CN113430181A - 一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因，该细菌漆酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码基因如SEQIDNO.2所示，利用宏基因组分箱技术组装获得一株完整度为99.73％且污染率为0的未培养Paludibacteraceae菌科UBA1181菌属细菌的基因组，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因，通过基因工程技术制备得到细菌漆酶Lacc1。该该细菌漆酶与真菌来源的漆酶相比，具有良好的热稳定性和pH稳定性。

Description

一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因

技术领域

本发明属于酶基因工程技术领域，涉及一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因，通过宏基因组测序分析技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株。

背景技术

漆酶(EC 1.10.3.2)属于多铜氧化酶类，其能够催化多种类型的酚类及非酚类化合物的氧化，并且以分子氧作为电子受体，最终生成水，不会生成其他有害的副产物，是一类绿色、环保、环境友好的生物催化剂。漆酶已经广泛应用在制浆造纸、药物合成、污水处理、食品能源等领域。

漆酶分布广泛，目前在细菌、真菌和动植物等体内都被发现过。对比动植物来源漆酶，微生物漆酶来源更加丰富。但是，真菌来源漆酶在工业生产中遇到极端环境如高温和碱性条件下其活性很难保持，其应用受限。细菌来源漆酶底物广泛、pH稳定性和热稳定性强、以及耐受碱性环境等特点引起了研究人员的普遍关注。

细菌漆酶基因的获得、克隆和表达，首先要通过传统的微生物纯培养技术进行菌株的分离和纯化，但99％以上的不可培养微生物是无法分离获得的，尤其是肠道环境的厌氧微生物可培养性更低，因此通过分离培养细菌筛选新型漆酶的传统方法限制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学结合高通测序技术避开了微生物分离培养问题，能在短时间内发现大量功能酶基因，提高了酶功能基因的克隆效率，为寻找和发现新的漆酶基因提供了新的研究策略。

发明内容

本发明的目的在于克服和避免漆酶在工业生产中不足，并提供一种来源于亚洲象肠道宏基因组细菌的新型漆酶编码基因及表达该新型细菌漆酶基因的工程菌株。

本发明中，新型漆酶的编码基因来源于亚洲象肠道宏基因组，经分箱技术组装获得一株完整度为99.73％且污染率为0的未培养Paludibacteraceae菌科UBA1181菌属细菌的基因组，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因(IPR003730和PF02578.16)，对该新型漆酶编码基因进行克隆，并在大肠杆菌表达系统进行表达，获得了大肠杆菌高稳定性漆酶重组菌株。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶Lacc1，所述细菌漆酶Lacc1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述细菌漆酶Lacc1以底物2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)测定新型漆酶Lacc1酶学性质时，最佳作用温度为75℃，最适作用pH为5.5。

以底物ABTS测定该新型漆酶Lacc1的pH稳定性和热稳定性，结果显示：在70℃下，pH 5～6范围内具有良好稳定性，作为鲜有报道的亚洲象肠道宏基因组来源的新型漆酶Lacc1，与真菌来源的漆酶相比，其pH稳定性和温度稳定性更好。

所述细菌漆酶的编码基因lacc1也在本发明的保护范围制备，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的另一方面，将本发明的细菌漆酶编码基因lacc1插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。提供了一种包含所述细菌漆酶基因lacc1的重组载体。

作为本发明的一个优选的实施方案，将本发明的细菌漆酶编码基因lacc1和表达载体pET28a(+)相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pET28a-laac1。

更优选的，用于表达所述细菌漆酶Lacc1的宿主细胞为E.coli DH5α。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含所述细菌漆酶编码基因lacc1的重组菌株。

优选的所述重组菌株为大肠杆菌，更优选的为重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-Lacc1。

在本发明的另一方面，提供了上述新型细菌漆酶Lacc1的制备方法，包括以下步骤：

1)以亚洲象肠道宏基因组DNA为模板，并根据宏基因组分析获得的与NR数据库漆酶比对最高仅有45％一致性的未培养细菌漆酶基因，分析其保守序列，设计本发明的漆酶基因的扩增引物P1和P2，通过PCR扩增获得目的漆酶编码基因lacc1；

2)漆酶编码基因lacc1和表达载体pET28a(+)经EcoRI和HindIII双酶切，T4连接酶连接后转化至克隆宿主E.coli DH5α，经验证正确后，从而获得重组质粒；

3)将获得的重组质粒转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)并成功表达，获得产高稳定性新型漆酶Lacc1的重组菌株；

4)通过发酵工艺优化获得高产高稳定性新型漆酶Lacc1。

其中，

上游引物P1：CAATTCATGATCGCTGATCGAAGAACG；

下游引物P2：AAGCTTTTAATAATTGCATATTCC。

在本发明的另一方面，提供了所述细菌漆酶Lacc1在孔雀石绿和结晶紫废水脱色中的应用。

在漆酶Lacc1最适反应条件下，对孔雀石绿和结晶紫模拟废水分别脱色35min，脱色率分别达到59.5％和54.5％。

本发明的有益效果为：

本发明通过宏基因组分箱技术组装获得一株完整度为99.73％且污染率为0的未培养Paludibacteraceae菌科UBA1181菌属细菌的基因组，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因，通过基因工程技术制备得到细菌漆酶Lacc1。该细菌漆酶Lacc1与真菌来源的漆酶相比，在70℃下，pH 5～6范围内具有良好稳定性，其pH稳定性和温度稳定性更好。

附图说明

图1是本发明新型漆酶编码基因的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图；

图2是本发明重组质粒pET28a-lacc1酶切琼脂糖凝胶电泳图；

图3是本发明新型漆酶Lacc1最适作用温度曲线；

图4是本发明新型漆酶Lacc1最适作用pH曲线；

图5是本发明新型漆酶Lacc1对孔雀石绿和结晶紫染料废水的脱色率。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所使用的亚洲象肠道宏基因组测序原始数据己存入中国科学院大数据中心基因组序列档案库，登录号为CRA003369。

实施例1：亚洲象肠道宏基因组未培养细菌新型漆酶基因

1、新型漆酶编码基因来源于本实验室保存的亚洲象新鲜粪便宏基因组，利用试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit)提取其宏基因组DNA，其中亚洲象新鲜粪便宏基因组DNA的提取步骤如下：

1)称取亚洲象粪便约0.2g至灭菌离心管中；

2)加入1.4mL buffer ASL，连续涡旋数分钟至充分混匀，70℃温育5min后再涡旋混匀15s；

3)20,000g离心1min去除粪便杂质，取上清至新的离心管；

4)加入1片inhibitEX Tablet后立即混匀约1min，然后室温放置1min，使抑制剂吸附到inhibitEX基质上，20,000g离心3min；

5)取上清至新的离心管，同4)再离心1次；

6)吸取上清至已加入15μL proteinase K的新离心管中，加入200μL buffer AL，充分混匀后70℃温育10min；

7)加入200μL无水乙醇，充分混匀后转移至QIAamp吸附柱中，20,000g离心1min(如果液体没有全部通过柱子，在重复离心1次)；

8)分别依次用500μL的buffer AW1和AW2洗柱，同7)离心3min后，将柱子转至新的收集管；

9)在吸附柱中央加入适量bufferAE，室温放置1min后，同上离心1min进行洗脱，所得的宏基因组DNA可用于下游的分子生物学实验或-20℃保存备用。

2、经宏基因组测序和分箱技术手段，组装获得一株完整度为99.73％且污染率为0的未培养Paludibacteraceae菌科UBA1181菌属细菌的基因组，经InterPro和Pfam数据库注释含一条多铜多酚氧化还原酶漆酶基因(IPR003730和PF02578.16)，将该漆酶的氨基酸序列进行NR数据库blast，结果显示，与NR数据库漆酶的最高氨基酸一致性约为45％，分析该新型漆酶的保守序列，设计本发明的漆酶编码基因的扩增引物如下：

上游引物P1：

5’-CAATTCATGATCGCTGATCGAAGAACG-3’；

下游引物P2：

5’-AAGCTTTTAATAATTGCATATTCC-3’。

上下游引物P1和P2是用来扩增在大肠杆菌表达的漆酶目的基因，上下游引物分别引入限制性酶切位点EcoRI和HindIII。

扩增模板为亚洲象肠道宏基因组DNA，其PCR扩增反应体系为：EX Taq 1.25μL，10XBuffer 10μL，dNTP mix 5μL，P1和P2各2.5μL，DNA5μL，ddH₂073.75μL，总体积100μL。

扩增反应条件为：94℃，5min；94℃，30s；55～61℃，30s；72℃，1min(2～4，30个循环)；72℃，10min；4℃，10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证，获得771bp的条带(图1)，PCR产物经胶回收后，再进行双酶切并纯化回收，获得本发明的亚洲象肠道宏基因组细菌新型漆酶编码基因lacc1，见序列SEQ ID NO.2。

实施例2亚洲象肠道宏基因组来源的新型细菌漆酶重组质粒的构建

1)质粒pET28a(+)用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，再用T4连接酶将酶切后纯化产物与目的基因酶切后纯化产物在16℃下过夜连接，连接产物化学转化至E.coli DH5α。

2)经菌落PCR鉴定、双酶切鉴定(图2)和测序正确后，获得重组质粒pET28a-lacc1；

3)含有正确重组质粒pET28a-lacc1的克隆菌株E.coli DH5α/pET28a-lacc1加20％甘油于-80℃保存。

实施例3大肠杆菌高稳定性新型漆酶重组菌的构建

1)向E.coli BL21(DE3)感受态细胞加入10μL成功构建的重组质粒pET28a-lacc1，轻柔混匀，冰浴30min；

2)将冰浴后混合液置于42℃分子水浴锅中热激1.5min，冰浴5～10min；

3)在无菌工作台中加入500μL LB液体培养基(无抗生素)，放到恒温高速培养摇床中37℃180rmp培养1h，在7000rmp下离心3min；

4)移至无菌工作台中留取100～200μL悬浮菌体，吸取全部菌体涂于含有Kan抗生素的LB固体培养皿中，置于37℃恒温培养箱中培养16h。

5)经菌落PCR鉴定和测序正确后，确定获得表达lacc1的大肠杆菌重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-lacc1。

实施例4漆酶酶活的测定

酶活力单位(U)：1min内氧化1μmol ABTS所需的漆酶量。

预先将480μL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和100μL的3mmol/L的ABTS充分混匀，并于50℃条件下水浴5min。迅速加入20μL的漆酶Lacc1溶液。在420nm波长下读取OD值。

漆酶酶活的计算公式如下：

酶活(U/L)＝(Δ_OD×V₁×n)/(Δ_t×V₂×ε×10^-6)

式中，Δ_OD为起始和结束时的吸光度差值；V₁为反应体系的总体积(mL)；n为酶液的稀释倍数；Δ_t为反应时间(min)；V₂为体系中酶液的体积(mL)；ε为摩尔消化系数(L/(mol·cm))。

漆酶的最适pH：在50℃下，将反应体系放置在不同pH(2.0～11.0)的缓冲液中，测定酶活，以最高酶活为100％，比较获得最适反应pH。

最适温度：在最适反应pH条件下，将反应体系分别在不同的温度(35、45、55、65、75、85、95℃)条件下测酶活，以最高酶活为100％，得到漆酶的最适反应温度。

pH稳定性：将酶液放置在不同pH的缓冲液中，4℃付宇5h，以最高酶活为100％，测定其剩余酶活。

热稳定性测定：在最适反应pH条件下，将漆酶置于不同的温度梯度(30～90℃)条件下孵育2h，以最高酶活为100％，测定Lacc1漆酶的剩余酶活。

通过上述方法测定新型漆酶的酶学性质，该新型漆酶酶学性质如下：

以ABTS为底物测定新型漆酶酶学性质时，最适温度为75℃(图3)，最适pH为5.5(图4)；

以ABTS为底物测定该新型漆酶的pH稳定性和热稳定性，结果显示：该新型细菌漆酶在65℃下，pH 5.5～6.5的范围内稳定性良好。在4℃，pH＝5.5下保存4天时，残余酶活达到300％左右，在4℃，pH＝6.5下保存4天时，残余酶活达到200％左右；在4℃，pH＝5.5下保存10天时，残余酶活达到200％左右，在4℃，pH＝6.5下保存10天时，残余酶活达到200％左右(以上酶活均是在75℃，pH5.5条件下测定，且以初始酶活作为100％)。

实施例5新型漆酶在大肠杆菌重组菌株中的表达及制备

1)挑取大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-lacc1单菌落接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养；

2)将步骤1)培养所得种子接种以0.1％的量到LB液体培养基中，37℃、180r/min震荡培养约3～4h至OD₆₀₀达到0.6～1.0；

3)向步骤2)的培养基中加入IPTG(终浓度为0.7mmol/L)，28℃、160r/min震荡诱导表达15h；

4)诱导表达结束后，8000r/min离心6min,收集菌体，用Tris-H Cl(pH7.0)缓冲液重悬菌体，再冰水浴中超声波破碎细胞(300W，超声开5s，超声关7s)，超声破碎的细胞液体经冷冻离心机4℃、12000r/min离心10min，重复2～3次(无杂细胞碎片)收集上清，即可获得高稳定性新型漆酶粗酶液。

5)以ABTS为底物测定新型漆酶粗酶液酶活力(pH 5.5、75℃条件下)，大肠杆菌表达新型漆酶重组菌株发酵后漆酶酶活可达到310U/mL，然后采用分级盐析法沉淀新型漆酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型漆酶纯酶酶粉。

实施例6新型漆酶Lacc1对染料的脱色处理及脱色率的计算

1)对孔雀石绿废水的脱色处理及脱色率的计算

配制初始浓度为20mg/L孔雀石绿模拟废水，在波长618nm处测定漆酶对孔雀石绿催化脱色前后的吸光度，根据OD₆₁₈的变化计算漆酶对孔雀石绿模拟废水的脱色作用。反应总体积为4mL，其中20mg/L孔雀石绿溶液500μL，pH为5.5的柠檬酸缓冲液3mL，500μL粗酶液。以蒸馏水代替孔雀石绿溶液作为空白对照，在酶的最适温度下测定漆酶对孔雀石绿染料的脱色作用，每隔5min取一次样品，测定OD₆₁₈的变化，共测35min。按公式计算脱色率。脱色率计算公式：D＝(1-OD_t/OD₀)×100％,式中：OD_t为反应t时刻的吸光度值；OD₀为初始时刻的吸光度值。

2)对结晶紫废水的脱色处理及脱色率的计算

配制初始浓度为20mg/L结晶紫模拟废水，在波长557nm处测定漆酶催化结晶紫废水的脱色前后的吸光度值，根据OD₅₅₇值的变化计算漆酶对结晶紫的脱色效率。反应体系、检测方法、脱色率计算等方法同孔雀石绿模拟废水脱色方法。

在漆酶Lacc1最适反应条件下，对孔雀石绿和结晶紫模拟废水分别脱色35min，脱色率分别达到59.5％和54.5％(图5)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 256

<212> PRT

<213> 漆酶(Lacc1)

<400> 1

Met Ile Ala Asp Arg Arg Thr His Lys Asn Leu Thr Thr Phe Phe Ser

1 5 10 15

Asp Arg Glu Gly Gly Val Ser Gln Gly Asp Tyr Ala Ser Leu Asn Leu

20 25 30

Gly Tyr Phe Ser Gly Asp Glu Arg Ser Ala Val Asn Glu Asn Arg Arg

35 40 45

Arg Leu Cys Glu Val Leu Ser Ile Pro Ala Ser His Leu Val Val Pro

50 55 60

Asn Glu Val His Gly Cys Gln Val Met Val Val Asp Glu Ala Leu Leu

65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Gln Glu Arg Asp Glu Val Val Lys Cys Asp Gly Leu

85 90 95

Val Thr Thr Met Arg Gly Val Cys Leu Gly Val Thr Val Ala Asp Cys

100 105 110

Val Pro Val Leu Leu Tyr Asp Glu Ala Gly Asp Val Ile Ala Ala Ala

115 120 125

His Ala Gly Trp Lys Gly Ile Val Ser Gly Val Leu Arg Glu Thr Leu

130 135 140

Ala Thr Met Glu Arg Leu Gly Ser Arg Leu Glu Asn Ile His Ala Glu

145 150 155 160

Val Trp Pro Ser Ile Ser Cys Gly Lys Phe Glu Val Gly Glu Glu Val

165 170 175

Val Glu Arg Phe Ala Glu Val Phe Pro Ala Glu Glu Leu Ser Gln Phe

180 185 190

Val Val Arg Glu Asp Tyr Ala Lys Pro His Ile Asn Leu Arg Glu Ala

195 200 205

Val Arg Leu Gln Leu Ile Ser Leu Gly Leu Ser Pro Asp His Ile Trp

210 215 220

Leu His Gly Asp Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Arg Tyr Phe Ser Ala Arg

225 230 235 240

Arg Asp Gly Tyr Arg Ser Gly Arg Met Val Ala Gly Ile Cys Asn Tyr

245 250 255

<210> 2

<211> 771

<212> DNA

<213> 漆酶基因(lacc1)

<400> 2

atgatcgctg atcgaagaac gcataagaat ttaactactt ttttttcaga tagggaggga 60

ggcgtgagtc aaggagacta tgcctccctt aatcttggtt atttctccgg tgatgagcgc 120

tcggctgtga atgaaaaccg taggcgtctg tgtgaggtct tgtccatacc tgcgagtcat 180

ttggtggtgc ccaatgaggt gcatgggtgc caggtgatgg tggtggatga ggcgctgttg 240

aggctctctt ctcaagagcg ggacgaggtg gtgaagtgcg atggcttggt gacgacgatg 300

cgtggcgtct gtctgggcgt gacggtggct gactgtgtcc cagtcctcct ctatgatgag 360

gcaggcgatg tgattgcggc tgcccatgcg gggtggaagg gaattgtctc tggcgtgctt 420

cgtgagacgt tggccacgat ggagcgactg ggtagtcgtt tggaaaatat ccatgcggag 480

gtttggccct ccatctcttg cggaaaattc gaggtgggag aggaggtggt ggagcgtttt 540

gcggaggtgt ttcctgcgga agagctctcc caattcgttg tccgagaaga ttatgccaaa 600

ccccatatca atctccgtga ggcggttcgt ttgcaactca tctccttagg tctctcccca 660

gaccacattt ggctccatgg tgattgcacc tattccgatt cgcgctattt ctccgcacgc 720

agggatggat accggtcggg aaggatggtg gcgggaatat gcaattatta a 771

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caattcatga tcgctgatcg aagaacg 27

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcttttaa taattgcata ttcc 24

Claims (6)

1.一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶，其特征在于，所述细菌漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述细菌漆酶的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组质粒，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因。

4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因。

5.权利要求1所述细菌漆酶的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以亚洲象肠道宏基因组DNA为模板，并根据宏基因组分析获得的与NR数据库漆酶比对最高仅有45％一致性的未培养细菌漆酶基因，分析其保守序列，设计本发明的漆酶基因的扩增引物P1和P2，通过PCR扩增获得目的漆酶的编码基因；

上游引物P1：CAATTCATGATCGCTGATCGAAGAACG；

下游引物P2：AAGCTTTTAATAATTGCATATTCC；

2)漆酶编码基因和表达载体pET28a(+)经EcoRI和HindIII双酶切，T4连接酶连接后转化至克隆宿主E.coliDH5α，经验证正确后，从而获得重组质粒；

3)将获得的重组质粒转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)并成功表达，获得产高稳定性新型漆酶的重组菌株；

4)通过发酵工艺优化获得高产高稳定性新型漆酶。

6.权利要求1所述细菌漆酶在孔雀石绿和结晶紫废水脱色中的应用。

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