入的突变，结果如表2所示。由表2可知，突变菌株20-C7产生过氧化氢浓度最高为80.62μM，这表明突变子20-C7的催化反应转化率最高。
表2乙醇酸氧化酶突变子的初筛结果
Figure BDA0002628888560000061
2、复筛
将通过Fe2+离子的显色液初筛得到的7个阳性突变体和野生乙醇酸氧化酶转接至50mL的含100μg/mL卡那抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm摇床内过夜培养。以体积浓度2％的接种量转接至50mL的含100μg/mL卡那抗生素的LB液体培养基中培养约2h，当其OD600为0.6-0.8时加入诱导剂0.2mM IPTG，在25℃、150rpm的摇床内培养12h，诱导完成后，离心弃除上清，用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，在8000rpm离心10min收集菌体。将2g菌体以1g：20mL的比例溶解到50mM的Tris-HCl(pH 8.0)中，利用细胞超声破碎仪进行细胞破碎，通过工作2s，间隔6s，功率125W的程序破碎15min。在4℃和8000rpm下离心10min，上清即为粗酶液，检测总蛋白含量为80mg。收集诱导表达后的粗酶液用于检测酶催化效果，粗酶液加入量以总蛋白量计，后续实施例相同。乙醇酸甲酯的催化反应体系总体积为5mL，催化反应体系如下表3。粗酶液的蛋白质浓度利用BCA法测定，以BSA蛋白为参比蛋白。
表3乙醇酸甲酯催化反应体系
Figure BDA0002628888560000071
注：辅酶FMN是指黄素单核苷酸。
在20℃，600rpm，通氧速率1L/h下反应8h，反应完全后离心取上清，用流动相稀释20倍再进行高效液相色谱分析测定乙醛酸甲酯的生成量。
液相色谱检测条件为：Waters1525-2489高效液相色谱仪，色谱柱为
Figure BDA0002628888560000074
C18(250mm×4.6mm，粒径5μm)，流动相为0.1％(v/v)稀磷酸(pH2.7)，流速为0.5mL/min，柱温为40℃，检测波长212nm，进样量10μL。
乙醇酸氧化酶的酶活定义为：在25℃，pH 8.0的条件下，1min内转化底物乙醇酸甲酯生成1μmol乙醛酸甲酯的酶量为1个酶活单位(U)。
酶活计算公式如下：
Figure BDA0002628888560000072
通过7种突变菌粗酶液催化反应8h后的乙醛酸甲酯的浓度，计算获得相对酶活力，复筛结果如图6所示。由图6可知，突变菌株20-C7(M267S/S362G)酶活提高最多，为原始菌株的1.53倍，与初筛的结果一致，复筛结果也验证了Fe2+离子显色剂高通量筛选方法的可行性。
实施例3：乙醇酸氧化酶正向突变体M267S/S362G的定点饱和突变
将实施例2筛选验证获得正向突变体M267S/S362G进行定点饱和突变，设计定点饱和突变的引物，引物序列如下表4。
表4乙醇酸氧化酶定点饱和突变引物
Figure BDA0002628888560000073
引物划线部分代表突变位点，NNN代表简并引物。
PCR反应体系参考表1，PCR扩增反应程序为(1)95℃，预变性5min；(2)95℃，变性15s；(3)60℃，退火30s；(4)72℃，延伸3min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃彻底延伸5min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，定点饱和突变文库筛选的验证参考实施例2。
利用Fe2+离子显色剂高通量筛选方法进行验证，测序结果表明，当突变菌株20-C7的267位点为苏氨酸和362位点为甘氨酸时，组合突变子M267T/S362G产生过氧化氢浓度最高，为96.73μM。利用高效液相色谱复筛，组合突变子M267T/S362G的酶活为原始菌株的1.78倍。通过验证结果表明：突变体M267T/S362G为该位点组合的最优氨基酸替换，记为GOmut(即将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第267位蛋氨酸突变为苏氨酸，第362位丝氨酸突变为甘氨酸，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3)。
实施例4：融合酶中乙醇酸氧化酶GO基因、过氧化氢酶CAT基因以及血红蛋白VsHGB基因各单独基因片段的获取
本发明实施例所述融合酶中的乙醇酸氧化酶GO编码基因源自植物菠菜(核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，过氧化氢酶CAT源自幽门杆菌(核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)，血红蛋白VsHGB源自透明颤菌(核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)。由杭州擎科生物技术有限公司合成质粒pET28a-GO、pET28a-CAT以及pET28a-VsHGB。为获得乙醇酸氧化酶GO基因、过氧化氢酶CAT基因以及血红蛋白VsHGB基因单独基因片段，根据乙醇酸氧化酶GO编码基因(GenBank accession number:ABY61829.1)，过氧化氢酶CAT(GenBankaccession number:AHY00946.1)，血红蛋白VsHGB(GenBank accession number:AKT95196.1)基因序列设计GO、CAT和VsHGB基因扩增引物，扩增引物序列见表5所示。
表5融合酶中各单独基因片段扩增引物序列
Figure BDA0002628888560000081
以pET28a-GO、pET28a-CAT以及pET28a-VsHGB质粒为模板，进行PCR扩增，扩增体系为2×Prime STAR Max Mix 15μL，引物F和R各1μL，DNA模板1μL和ddH2O 12μL。PCR扩增步骤为(1)95℃，预变性5min；(2)95℃，变性15s；(3)58℃，退火30s；(4)72℃，延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃彻底延伸5min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带，分别获得乙醇酸氧化酶GO基因片段、过氧化氢酶CAT基因片段以及血红蛋白VsHGB基因片段。
实施例5：融合酶基因的获得
本实施例以融合酶VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT为例，说明重组融合酶基因的获得，根据实施例4方法扩增的乙醇酸氧化酶GO基因、过氧化氢酶CAT基因以及血红蛋白VsHGB基因设计引物。
1、血红蛋白VsHGB基因
设计VsHGB上游引物和下游引物：
VsHGB上游引物pET28a-VsHGB-F(表6):
ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGCTGGACCAGCAGACCAT
VsHGB下游引物VsHGB-GSG-R(表6)：
GTGATTTCCATTCCACTTCCTTCAACTGCCTGAGCGTACAGA
上游引物引入限制内切酶位点EcoR I以及pET28a载体上的同源臂片段，下游引物引入连接肽GSG编码基因以及GO基因上游的同源臂片段。PCR反应体系为2×Prime STARMax Mix 25μL，上游引物和下游引物各1μL，VsHGB基因模板1μL和ddH2O 22μL。PCR扩增步骤为(1)95℃，预变性5min；(2)95℃，变性15s；(3)60℃，退火30s；(4)72℃，延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃彻底延伸5min，冷却至4℃。
2、乙醇酸氧化酶GO基因
设计GO上游引物和下游引物：
GO上游引物GSG-GO-F(表6)：
CAGGCAGTTGAAGGAAGTGGAATGGAAATCACCAACGTTAACG
GO下游引物GO-GSG-R(表6)：
GGTCTTGACTCATTCCACTTCCCAGGCGAGCAACAGCACG
上游引物引进连接肽GSG编码基因(5’-GGAAGTGGA-3’)以及VsHGB下游同源臂片段，下游引物引入连接肽GSG编码基因以及CAT上游同源臂片段。PCR反应体系为2×PrimeSTAR Max Mix 25μL，上游引物和下游引物各1μL，GO基因模板1μL和ddH2O 22μL。PCR扩增步骤为(1)95℃，预变性5min；(2)95℃，变性15s；(3)60℃，退火30s；(4)72℃，延伸30s；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃彻底延伸5min，冷却至4℃。
3、过氧化氢酶CAT基因
设计CAT上游引物和下游引物：
CAT上游引物GSG-CAT-F(表6)：
TGTTGCTCGCCTGGGAAGTGGAATGAGTCAAGACCCTAAAAAATGTC
CAT下游引物pET28a-CAT-R(表6)：
CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTAAGAAAACTTGGTAAACCTTTAGCA
上游引物引入GO下游同源臂片段以及GSG连接肽编码基因，下游引物引入限制内切酶位点Hind III以及pET28a载体上的同源臂片段。PCR反应体系为2×Prime STAR MaxMix25μL，上游引物和下游引物各1μL，CAT基因模板1μL和ddH2O 22μL。PCR扩增步骤为(1)95℃，预变性5min；(2)95℃，变性15s；(3)58℃，退火30s；(4)72℃，延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃彻底延伸5min，冷却至4℃。
4、重组融合酶基因
所有PCR产物经柱纯化后作为下一步重叠PCR的模板。重叠PCR反应体系为2×Prime STAR Max Mix 25μL，VsHGB上游引物和CAT下游引物各1μL，GO，CAT和VsHGBPCR回收产物分别为0.5μL，1.5μL，0.5μL以及ddH2O 21μL。PCR扩增步骤为(1)95℃，预变性5min；(2)95℃，变性15s；(3)58℃，退火30s；(4)72℃，延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃彻底延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经柱纯化后即可获得重组融合酶基因，该基因编码VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT(图7中泳道1)。
5、采用相同的方法，分别获得7个重组融合基因，分别编码如下融合酶：
VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT(图7中泳道2)；
VsHGB-GGGGS-GO-GSG-CAT(图7中泳道3)；
VsHGB-GGGGS-GO-GGGGS-CAT(图7中泳道4)；
CAT-GSG-GO-GSG-VsHGB(图7中泳道5)；
CAT-GSG-GO-GGGGS-VsHGB(图7中泳道6)；
CAT-GGGGS-GO-GSG-VsHGB(图7中泳道7)；
CAT-GGGGS-GO-GGGGS-VsHGB(图7中泳道8)。
用于构建融合基因的引物汇总于表6和表7。
表6扩增VsHGB-linker-GO-linker-CAT融合酶基因的PCR引物
Figure BDA0002628888560000101
表7扩增CAT-linker-GO-linker-VsHGB融合酶基因的PCR引物
Figure BDA0002628888560000102
Figure BDA0002628888560000111
如图7所示，八种不同组合融合基因均在2.9kb左右出现清晰条带。测序结果显示，八种不同组合融合基因均包含乙醇酸氧化酶基因、过氧化氢酶基因和血红蛋白基因以及不同组合的连接肽，这表明八种不同组合融合基因构建成功。
实施例6：重组表达载体的构建和重组表达转化体的制备
1、以融合酶VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT为例，说明重组表达载体pET28a-VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT的构建和重组表达转化体的制备
将实施例5方法构建的血红蛋白-乙醇酸氧化酶-过氧化氢酶(VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT)PCR产物经柱纯化，用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切pET28a空载体，通过Vazyme公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit试剂盒进行一步克隆连接。连接体系为融合基因PCR产物和双酶切pET28a载体各1μL，5×CE MultiS Buffer 4μL，ExnaseMultiS 2μL，ddH2O 12μL。在37℃金属浴重组反应30min；反应结束后降至4℃。
将融合酶连接产物取出5μL加入到50μL E.coliBL21(DE3)感受态中，轻弹管壁混匀，冰上放置30min。42℃水浴热击45s，立即置于冰上2min。向管中加入1ml LB液体培养基，37℃摇床培养1h。将培养液4500rpm离心4min，取出800μL上清。用剩下的培养基将菌体悬浮，取出100μL涂在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养箱过夜培养12-14h，得到基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT。
2、采用同样方法，分别获得其它七个基因工程菌：
E.coliBL21(DE3)/pET28a-VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT；
E.coliBL21(DE3)/pET28a-VsHGB-GGGGS-GO-GSG-CAT；
E.coliBL21(DE3)/pET28a-VsHGB-GGGGS-GO-GGGGS-CAT；
E.coliBL21(DE3)/pET28a-CAT-GSG-GO-GSG-VsHGB；
E.coliBL21(DE3)/pET28a-CAT-GSG-GO-GGGGS-VsHGB；
E.coliBL21(DE3)/pET28a-CAT-GGGGS-GO-GSG-VsHGB；
E.coliBL21(DE3)/pET28a-CAT-GGGGS-GO-GGGGS-VsHGB。
实施例7：重组融合酶的诱导表达及分离
1、以融合酶VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT为例，说明重组融合酶的诱导表达及分离
将实施例6构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，25℃诱导12h，获得诱导培养液，再将培养液于4℃和10000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
将上述湿菌体2g按1g湿菌体加20mL Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)的比例加入适量Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，在125W下超声破碎15min(工作2s，间歇6s)后，破碎液于4℃和10000rpm下离心10min，重复离心三次后得到上清，即为重组融合酶粗酶液VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT，采用实施例2方法检测总蛋白质含量为40mg(图8中泳道2)。粗酶液的蛋白质浓度利用BCA法测定，以BSA蛋白为参比蛋白。
2、同样方法，分别获得不同组合的重组融合酶粗酶液：
VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT(图8中泳道3)；
VsHGB-GGGGS-GO-GSG-CAT(图8中泳道4)；
VsHGB-GGGGS-GO-GGGGGS-CAT(图8中泳道5)；
CAT-GSG-GO-GSG-VsHGB(图8中泳道6)；
CAT-GSG-GO-GGGGS-VsHGB(图8中泳道7)；
CAT-GGGGS-GO-GSG-VsHGB(图8中泳道8)；
CAT-GGGGS-GO-GGGGS-VsHGB(图8中泳道9)。
不同组合的重组融合酶粗酶液通过SDS-PAGE凝胶电泳验证，SDS-PAGE电泳结果如图8所示。重组融合酶的亚基理论大小为110kDa，在SDS-PAGE电泳上的表观大小均约为100-120kDa，与预期相符。
实施例8：整细胞以及酶法催化乙醇酸甲酯生成乙醛酸甲酯的表现比较
采用实施例7方法，以融合酶VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT为例，融合酶的基因工程菌经诱导后的湿菌体，湿菌体经细胞破碎、离心后获得粗酶液。分别以湿菌体和粗酶液作为生物催化剂。
湿菌体：湿菌体加入终浓度50g/L、以终浓度为100mM乙醇酸甲酯为底物，以50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)为反应介质构成5mL反应体系，在20℃，600rpm，通氧速率1L/h下反应8h，反应完全后，离心取上清，再用流动相稀释上清液进行液相分析。
粗酶液：粗酶液的加入量以总蛋白含量计终浓度2g/L、以终浓度为100mM乙醇酸甲酯为底物，以50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)为反应介质构成5mL反应体系，在20℃，600rpm，通氧速率1L/h下反应8h，反应完全后，离心取上清，再用流动相稀释上清液进行液相分析。
液相色谱检测条件为：Waters1525-2489高效液相色谱仪，色谱柱为
Figure BDA0002628888560000121
C18(250×4.6/5μm)，流动相为0.1％(v/v)稀磷酸(pH 2.7)，流速为0.5mL/min，柱温为40℃，检测波长212nm，进样量10μL。乙醇酸甲酯和乙醛酸甲酯的色谱峰保留时间分别为9.655min和4.695min(图9)。液相分析通过底物和产物的峰面积进行定量，乙醇酸甲酯的标准曲线方程为y＝72529.2x-9910，其中y为峰面积，x为乙醇酸甲酯浓度，单位为mM(图10)；乙醛酸甲酯的标准曲线方程为y＝42822.8x-295605.9，其中y为峰面积，x为乙醛酸甲酯浓度，单位为μM(图11)。产率的计算方法为产物的摩尔数÷初始底物的摩尔数×100。
分别以湿菌体和粗酶液作为生物催化剂，当氧化反应进行8h后，整细胞催化反应液的杂质过多，且产率低，而酶法具有高产率和副产物少的优势。整细胞与酶法催化产率对比见表8所示。产率的计算方法为产物的摩尔数÷初始底物的摩尔数×100。
表8整细胞法与酶法催化反应中的产率对比
Figure BDA0002628888560000131
实施例9：不同重组融合酶对乙醛酸甲酯的产率影响
以实施例7方法制备的粗酶液作为生物催化剂，加入量以总蛋白含量计终浓度均为2g/L，以终浓度为100mM乙醇酸甲酯为底物，以50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)为反应介质构成5mL反应体系，在20℃、600rpm、通氧速率1L/h下反应4h，反应完全后，离心取上清，采用实施例8方法再用流动相稀释上清液进行液相分析，产率见表9。
催化反应4h后，融合酶VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT对乙醛酸甲酯产率为67.8％，相对于原始乙醇酸氧化酶产率提高了5.29倍。
表9不同组合的融合酶催化乙醇酸甲酯的效果比较
Figure BDA0002628888560000132
以质粒pET28a-VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT为模板，利用表10中引物M267T-F和S362G-R扩增M267和S362之间的基因片段，利用表中引物M267T-R和S362G-F反向PCR扩增pET28a-VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT其余部分，然后通过Vazyme公司的ClonExpress MultiSOne Step Cloning Kit试剂盒进行一步克隆连接形成完整质粒pET28a-VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT，从而将融合酶VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT中的GO基因替换为更高活力的突变体M267T/S362G基因，经实施例7方法进行基因工程菌诱导表达与细胞破碎后，获得融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT粗酶液，以未诱导粗酶液为对照。融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT经SDS-PAGE电泳分析，其分子大小与预期相符(图12，泳道2)。进一步的催化实验验证表明，该融合酶粗酶液将产率从67.8％进一步提高至82.8％。因而，在后续的催化条件优化中，均以含乙醇酸氧化酶突变体的融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT粗酶液为生物催化剂。
此外，乙醇酸甲酯酶法氧化反应完毕后，反应液于12000rpm下离心2min，取上清液与乙酸乙酯以体积比1:9混合，在金属浴中300rpm震荡萃取1h，萃取后静置2h再12000rpm下离心2min，萃取液最终通过减压蒸馏去除乙酸乙酯获得产物。
表10定点突变体全质粒PCR引物
Figure BDA0002628888560000141
实施例10:融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT催化反应的最佳氧气速率
探究催化体系的最佳氧气速率，将终浓度2g/L的粗酶液(实施例7方法制备，以总蛋白质含量计)，0.01mM FMN(黄素单核苷酸)，100mM乙醇酸甲酯充分溶解混匀，以50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)为反应介质构成5mL反应体系。通入不同速率的纯氧，利用磁力搅拌器控制反应温度为15℃，转速为600rpm。反应6h后，8000rpm离心5min，取上清使用HPLC测定乙醛酸甲酯的产率。其中纯氧的速率控制在0～3L/h(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0L/h)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图13所示，当氧气速率增加到1L/h，乙醛酸甲酯产率达到最高为97.8％，继续增加氧气速率，乙醛酸甲酯产率反而下降，因此选择氧气速率为1L/h是最合适的。
实施例11:融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT催化反应的最适反应温度
探究催化体系的最佳反应温度，将终浓度2g/L的粗酶液(实施例7方法制备，以总蛋白质含量计)、0.01mM的FMN和100mM乙醇酸甲酯充分溶解混匀，以50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)为反应介质构成5ml反应体系，通入纯氧速率为1L/h，利用磁力搅拌器控制反应温度为5～40℃(5、10、15、20、25、30、35和40℃)，转速为600rpm。反应6h后，8000rpm离心5min，取上清使用HPLC测定乙醛酸甲酯的产率。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图14所示，在不同反应温度条件5、10、15、20、25、30、35、40℃下反应6h，进行液相检测分析，计算产率。结果表明，反应体系温度为15℃时乙醛酸甲酯产率最高，当温度达40℃时，高温度会引起酶活性降低，乙醛酸甲酯产率仅为4.4％。因此选择15℃为反应体系的最适温度。
实施例12:融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT催化反应的最适缓冲液pH
探究催化体系的最佳缓冲液pH，采用实施例7方法，将融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT湿菌体加入不同pH的PBS缓冲液(pH6.0、6.5和7.0)、Tris-HCl缓冲液(pH 7.5、8.0、8.5和9.0)以及CAPS缓冲液(pH9.5和10.0)通过超声破碎，离心，取上清，获得粗酶液。
将终浓度2g/L(以总蛋白质含量计)不同pH缓冲液的粗酶液、0.01mM的FMN和100mM乙醇酸甲酯充分溶解混匀，以50mM PBS缓冲液(pH 6.0、6.5和7.0)、Tris-HCl缓冲液(pH7.5、8.0、8.5和9.0)或CAPS缓冲液(pH 9.5和10.0)为反应介质构成5mL反应体系，通入纯氧速率为1L/h，利用磁力搅拌器控制反应温度为15℃，转速为600rpm。反应6h后，8000rpm离心5min，取上清使用HPLC测定乙醛酸甲酯的产率。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图15所示，在pH范围为6.0-8.0条件下，乙醛酸甲酯得率呈上升趋势，pH范围为8.0-8.5时，酶对乙醇酸甲酯的催化效率较好，pH为8.0时催化效率最高。当pH大于8.0时，乙醛酸甲酯产率逐渐下降。随着反应的进行反应液的逐渐偏酸，而酸性条件下的乙醛酸甲酯的产率比碱性条件下低，当pH为6.0时，乙醛酸甲酯的产率仅为19.2％。因此催化反应体系的最适pH为8.0。
实施例13:融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT催化反应的最佳底物浓度
探究催化体系的最佳底物浓度，将终浓度2g/L的粗酶液(实施例7方法制备，以总蛋白质含量计)、0.01mM FMN和不同浓度的乙醇酸甲酯充分溶解混匀，以50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)为反应介质构成5mL反应体系，通入纯氧速率为1L/h，利用磁力搅拌器控制反应温度为15℃，转速为600rpm。反应6h后，8000rpm离心5min，取上清使用HPLC测定乙醛酸甲酯的产率。其中乙醇酸甲酯的浓度控制在50～400mM(50、100、150、200、250、300、350和400mM)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图16所示，当底物浓度在200mM以内时，乙醛酸甲酯产率能维持在95％以上，当底物浓度大于200mM时，乙醛酸甲酯产率急剧下降，出现明显的产物抑制，表明高浓度底物不利于融合酶催化反应。
实施例14:融合酶VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT催化反应的最适辅酶FMN浓度
探究催化体系的最佳辅酶FMN浓度，将终浓度2g/L的粗酶液(实施例7方法制备，以总蛋白质含量计)、不同浓度的辅酶FMN和100mM乙醇酸甲酯充分溶解混匀，以50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)为反应介质构成5mL反应体系，通入纯氧速率为1L/h，利用磁力搅拌器控制反应温度为15℃，转速为600rpm。反应6h后，8000rpm离心5min，取上清使用HPLC测定乙醛酸甲酯的产率。其中辅酶FMN浓度控制在0.0～0.20mM(0、0.01、0.05、0.1、0.15和0.2mM)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图17所示，当辅酶FMN浓度控制在0.0～0.20mM时，辅酶FMN浓度对乙醛酸甲酯产率影响不大，乙醛酸甲酯得率均维持在95％以上。因而，反应体系中不需要添加辅酶FMN。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种重组融合酶及其在乙醛酸甲酯合成中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1107
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atggaaatca ccaacgttaa cgaatatgaa gccattgcaa aacagaaact gccgaaaatg 60
gtttatgatt attatgcaag cggtgcagaa gatcagtgga ccctggcaga aaatcgtaat 120
gcatttagcc gcattctgtt tcgtccgcgt attctgatcg atgtgactaa tattgatatg 180
accaccacca ttctgggatt taaaattagc atgccgatca tgattgcacc taccgccatg 240
cagaaaatgg cccatccgga aggtgaatat gccaccgcac gtgcagcaag cgcagccgga 300
accatcatga ccctgagtag ctgggcaacc tcaagcgtgg aagaagttgc aagcacaggc 360
ccgggtattc gtttttttca gctgtatgtt tataaagatc gcaatgttgt tgcacagctg 420
gttcgtcgtg ccgaacgtgc gggttttaaa gcaattgcac tgaccgttga taccccgcgt 480
ctgggtcgtc gtgaggcaga tattaaaaat cgctttgttc tgccgccgtt tctgaccctg 540
aaaaattttg aaggtattga tctgggaaaa atggataaag caaatgatag cggtctgagc 600
agttatgttg caggtcagat tgatcgttca ctgagctgga aagatgttgc atggctgcag 660
accattacca gtctgccgat tctggttaaa ggtgttatta ccgcagaaga tgcacgtctg 720
gcagttcagc atggtgcagc aggtattatt gttagcaatc atggtgcacg tcagctggat 780
tatgttccgg ccacaattat ggcactggag gaagttgtta aagcagcaca gggtcgtatt 840
ccggtttttc tggatggagg tgtgcgtcgt ggtaccgatg tttttaaagc actggcactg 900
ggtgcagcag gcgtgtttat tggtcgtccg gtggtgttta gtctggccgc ggagggtgaa 960
gcaggtgtta aaaaggttct gcagatgatg cgtgatgagt ttgaactgac catggcactg 1020
agtggttgtc gtagcctgaa agaaattagt cgtagccata ttgcagcaga ttgggatgga 1080
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<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
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Leu Pro Lys Met Val Tyr Asp Tyr Tyr Ala Ser Gly Ala Glu Asp Gln
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Pro Arg Ile Leu Ile Asp Val Thr Asn Ile Asp Met Thr Thr Thr Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Lys Ile Ser Met Pro Ile Met Ile Ala Pro Thr Ala Met
65 70 75 80
Gln Lys Met Ala His Pro Glu Gly Glu Tyr Ala Thr Ala Arg Ala Ala
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Leu Pro Ile Leu Val Lys Gly Val Ile Thr Ala Glu Asp Ala Arg Leu
225 230 235 240
Ala Val Gln His Gly Ala Ala Gly Ile Ile Val Ser Asn His Gly Ala
245 250 255
Arg Gln Leu Asp Tyr Val Pro Ala Thr Ile Met Ala Leu Glu Glu Val
260 265 270
Val Lys Ala Ala Gln Gly Arg Ile Pro Val Phe Leu Asp Gly Gly Val
275 280 285
Arg Arg Gly Thr Asp Val Phe Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly
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Ala Gly Val Lys Lys Val Leu Gln Met Met Arg Asp Glu Phe Glu Leu
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Leu
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accaccacca ttctgggatt taaaattagc atgccgatca tgattgcacc taccgccatg 240
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<213> 未知(Unknown)
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Met Glu Ile Thr Asn Val Asn Glu Tyr Glu Ala Ile Ala Lys Gln Lys
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Leu Pro Lys Met Val Tyr Asp Tyr Tyr Ala Ser Gly Ala Glu Asp Gln
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Trp Thr Leu Ala Glu Asn Arg Asn Ala Phe Ser Arg Ile Leu Phe Arg
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Pro Arg Ile Leu Ile Asp Val Thr Asn Ile Asp Met Thr Thr Thr Ile
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Leu Gly Phe Lys Ile Ser Met Pro Ile Met Ile Ala Pro Thr Ala Met
65 70 75 80
Gln Lys Met Ala His Pro Glu Gly Glu Tyr Ala Thr Ala Arg Ala Ala
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Leu Pro Ile Leu Val Lys Gly Val Ile Thr Ala Glu Asp Ala Arg Leu
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Ala Val Gln His Gly Ala Ala Gly Ile Ile Val Ser Asn His Gly Ala
245 250 255
Arg Gln Leu Asp Tyr Val Pro Ala Thr Ile Thr Ala Leu Glu Glu Val
260 265 270
Val Lys Ala Ala Gln Gly Arg Ile Pro Val Phe Leu Asp Gly Gly Val
275 280 285
Arg Arg Gly Thr Asp Val Phe Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly
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Leu
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<212> DNA
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65 70 75 80
Thr Arg Ala Lys Ile Phe Ser Glu Val Gly Lys Lys Thr Glu Met Phe
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Asn Lys Arg Ser Ala Thr Asn Asn Trp Asp Phe Trp Thr Leu Leu Pro
165 170 175
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Ile Asn Ala Gln Asn Glu Arg Phe Trp Val Lys Phe His Met Arg Thr
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Gln Gln Gly Ile Gln Asn Leu Thr Asp Ala Glu Ala Ala Asp Leu Ile
225 230 235 240
Ala Lys Asp Arg Glu Ser Ser Gln Thr Asp Leu Phe Asp Ala Ile Glu
245 250 255
Arg Gly Asp Tyr Pro Lys Trp Lys Met Tyr Val Gln Val Met Pro Glu
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Leu Glu Ala Glu Thr Val Pro Tyr His Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val
275 280 285
Trp Pro Lys Gly Asp Tyr Pro Leu Ile Glu Val Gly Glu Phe Glu Leu
290 295 300
Asn Arg Asn Pro Glu Asn Tyr Phe Gln Asp Val Glu Gln Ala Ala Phe
305 310 315 320
Ala Pro Ser Asn Leu Val Pro Gly Ile Ser Tyr Ser Pro Asp Arg Met
325 330 335
Leu Gln Ala Arg Leu Val Asn Tyr Ala Asp Ala Ala Arg Tyr Arg Val
340 345 350
Gly Val Asn His Ser Gln Val Pro Val Asn Ala Ala Arg Cys Pro Val
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Asn Ser Asn Arg Arg Asp Gly Gln Gly Arg Met Asp Gly Asn Tyr Gly
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Ser Leu Pro His Tyr Glu Pro Asn Ser Phe Asn Gln Trp Gln Glu Gln
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Pro Gln Phe Lys Glu Pro Ala Leu Lys Ile Thr Gly Asp Ala Asp Phe
405 410 415
Trp Asp Phe Arg Glu Asp Asp Asn Asp Tyr Phe Ser Gln Pro Arg Ala
420 425 430
Leu Phe Asn Leu Met Asn Asp Glu Gln Lys Gln Ala Leu Phe Asn Asn
435 440 445
Thr Ala Ala Ala Met Gly Asp Ala Leu Asp Phe Ile Lys Tyr Arg His
450 455 460
Ile Arg Asn Cys Tyr Ala Cys Asp Pro Ala Tyr Gly Gln Gly Val Ala
465 470 475 480
Asn Ala Leu Gly Met Thr Val Ala Asp Ala Gln Ala Ala Arg Glu Thr
485 490 495
Asp Pro Ala Lys Gly Leu Pro Ser Phe Leu
500 505
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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gcatggggta aagcctatgg agtgattgca gatgttttta ttcaggtgga agcagatctg 420
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<211> 146
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<400> 8
Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val
1 5 10 15
Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu
20 25 30
Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln
35 40 45
Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro
85 90 95
Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp
100 105 110
Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val
115 120 125
Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala
130 135 140
Val Glu
145

Claims (6)

1.一种重组融合酶，其特征在于所述重组融合酶由乙醇酸氧化酶GO、过氧化氢酶CAT和血红蛋白VsHGB通过连接肽连接构成；所述连接肽包括连接肽GSG或连接肽GGGGS；
所述融合酶为下列之一：VsHGB-GSG-GO-GSG-CAT、VsHGB-GSG-GO-GGGGS-CAT、VsHGB-GGGGS-GO-GSG-CAT、VsHGB-GGGGS-GO-GGGGS-CAT、CAT-GSG-GO-GSG-VsHGB、CAT-GSG-GO-GGGGS-VsHGB、CAT-GGGGS-GO-GSG-VsHGB、CAT-GGGGS-GO-GGGGS-VsHGB；
所述乙醇酸氧化酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述过氧化氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码基因核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示；血红蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
2.一种重组融合酶，其特征在于所述重组融合酶由乙醇酸氧化酶突变体GOmut、过氧化氢酶和血红蛋白通过连接肽连接构成；所述乙醇酸氧化酶突变体GOmut是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第267位蛋氨酸突变为苏氨酸，第362位丝氨酸突变为甘氨酸；重组融合酶为VsHGB-GSG-GOmut-GGGGS-CAT。
3.一种权利要求1或2所述重组融合酶在乙醛酸甲酯合成中的应用，其特征在于所述应用为：将含融合酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎、离心分离所得的上清液即为粗酶液，以粗酶液作为生物催化剂，加入底物乙醇酸甲酯，以pH 6.0~10.0、50mM缓冲液为反应介质构成转化体系，在5~40℃、纯氧速率在0~3 L/h条件下进行反应，反应完毕后，反应液先经乙酸乙酯萃取，萃取液再通过减压蒸馏去除乙酸乙酯获得乙醛酸甲酯。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中，底物加入终浓度为50~400mM，粗酶液加入量以总蛋白含量计终浓度为1-5 g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含融合酶编码基因的工程菌接种至含100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12 h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.5~0.7，再加入终浓度为0.2 mM的IPTG，25℃诱导12 h，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和10000 rpm下离心10 min，弃去上清液，收集湿菌体；所述LB培养基组成为：5 g/L酵母粉，10 g/L氯化钠，10 g/L蛋白胨，pH 7.0~7.5。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述上清液按如下方法制备：将湿菌体以1 g：20 mL的比例溶解到50 mM、pH 8.0的Tris-HCl中，然后再使用超声破碎仪破碎细胞，以工作2 s，间隔6 s，功率125 W的程序破碎15 min，在4℃和8000 rpm下离心10 min，收集上清液，即为粗酶液。
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