CN103298929A

CN103298929A - 漆酶及其用途

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Publication number: CN103298929A
Application number: CN2011800642328A
Authority: CN
Inventors: 让-保罗·莱奥内蒂; 让-米歇尔·克拉弗里; 尼古拉斯·沙博
Original assignee: Deinove SA
Current assignee: Deinove SA
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2013-09-11
Also published as: SG190162A1; EP2638151A1; US20130309730A1; EA201390673A1; EP2638151B1; US9068161B2; AU2011328212A2; DK2638151T3; JP2014504151A; AU2011328212A1; CA2816393A1; WO2012062768A1

Abstract

本发明涉及新型酶及其用途。本发明还涉及制备这样的酶、编码核酸分子、重组细胞的方法以及从这样的材料改性生物质的方法。本发明特别适于降解生物质和/或改善生物质降解。本发明还涉及本发明的酶用于生产生物能（如生物乙醇）、以及在化学、造纸工业、纺织工业和饮料工业领域中的各种应用。

Description

漆酶及其用途

技术领域

本发明涉及新型酶及其用途。本发明还涉及生产这样的酶、编码核酸分子、重组细胞的方法和从这样的材料改性生物质的方法。本发明特别适于降解生物质和/或改善生物质降解。本发明还涉及本发明的酶的各种应用，用于生产生物能（如生物乙醇），以及应用于化学、造纸工业、纺织工业和饮料工业领域。

背景技术

在本领域中已提出使用微生物来进行生物质改性以生产生物能产品或代谢产物。这样的过程，理想地，将需要两种主要类型的活性：(i)降解活性，以将生物质转化为可发酵糖和(ii)发酵活性，以将所述糖转化为生物能产品或其他有价值的代谢产物。迄今为止，研究工作主要针对具有催化发酵步骤的能力的微生物的鉴别。

关于通过利用微生物的发酵来生产乙醇的专著在美国能源部和国家再生能源实验室的资助下由J.R.Hettenhaus以名称"Ethanol Fermentation Strains（乙醇发酵菌株）"出版（1998年12月16日）。在该文献中，其概述了由研究中的参与者作出的贡献，其指出：

–仅类似于酿酒酵母菌(Saccharomyces)、单胞发酵菌(Zymomonas)和大肠杆菌（E.coli）的微生物可以用于现有设备；

–就眼前来说，增加木糖和阿拉伯糖发酵可能是主要目标，然而其被确定对增加其他类型的木糖或寡聚物类型的转化效率几乎没有益处；

–就长期来说，关于更高操作温度以及组合酶生产、糖化和水解的步骤，可以获得利益。

当前的工业过程仅允许微生物的培养和生长用于在30°C区域内的温度下发酵和提取乙醇，这是由于所使用的微生物（酵母菌）的脆弱性导致。它们还必需较大的生物能成本以在发酵后浓缩乙醇，因为目前用于这种发酵的酵母菌不能承受高于100g/l的乙醇浓度。另外，实践中酵母菌的发酵仅使用葡糖类型的C6糖。

已经试验了生物质使用微生物的转化(Blumer-Schuette et al.,2008,Extremely thermophilic microorganisms for biomass conversion:status andprospects,Curr Opinion Biotechnol19,pp.210-217;Perez et al.,2002,IntMicrobiol5,pp53-63)。然而，如在Mosier等人(Bioresource Technology96(2005)673–686)中报道的，需要木质纤维素生物质的预处理以改变纤维质生物质的结构，从而使纤维素对于将碳水化合物聚合物转化为可发酵糖类的酶更可接近。

从未处理（即，淀粉，木质纤维素）生物质工业和有效生产可发酵糖类（例如单体糖类）仍然是难题。

已经提出各种方法来开发生物质如热化学方法、酸解或酶水解。Sun H等人(Appl Biochem Biotechnol.2010Feb;160(4):988-1003)讨论了酶用于降解淀粉的用途。Polizeli ML等人以及Collin T等人(Appl Microbiol Biotechnol.2005Jun;67(5):577-591;FEMS Microbiol Rev.2005Jan;29(1):3-23)综述了酶用于降解木聚糖的用途。Wilson DB等人(Curr Opin Biotechnol.2009Jun;20(3):295-299)讨论了非异常球菌(Deinococcus)酶用于生物燃料应用的纤维素降解的用途。在木质素的情况下，仅已考虑了非常少的暗示使用有机溶剂和焚化的方法。

发明内容

本发明公开了来自异常球菌的漆酶的鉴别和表征。漆酶是具有降解木质素（生物质最复杂组分）的稀有能力的酶。

本发明首次报道了来自异常球菌(Deinococcus)的涉及木质素加工的功能酶的鉴别和分离。

本发明因此涉及所述酶、其制备和用途。本发明还涉及编码该酶的核酸、载体、重组细胞和它们的用途。本发明进一步涉及用于改性生物质和/或从生物质或其衍生物生产有价值产品的组合物和方法。

本发明的一个目的因此涉及来源于异常球菌或相关细菌的漆酶。

本发明的另一个目的是一种酶，其中所述酶来源于异常球菌或相关细菌并且具有降解或水解木质素的能力。

本发明的另一个目的是一种酶，其中所述酶来源于异常球菌或相关细节并且涉及生物燃料生产。

本发明的另一个目的是一种酶，其中所述酶来源于异常球菌或相关细节并且具有分解木质素聚合物的能力。

本发明的酶优选在30°C以上，甚至更优选40°C以上的温度下有活性。

此外，本发明的酶优选在3.5至9的pH范围，更优选的6至9的pH范围有活性。

本发明最优选的酶是异常球菌起源。

本发明的另一个目的是包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列的全部或部分的多肽。

本发明的另一个目的是包含如上定义的至少一种酶的组合物。所述组合物可以包含另外的酶，优选在能量代谢中有活性。所述组合物可以例如用作催化剂或发酵剂。

在一个特别实施方式中，本发明涉及一种包含本发明的漆酶和至少一种涉及生物质改性的另外的酶的组合物，该另外的酶优选选自木聚糖酶、淀粉酶、葡糖苷酶、纤维素酶,果胶酶、酯酶、阿魏酰酯酶(feruloyl esterase)、乙酰木聚糖酯酶和葡糖醛酸糖苷酶。

在另一个特定实施方式中，本发明涉及包含本发明的漆酶和至少一种涉及糖发酵，特殊通过发酵的乙醇生产的另外的酶的组合物。这样的另外的酶的实例包括乙醛脱氢酶、醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶。

本发明的另一个目的是一种编码如上定义的酶的核酸。

本发明的另一个目的是包含如上定义的核酸的载体。

本发明还涉及一种含有至少一种如上定义的核酸或载体的重组细胞，优选含有至少一种如上定义的核酸或载体的重组细菌。

本发明还涉及一种异常球菌或相关细菌，其含有至少一种如上定义的核酸或载体。本发明实际上允许仅利用异常球菌DNA来改造具有改善的加工木质纤维素生物质能力的异常球菌菌株。

本发明还涉及一种本发明的细胞的提取物。这样的提取物优选表现出所表达酶的活性。

本发明还涉及如上定义的酶、核酸、载体、细胞或细胞提取物的用途，其用于改性生物质和/或生产代谢产物。

本发明还涉及一种用于改性生物质的方法，包括将这样的生物质暴露于如上定义的酶、核酸、载体、细胞或细胞提取物。本发明还涉及一种用于改性生物质的方法，其中所述生物质还包含天然或合成介体。

本发明还涉及一种用于增加生物质改性的方法，所述方法包括向生物质中添加如上定义的酶、核酸、载体、细胞或细胞提取物。本发明还涉及一种用于生产代谢产物或生物能产品的方法，包括将碳源暴露于如上定义的酶、核酸、载体、细胞或细胞提取物。本发明还涉及一种用于生产代谢产物或生物能产品的方法，其中所述碳源还包含天然或合成介体。

本发明还涉及一种用于改性木质素的方法，包括将木质素或含木质素材料暴露于如上定义的酶、核酸、载体、细胞或细胞提取物。本发明还涉及一种洗衣或洗碟组合物，其中所述组合物包含如上定义的酶、核酸、载体或细胞。

本发明还涉及一种用于木材去木质化和/或纸浆漂白的方法，包括将木质纸浆或纸张暴露于如上定义的酶、核酸、载体或细胞。本发明还涉及一种用于木材去木质化和/或纸浆漂白的方法，其中所述木质纸浆或纸张还包含天然或合成介体。

具体实施方式

本发明总体上涉及来源于异常球菌或相关细菌菌株的有价值酶，其参与能量代谢，更优选参与生物质改性。这些酶，其优选在30°C，甚至更优选在40°C以上，并且在3.5至9的pH范围，更优选在6至9的pH范围内(例如在pH8)有活性，可以就这样单独使用或组合使用，以引起或改善酶反应。这些酶或它们的编码核酸，也可以用来生成改进的重组细菌，其可以用来引起或改善生物质转化。这样的细菌可以组合不同酶活性或生物学性能。

本公开内容通过参考以下定义将最佳地被理解：

在本发明的上下文中，关于酶的术语“来源于异常球菌或相关细菌”表示酶已经分离自这样的细菌，或者该酶包含分离、纯化或表征自这样的细菌的酶的氨基酸序列的所有或生物学活性部分。术语“来源于异常球菌或相关细菌”进一步包括从在异常球菌或相关细菌中鉴别的核酸或氨基酸序列合成的任何重组、合成和/或任选修饰的酶（例如化学、酶、物理改性的）。

“异常球菌”是指异常球菌属的任何细菌种。异常球菌包括但不限于D.cellulolysiticus、耐辐射异常球菌(D.radiodurans),蛋白弧异常球菌(D.proteolyticus)、抗辐射异常球菌（D.radiopugnans）、短杆状耐辐射菌(D.radiophilus)、荧光抗辐射异常球菌(D.grandis)、虎刺菌(D.indicus)、冻僵奇异球菌（D.frigens）、岩黄连菌（D.saxicola）、马里科帕部落奇异球菌（D.maricopensis）、大理石奇异球菌（D.marmoris）、沙漠奇异球菌（D.deserti）、中度嗜热菌（D.geothermalis）、默氏菌（D.murrayi）、恩理思菌（D.aerius）、网文菌（D.aerolatus）、芽孢杆菌（D.aerophilus）、雅瑟留菌（D.aetherius）、D.alpinitundrae、高地芽孢杆（D.altitudinis）、D.apachensis、水生菌（D.aquaticus）、水产菌（D.aquatilis）、D.aquiradiocola、水活菌（D.aquivivus）、D.caeni、D.claudionis、D.ficus、D.gobiensis、D.hohokamensis、D.hopiensis、D.misasensis、D.navajonensis、D.papagonensis、D.peraridilitoris、D.pimensis、D.piscis、D.radiomollis、D.roseus、D.sonorensis、乌鲁木齐异常球菌（D.wulumuqiensis）、D.xibeiensis、新疆鳋菌(D.xinjiangensis)、D.yavapaiensis和云微所异常球菌（D.yunweiensis）。

与异常球菌“相关的”细菌或细菌菌株是指这样的细菌，其(i)含有16SrDNA，其在使用引物GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA(SEQ ID NO:8)和GGTATCTACGCATTCCACCGCTA(SEQ ID NO:9)修饰后，产生约158个碱基对的片段和/或(ii)抵抗4mJ/cm²的UV处理。在一个特定实施方式中，异常球菌相关的细菌是具有与异常球菌16S rDNA序列在序列上至少70%，优选至少80%相同的16S rDNA分子的细菌。

与酶或核酸相关，术语“纯化的”或“分离的”表示该酶或核酸不是在其天然培养基中或处于天然形式。因此术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的自然环境移出的酶或核酸。例如，分离的酶通常缺乏通常与其相关或通常与其混合或在溶液中的细胞的至少一些蛋白或其他组分。分离的酶包括细胞溶解产物中含有的天然产生的所述酶；纯化或部分纯化形式的酶，重组酶，由细菌表达或分泌的酶，以及在异源宿主细胞或培养基中的酶。与核酸相关，术语分离或纯化的表示例如核酸不是出于其天然基因组环境中（例如在载体中，作为表达盒，连接于启动子，或人工引入到异源宿主细胞中）。

术语“能量代谢”是指有助于在细胞中生成或存储能量产物或代谢产物的所有生物学途径和反应。这些包括但不限于诸如生物质加工的途径和反应，例如生物质的聚合物降解成可发酵糖类，以使糖发酵成有价值的代谢产物或产物。参与生物质加工的酶包括，更优选地，改性或降解或水解材料如木质素、淀粉、木聚糖或纤维素的酶；或有助于使用丙酮酸盐(酯)以在细胞中产生代谢产物或能量产品的酶。

根据本发明的术语“生物质”通常是指任何生物材料。特别是，术语生物质包括生物起源的未加工材料，包括植物或动物生物质。生物质的实例包括但不限于林业产品，包括不适用于成材或纸张生产的成熟树木，纸浆，回收纸，有机废物，农业产品如草、稻草、作物和牲畜粪，以及水生产品如藻类和海藻。生物质的实例包括木头和来源于多种类型的植物的植物材料，包括紫芒、大麻、柳枝稷(switchgrass)、糖萝卜、小麦、大麦、玉米、水稻、大豆、芸台、油菜籽、高粱、甘蔗、花生、棉花、白羽扇豆，以及各种各样的树物种，范围为桉树至油椰、白杨、柳树。生物质的具体来源包括但不限于植物残余物、硬木或软木茎干、玉米棒子、稻草、草、叶、种子、纸等(参见例如Sun et al.,Bioresource Technology83(2002)1–11)。术语生物质还涵盖转化的生物质和二次生物质，其基本上含有水解的预处理生物质产品。在一个优选实施方式中，根据本发明的生物质包括任何木质纤维素材料，例如木质素、纤维素、半纤维素和/或木聚糖。

在本发明上下文中“改性”生物质包括其任何改性，包括生物质的转化、降解、水解、转化或加工。术语“改性”生物质通常涵盖这样的生物质的任何改性，其导致生产可发酵糖、单体糖、代谢产物、生物燃料和/或化学品，或任何其他有用的产物。改性还通常涵盖生物质的生物聚合物如木质素的水解或改性。

术语“可发酵糖”是指但不限于具有基本组成(CH20)n的碳水化合物。基于碳数量（例如3、4、5或6)，寡糖是三糖(即，甘油)、四糖、五塘(即，木糖)、六糖(即，葡萄糖)等。

淀粉是指由通过1-4和1-6糖苷键结合在一起的大量糖单元组成的碳水化合物。淀粉是通过许多植物和细菌积累的能量储存分子，并且淀粉分子将它们本身以半晶体颗粒排列在植物中。

木质素改性酶

本发明公开了涉及生物质加工的新型酶的分离和表征。更特别地，本发明提供新型酶，其在优选30°C或以上，通常在30至90°C之间，优选30至70°C之间的温度下，并且在3.5至9的pH范围，更优选在6至9的pH范围，例如在pH8，将生物质改性（或有助于改性）成可发酵糖。

本发明的酶催化或有助于催化木质素降解成可发酵糖并且代表分离自异常球菌的涉及木质素加工的第一种功能酶。由于它们的活性、结构和物化性能，这些酶代表用于工业生物质降解过程、处理环境污染物、解毒、生物能生产、合成化学、纸浆和造纸工业、纺织工业、洗衣粉、饮料工业以及化妆品和医学领域的新型高度有价值产品。

本发明的漆酶是具有降解木质素能力的多铜酶。所述多铜酶涉及各种生物过程如免疫性、有机体的形态形成，以及细胞壁的木质化。若干酶涉及木质素的降解。这些可以被分类为两个功能组：(i)漆酶和(ii)木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。漆酶负责降解过程的第一且关键步骤，即，破坏木质素聚合物的长链。此外，本发明的漆酶具有氧化酚类和非酚类木质素相关化合物的能力。本发明的漆酶可以直接或间接地作用于底物，例如借助于介体。这样的介体是可以被漆酶氧化由此生成自由基，其又氧化另一种底物的分子。介体的使用使得底物的氧化性转化具有更高的氧化还原电位。根据本发明的介体可以是各种漆酶天然或合成底物。它们可以包括例如酚类、苯胺、4-羟基苯甲酸、ABTS[2,2'-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]、1-羟基苯并三唑、4-羟基苄基醇等，例如如在Morozova et al.,2007中描述的。

在一个特定实施方式中，本发明的漆酶在天然或合成介体存在下表现出强或增强的活性。

更特别地，如在实验部分中所显示的，本发明的酶在宽范围的底物上是有活性的，如酚类、甲氧基酚类、邻二酚类和对二酚类、氨基酚类、多酚类、多胺类和木质素相关分子。本发明的酶优选包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列或其功能性变体的全部或活性部分。

SEQ ID NO:2和4的多肽已从木质纤维素分解异常球菌表征，并且SEQ ID NO:6的多肽已从马里科帕部落异常球菌表征。

多肽的“部分”表示所述多肽的任意片段，优选包含所述多肽的至少约10、15、20、25、40、50或甚至更多个优选60个连续氨基酸的片段。

多肽的“活性”部分更具体地是指提供或表现出整个多肽的酶促活性的该多肽的部分。活性部分可以例如提供底物特异性或亲和性，它可以含有酶促位点，或者它可以提供药动学性质。

根据本发明的“功能性变体”保留参照多肽的活性。它们通常还表现出与该参照多肽至少50%氨基酸序列同一性，甚至更优选地至少60%、70%、80%或90%序列同一性。序列同一性（同源性）程度可以利用任何计算机程序和相关参数确定，包括BLAST2.2.2或FASTA版本3.0t78，利用缺省参数。优选的功能性变体与参照序列具有至少90%的同一性水平，最优选至少92、95或97%的同一性水平。

在一个优选实施方式中，相比于参照多肽，功能性变体包含至多1至50、1至40、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10,或1至5改性（例如缺失、取代或插入）的氨基酸残基。

如果根据本发明的多肽表现出参考多肽的酶活性的至少20%，优选至少30%并且更优选至少50%，则它们定性为功能性的。多肽可以通过它们本身或者在融合至或与另一多肽组合时是功能性的。而且，本发明的多肽可以用来生成具有多种活性的融合或嵌合多肽。功能性多肽优选是具有水解或改性或破坏木质素的能力的多肽。功能性试验的另一个实例披露在实验部分中。

在一个优选实施方式中，本发明的酶是这样的多肽，其包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列或其片段，该片段包含其至少15个连续氨基酸残基或功能性变体，所述片段或变体具有漆酶活性。

本发明还涉及一种包含SEQ ID NO:2、4或6的全部或部分的多肽。

本发明的多肽可以通过重组技术生产，或当天然存在时它们可以分离或纯化自天然来源，或者它们可以人工制备。所述酶可以为可溶形式，或在固体相上。特别地，它们可以结合至细胞膜或脂囊泡，或结合至合成载体如玻璃、速率、聚合物、滤器、膜，例如为珠子、柱、板凳形式。

本发明的酶是多肽，其可以是天然存在的、重组的和/或合成，并且任选地修饰的（例如化学、酶促、物理地等）。这些酶优选为分离获纯化的形式。这些酶有利地在30°C或更高温度下起作用。本发明优选的酶可以在高于例如45°C的温度下使用。在另一实施方式中，本发明优选的酶在极高温度下有活性，例如在60°C至90°C的温度范围，更优选在70°C至90°C的温度范围有活性。它们在苛刻pH（例如3.5至9），优选在6至9的pH范围，更优选在pH7至pH9的范围，甚至更优选在pH8和接近pH8的区域下也是有活性的。本发明最优选的酶在70°C至90°C的温度范围和在pH7至pH9的碱性pH范围下是有活性的。这样的在碱性pH诱惑性的热稳定漆酶在木质素降解中特别有效。

本发明的酶可以表达、来源、分泌、分离或纯化自异常球菌或相关细菌。这些酶可以通过本领域本身已知的技术纯化，并且以常规技术储存。所述多肽可以进一步改性以改善例如它们的稳定性或活性。它们可以就这样、以纯化形式单独或组合地使用，以催化涉及未加工生物质转化为可发酵糖的酶促反应。它们可以用来补充生物转化为可发酵糖的生物过程。例如，它们可以添加到容纳微生物或酶的反应器中，以补充活性。在一个优选实施方式中，这些酶用来改造具有新型生物学活性的改善微生物。在其他特定实施方式中，本发明的酶可以用来生产生物能（如生物乙醇）、工业生物质降解过程、生物能生产、处理环境污染物、解毒、合成化学、纸浆和造纸工业（制浆、纸张漂白）、纺织工业（例如污渍去除）、洗衣粉、饮料工业（例如在酿酒厂，处理白酒和果汁），以及化学品和医学领域，如以下所述。

核酸

本发明的另一个目的是一种编码如上定义的酶或多肽的核酸。本发明的另一个目的是包含如上定义的核酸的载体。

术语“核酸”指示任何类型的核酸，如DNA、RNA、PNA、DNA-样或RNA-样材料，其可以是重组、人工和/或合成起源，单链或双链，并且代表有义或反义链。该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸。该术语还包括具有合成主链的核酸样结构。

这样的核酸的具体实例是包含SEQ ID NO:1、3或5的序列的核酸。

SEQ ID NO:1包含编码SEQ ID NO:2的蛋白的核酸序列。SEQ ID NO:3包含编码SEQ ID NO:4的蛋白的核酸序列。SEQ ID NO:5包含编码SEQ IDNO:6的蛋白的核酸序列。

本发明的核酸可以为分离或纯化的形式，并且通过本领域本身已知的技术制备、分离和/或操作，例如cDNA文库的克隆和表达、扩增、酶促合成或重组技术。所述核酸也可以通过已知的化学合成技术体外合成，如在例如Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25:3440-3444中描述的。

本发明还包括这样的核酸，其在严格条件下杂交于编码如上定义的酶的核酸。优选地，这样的严格条件包括在2X SSC/0.1%SDS中在约42°C将杂交滤器温育约2.5小时，培养基在65°C在1X SSC/0.1%SDS中洗涤该滤器15分钟，四次。使用的方案描述在参考文献如Sambrook et al.(MolecularCloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor N.Y.(1988))and Ausubel(Current Protocols in Molecular Biology(1989))中。

本发明还包括编码本发明的多肽的核酸，其中所述核酸的序列或至少所述序列的一部分已使用优化密码子应用进行改造。

本发明的一个具体实施方式在于编码如上定义的酶的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:1、3或5的序列。

本发明的核酸可以包含另外的核苷酸序列，如调节区，即可用来引起或调节酶在所选宿主细胞或系统中的表达的启动子、增强子、沉默子、终止子等。

本发明的另一个方面在于一种载体，如包含如上定义的核酸的表达、克隆或报道载体。这样的载体可以选自质粒、重组病毒、噬菌体、附加体(episome)、人工染色体等。许多这样的载体可商购获得并且可以根据本领域本身已知的重组技术生产，如在手册如Sambrook et al.,Molecular Cloning(2ded.Cold Spring Harbor Press1989)中提出的方法，通过引用将其结合于此供参考。这样的质粒的一个具体实例例如描述于美国专利申请No.2003/0175977，其公开了一种来源于抗放射异常球菌(D.radiopugnans)的内源性质粒pUE30，其可以用作能够在异常球菌属细菌中自发地进行复制的载体，并且其可以用来构建还含有能够在大肠杆菌及其衍生物中自发进行复制，并且能够在异常球菌和大肠杆菌二者细菌中进行复制的质粒的穿梭载体。

本发明的另一方面在于一种用如上定义的至少一种核酸或载体转化或转染的宿主细胞。所述核酸（或载体）可以保留在染色体外或插入到基因组中，例如通过同源或异源重组。宿主细胞可以是能够被遗传改性并且优选培养的任何细胞。所述细胞可以是真核或原核的，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、真菌、细菌细胞等。典型的实例包括细菌（例如大肠杆菌，异常球菌等）。应理解，本发明不限于任何特点细胞类型，并且可以依照常识应用于所有种类的细胞。转化可以利用本领域本身已知的技术，如脂转染、电穿孔、磷酸钙沉淀等。

在另一个实施方式中，本发明包括含有至少一种以上定义的载体的重组细胞。本发明还涉及一种含有至少一种以上定义的核酸或载体的重组细胞。本发明还涉及一种含有至少一种如上定义的核酸和载体的异常球菌。本发明实际上允许遗传改善异常球菌菌株以仅在使用异常球菌DNA下具有改善的加工淀粉和木质纤维生物质的能力。

使用的方法

本发明提供将本发明的酶用于各种工业、农业、化学、生物技术和医学领域的方法。实际上，由于它们的高催化效率和宽底物特异性，本发明的漆酶相比于其他已知的化学和微生物催化剂是显著更有利的。本发明的漆酶可以例如用于生物质加工、脱木质化和纸浆漂白、生物燃料生产、生物除污、纺织工业、饮料工业、制药学、有机合成等。本发明的漆酶还可以在天然或合成介体存在下使用。

生物质改性和生物能生产

本发明的漆酶可以用于用来改性生物质或包含纤维素、半纤维和/或木质素的任何木质纤维素材料的方法中。在一个特定实施方式中，生物质是植物起源的含木质素的材料。本发明的酶可以例如应用于将生物质转化为可发酵糖和/或单糖和/或用于从生物质生产代谢产物和/或能量产品(例如生物燃料)。

本发明还涉及如上定义的酶、核酸、载体或细胞，或其组合的用途，其用于改性生物质和/或生产代谢产物或能量产品。

本发明还涉及一种用于改性生物质的方法，包括将这样的生物质暴露于如上定义的酶、核酸、载体或细胞，或暴露于它们的组合。本发明还涉及一种用于增加生物质改性的方法，所述方法包括向生物质中添加如上定义的酶、核酸、载体或细胞，或其组合。

本发明还涉及一种用于生产代谢产物或生物能产品的方法，包括将碳源暴露于如上定义的酶、核酸、载体或细胞，或其组合。所述方法可以进一步包括分离获回收所述代谢产物或产品的步骤。代谢产物的实例包括但不限于有机酸类和醇类诸如，优选地，甲酸盐(酯)、乳酸盐(酯)、乙酸盐(酯)、琥珀酸盐(酯)、富马酸盐(酯)、丙酮酸盐(酯)、丙醇、甘露醇和阿糖醇。能量产品的实例包括生物燃料诸如但不限于乙醇、丁醇或甲醇。本发明的一个特定目的涉及一种用于生产生物燃料(例如生物乙醇、生物甲醇、生物丙醇、生物丁醇等)的方法，包括将碳源例如生物质或其祖父和/或可发酵糖暴露于如上定义的酶、核酸、载体或细胞，或其组合，以及回收所产生的生物燃料。

本发明还涉及一种改善木质素的方法，包括将木质素或含木质素材料暴露于如上定义的酶、核酸、载体或细胞，或其组合。更特别地，本发明可以用来降解或水解木质素。

更通常地，本发明的酶也可以用来遗传改造具有利用更廉价碳源的能力的微生物。这样的微生物因此可以用来以更低成本和/或改善水平生产感兴趣的任何产品（例如蛋白质、RNA、代谢产物等）。在这方面，本发明还涉及一种用于生产重组蛋白的方法，包括在编码以上定义的至少一种酶或其组合的重组微生物中表达所述蛋白，以及回收所产生的蛋白质。这样的重组蛋白的实例包括药物蛋白，或工业酶如例如脂肪酶。

所述方法可以在允许改性生物质以生产生物能产品或代谢产物的任何合适条件或环境在进行。在这方面，所述方法可以在反应器、发酵罐、户外、存在适当营养物或添加剂（如果需要）下进行。所述方法通常在高于30°C的温度下并且在合适底物存在下进行。

生物除污

本发明还提供通过使用本发明的漆酶用于污染性污染物的生物除污的方法。本发明的漆酶事实上可以用来降解存在于来自若干工业过程的废物中的大量不需要的物质如污染物、副产物和有毒化合物。所述漆酶可以例如用于除去有毒化合物，其通过污染物的氧化性酶促偶联，导致产生不溶性复合结构。特别地，它们可以用于氧化存在于来自石油精炼、煤转化或来自有机化学品生产的废物（例如具有烯烃单元的塑料废物）中的酚类化合物。

本发明的漆酶也可以用来氧化有毒有机污染物如外源物、氯酚或多环芳族烃(PAH)等。漆酶在PAH降解中的作用特别重要，因为PAH是高度毒性的、致癌的、致突变的和顽抗的环境污染物，其具有生物累积的趋势。

此外，本发明的漆酶还可以用来降低合成杂环化合物例如土壤中的杀虫剂的浓度。所述漆酶还可以用来消除或减少从垃圾处理点、牲畜农场或造纸厂发出的气味。它们也可以通过除去有色酚类化合物而用来对染料厂流出物或来自橄榄油制造厂和造纸厂的废水脱色。

化学合成

本发明还提供通过使用本发明的漆酶作为有机合成中的生物催化剂来制备大量有机化合物的方法。

所述漆酶的聚合活性可以在各种聚合物合成中开发利用。因此，根据本发明，所述漆酶可以用来合成许多功能性有机化合物，包括具有特定机械/电/光性能的聚合物，织物燃料、化妆品颜料、香味剂和杀虫剂。例如，通过用本发明的漆酶聚合天然酚类，可以开发新的化妆品颜料或染发材料。漆酶还可以用于除臭剂、牙膏、漱口水或去污剂。

在一个特定实施方式中，本发明的漆酶用于半合成。

在绿色化学合成中，本发明的漆酶可以例如用于合成安全、环境友好的溶剂和无危险氧化剂。

医学应用

漆酶也可以用来合成药物重要的产品如抗癌药。本发明漆酶用于合成抗癌药的应用的实例包括例如katarantine和文多林(vindoline)的氧化偶联以生成长春碱，这尤其可用于治疗白血病。可以利用本发明的漆酶合成的另一种抗癌药是放线菌素(actinocin)。

本发明的漆酶还可以用于生产表现出例如抗生素、抗病毒、抗炎或抗氧化性能的其他新型药物化合物。

纸浆和造纸工业

涉及使用本发明的漆酶的其他方法包括在造纸工业中生产造纸纸浆的方法。特别地，本发明提供制浆方法和再制浆方法，通过利用本发明的漆酶。

木质制浆含有三种主要组分，即纤维素纤维，其对于造纸是期望的，以及木质素和半纤维素。制浆的目的是将纤维源的总体结构破碎成组成纤维。

在一个特定实施方式中，本发明的一种方法允许通过利用本发明的漆酶来分离和降解木质制浆中的木质素。用本发明的漆酶对木质制浆的处理例如可以提供考虑纤维素整体性的更温和且更清洁的木材去木质化策略。此外，这样的利用漆酶的氧去木质化方法可以用来代替污染性的常规氯基方法。

根据本发明的再制浆方法包括利用本发明的漆酶生产或再循环木质纤维素材料（如制浆、纸张或纸板）的方法。本发明还提供对印刷纸或再循环制浆进行脱墨和脱色的方法。

本发明还提供制浆或牛皮浆漂白的方法，其可以导致更高的制浆收率和节能。

纺织工业

本发明还提供利用本发明的漆酶处理织物和纺织品的方法。所述酶可以在纺织品编制期间或之后，或在脱浆阶段期间或另外的织物加工步骤期间施用。

在一个实施方式中，漆酶用来改善常规棉花漂白的白度。在一个特定实施方式中，漆酶用来漂白靛蓝染色的粗斜棉布织物至更浅色调。在另一个特定实施方式中，漆酶可以用于羊毛的抗收缩处理。

洗衣粉

在其他特定实施方式中，本发明的漆酶用于清洗例如在去污组合物中，例如碗碟清洗和衣服清洗。在一个特定实施方式中，本发明的漆酶用于污渍去除，例如用于除去茶渍或咖啡渍。

饮料

漆酶特别重要的应用涉及各种类型的饮料如果汁、啤酒、白酒等的稳定。特别地，漆酶用于白酒中的多酚消除，其必须是选择性的以避免白酒器官感觉特性的不期望改变。漆酶还用来改善饮料如啤酒的储存期。也可以进行用漆酶的酶处理以便增强茶基产品的颜色，以便形成用于食品成分的凝胶，或去除来自食品的酚类褐变产物。

已经提出对于来自某些真菌和细菌（不同于异常球菌）的漆酶的大量工业应用(Mustafa et al.,2005;Bajpai et al.,2006;Witayakran,2008;Osma et al,2010)。所有之前描述的漆酶应用对于根据本发明的漆酶的使用方法是可换位的。

本发明还涉及如本申请中定义的漆酶、核酸、载体或细胞，或其组合的用途，其用于所有上述应用。

如本申请中描述的，本发明的漆酶可以用于大量生物技术过程如工业流出物，例如来自造纸和纸浆、纺织和石化工业的流出物的解毒，用作用于医学诊断的工具或作为清理除草剂、杀虫剂和某些凝胶形式的爆炸物的生物除污剂。本发明的漆酶还用作用于某些水净化系统的清洁剂、作为用于制造抗癌药的催化剂并且甚至作为化妆品的成分。而且，其除去外源物和生产聚合物产品的能力使其极度令人感兴趣并且是用于生物除污目的的可用工具。

由于它们的活性、结构和物化性质，本发明的漆酶代表用于各种工业、农业、化学、生物技术和医学领域的新型和高度有价值的产品。这样的漆酶酶，来源于异常球菌或相关菌株，相比于本领域技术人员应用于生物质降解过程、处理环境污染物、解毒、生物能生产、合成化学、纸浆和造纸工业、纺织工业、洗衣粉、饮料工业以及化妆品和医学领域中的其他常规酶的活性，表现出更高的催化活性。

本发明的酶可以单独或与其他酶联合使用。例如，本发明的酶可以联合一种或多种选自以下的另外的酶使用：木聚糖酶、淀粉酶、葡糖苷酶、纤维素酶,果胶酶、酯酶、阿魏酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、乙醛脱氢酶、醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶。含有本发明的漆酶与至少一种另外的酶的组合物可以用于以上描述的所有用途、方法和应用。

当联合使用时，这些酶可以同时或依次组合。例如，两种或更多种酶可以组合在组合物中，并且该组合物可以添加到如上提及的生物质或碳源或反应器中。可替代地，两种或更多种酶可以依次添加至所述生物质、碳源或反应器，从而对反应提供组合的酶促活性。类似地，可以使用编码或表达酶组合的核酸、载体或细胞。而且，代替全细胞，可以使用其酶活性提取物如溶解产物或上清液。

取决于条件，生物质或底物可以单独或与其他酶或微生物联合与本发明的产品接触。应理解，为了有效地将生物质转化为大量生物能产品或代谢产物而出事使用的酶或细菌的精确量可以由本领域技术人员根据细菌种类、生物质种类以及培养条件进行调节。

在一个特定实施方式中，本发明的方法在转化生物质的反应器中进行。“反应器”是指常规发酵罐或用于生物质转化的任何设备或系统，通常选自生物反应器、生物过滤器、旋转式生物接触器，以及其他气相和/或液相生物反应器。根据本发明可以使用的设备可以连续或分配加载使用。

在反应器中，为了实现本发明的方法，使用本发明的至少一种酶、细菌或细菌提取物，而所述反应器被布置和提供为使得其内建立和维持的物化条件使所述酶或细菌能使用。

取决于所使用的细菌，所述方法可以在需氧、厌氧或微量氧(microaerobiosis)下执行。

共培养物

本发明的另一个方面在于具有改进性能的微生物共培养物。更具体地，本发明涉及使用异常球菌的共培养物，该共培养物具有改善的酶促活性或物化性能。

在一个特定实施方式中，本发明涉及至少两种不同微生物的共培养物，器中所述微生物中的至少一种是异常球菌并且所述微生物中的至少一种是原核或真核细胞，器中所述至少两种微生物彼此是共生的，并且其中所述至少一种异常球菌表现出根据本发明的漆酶活性。

原核或真核细胞可以例如选自细菌、酵母菌、植物细胞、真菌和哺乳动物细胞。酵母菌的实例包括但不限于啤酒酵母(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母（Kluyveromyces）、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母（Pichia）等。细菌的实例包括异常球菌、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、大肠杆菌(E.Coli)、梭菌属(Clostridium sp.)等。当两种微生物为其存活和生长需要另一种时认为二者彼此是共生的。本发明的共培养物可以包含多于两种的不同微生物，如3或4种。而且，共培养物可以是同时或依次的，优选同时的。

在这方面，本发明的一个特定目的是至少两种不同微生物的培养物，其中所述微生物中的至少一种是异常球菌并且所述微生物中的至少一种是酵母菌，并且其中所述至少一种异常球菌表现出根据本发明的漆酶活性。

这些共培养物提供改善的酶活性范围并且代表用于工业过程的有价值产品。

本发明的其他方面和优点将在以下实施例中公开，这些实施例举例说明本发明。

实施例

材料和方法

选择试验和培养基组成

167栖热菌(Thermus)培养基

磷酸盐缓冲液

基本培养基的组成

-MOPS缓冲液1X(ph7)，含有：酸性MOPS缓冲液40mM,NH₄Cl20mM,KOH10mM,NaOH10mM,CaCl₂0.5μM,Na₂SO₄0.276mM,MgCl₂0.528mM。

-微量营养素溶液(pH5)：(NH₄)₆(MO₇)₂₄3nM,H₃BO₃400nM,CoCl₂30nM,CuSO₄10,nM,MnCl₂250nM,ZnSO₄10nM。

-维生素溶液，pH4.0,(分别1μg/l):D-生物素,尼克酸,吡哆醛-HCl,硫胺素-HCl,维生素B12

-磷酸盐来源：K₂HPO₄5.7mM

-FeCl₃20μM(在柠檬酸钠溶液中制备然后过滤)。

实施例1–具有漆酶活性的酶的鉴定

异常球菌接种到pH7的MOPS缓冲液上并过滤：酸性MOPS缓冲液40mM(Sigma,France),NH₄Cl20mM,KOH10mM,NaOH10mM,CaCl₂0.5μM,Na₂SO₄0.276mM,MgCl₂0.528mM),pH5的微量营养素溶液((NH₄)₆(MO₇)₂₄3nM,H₃BO₃400nM,CoCl₂30nM,CuSO₄10nM,MnCl₂250nM,ZnSO₄10nM),pH4的维生素溶液(1μg/L的D-生物素,尼克酸,吡哆醛-HCl,硫胺素-HCl和维生素B12),5.7mM的K₂HPO₄溶液以及在NaH₂(C₃H₅O(COO)₃)和葡萄糖111mM中的20μM的FeCl₃溶液。

细菌在7天期间在45°C或30°C生长。提取基因组DNA，然后将编码推定漆酶的基因通过PCR扩增然后进行分析。来自培养物上清液和来自细胞提取物的漆酶活性在存在2,6二甲氧基苯酚(2,6DMP)、ABTS或丁香醛连氮(Syringaldazine)下进行测试。

具有漆酶活性的两种酶已经从纤维素分解异常球菌DRH46表征(即漆酶1、漆酶2)，并且具有漆酶活性的一种酶已经从马里科帕部落异常球菌DSM21211表征(即，漆酶3)。漆酶1、漆酶2和漆酶3的氨基酸序列分别表示在SEQ ID NO:2、4和6中。

还已经分离了编码核酸序列，并且分别表示在SEQ ID NO:1、3和5中。

这些核酸已被克隆入pET-DEST42表达载体中并且已经生产和维持含有所述载体的重组细菌。

实施例2–重组酶的生产

如实施例1中提及的，根据常规重组技术，将编码分别包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列的漆酶1、2和3酶的核酸克隆入pETDEST42载体中。在每种载体中，被克隆的核酸在具有6(His)tag(SEQ ID NO:7)的读框中进行克隆，以有利于重组蛋白的纯化。

制备包含该重组核酸的大肠杆菌细胞并在4升LB培养基中生长。在1mM IPTG和2mM Cu₂SO₄存在下实施酶生产的诱导过夜。在培养物离心之后，将细胞悬浮在50mM磷酸盐缓冲液pH7.5,300mM NaCl,5%咪唑,1mg/ml溶菌酶中并通过超声处理破坏。细胞碎片通过离心除去并收集上清液，并且施加至His-Trap亲和性色谱柱(HisTrap^TMHP柱)。

含有SEQ ID NO:2,4或6的重组多肽的部分用含有300mM咪唑,300mM NaCl,50mM磷酸盐缓冲液pH7.5的缓冲液洗脱，随后相对于50mMpH7.5磷酸盐缓冲液50mM NaCl进行脱盐，以纯化该蛋白质。

实施例3-SEQ ID NO:2和4的重组漆酶的活性

3.1.包含编码来源于异常球菌DRH-46的漆酶(即，漆酶1或漆酶2)的重组核酸（被克隆入pET-DEST42载体中）的大肠杆菌在有或没有1mM IPTG下在含有2mM的Cu₂SO₄的LB培养基中生长。

3.2漆酶测定

用于漆酶活性的标准测定在30°C至90°C的温度范围通过在适当波长处测量底物的酶促氧化进行。反应在存在底物浓度范围、0.05mg/mL纯化的酶下进行并且1mM在0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH8中制备

标准测定利用以下底物进行：2,6DMP,4-甲基DMP,芥子酸(synapic acid),丁香酸,愈创木酚,ABTS,对苯二胺和阿魏酸。

原理:

2,6DMP+O₂+酶->氧化的2,6DMP+2H₂O

测定在T=45°C和60°C,pH=8下进行。吸光率在A470nm检测并且使用连续分光光度测量速度确定完成。

试剂：

A.100mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲液,pH8，在45°C和60°C

B.30mM2,6-二甲氧基苯酚溶液

C.漆酶酶溶液(2mg/mL)

方案：

将试剂A(185μl)与试剂B(10μl)混合。该混合物平衡至45°C或60°C。使用适当温度调节的分光光度计监测在470nm处的吸光率直至恒定。然后加入试剂C(5μl)并记录A470nm的增加达30分钟。对于试验、对照和空白使用最大线速度获得　A470nm/分钟，空白是没有酶的混合物并且对照是具有来自云芝(Trametes versicolor)的漆酶(变色栓菌(T.versicolor),商购酶)代替漆酶酶溶液(试剂C)的混合物。

不同于2,6DMP的其他底物如4-甲基DMP,芥子酸,丁香酸,愈创木酚,ABTS,对苯二胺和阿魏酸也在对于每种底物的最佳浓度下进行测试(如表1A和1B所示)。

一个单位的酶活性定义为使用消光系数ε_470nm14.8mM^-1.cm^-1，每分钟氧化1mol的2,6DMP所需的酶的量。这个定义对于其他底物，特别是酚类底物(例如4-甲基DMP，芥子酸,丁香酸,愈创木酚,ABTS,对苯二胺,阿魏酸)必须在适当消光系数值下应用。

结果:

对于漆酶1(SEQ ID NO:2)和漆酶2(SEQ ID NO:4)活性的结果分别显示在以下表1A和表1B中。

表1A:漆酶1活性

底物	活性	Km(mM)	T°C	最佳pH	变色栓菌
						2,6DMP	+	0.798+/-0.035	60°C	8	-
4甲基DMP	+		60°C	8
						丁香酸	+		60°C	8
愈创木酚	+	3.046+/-0.183	60°C	8	-
						ABTS	+		60°C	8	+/-
阿魏酸	+		60°C	8	-
						对苯二胺	+		45°C	8	+
芥子酸	+		45°C	8	-

表1A显示，SEQ ID NO:2的重组酶在测试条件下表现出漆酶活性，由此证实漆酶1重组酶是完全活性的。令人感兴趣地，漆酶1活性在若干不同底物上被发现。

表1B:漆酶2活性

表1B显示，SEQ ID NO:4的重组酶在测试条件下表现出漆酶活性，由此证实漆酶2重组酶是完全活性的。令人感兴趣地，漆酶2活性在若干不同底物上被证实。

3.3温度和pH最佳值

在另一系列实验中，根据本发明的漆酶活性还使用各种底物在不同温度和pH条件下进行测试。

结果：

-在2,6二甲氧基苯酚(2,6DMP)作为底物的情况下，发现对于漆酶1的最佳温度为90°C。

-在2,6DMP作为底物的情况下，发现对于漆酶2的最佳温度为70°C。

-在2,6DMP作为底物的情况下，发现对于漆酶1的最佳pH为pH8。

-在2,6DMP作为底物的情况下，发现对于漆酶2的最佳pH为pH8。

总之，本发明的漆酶具有独特特征：它们在高温下是热稳定的并且在碱性pH(如pH8)下有活性。

参考文献

Mustafa R.,Muniglia L.,Rovel B.,Girardin M.(2005).“Phenolic colorants obtained byenzymatic synthesis using a fungal laccase in a hydro-organic biphasic system”.Food ResearchInternational38:995-1000.

Bajpai P.,Anand A.,Bajpai P.K.(2006).“Bleaching with lignin-oxidizing enzymes”.Biotechnol.Annu.Rev.12:349-78.

Witayakran S.(2008).“laccases in organic synthesis and its applications”.Georgie Institute ofTechnology,School of Chemistry and Biochemistry.

Osma J.F.,Toca-Herrera J.L.,Rodriguez-Couto S.(2010).“Uses of laccases in the food industry”.Enzyme Research,Article ID918761,8pages.

Morozova O.V.,Shumakovich G.P.,Shleev S.V.and Yaropolov(2007).“Laccase-MediatorSystems and their applications:a review”.Applied Biochemistry and microbiology43,n°5,523-535.