CN110218708A

CN110218708A - 一种细菌漆酶及其基因、制备方法与应用

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Publication number: CN110218708A
Application number: CN201910537731.2A
Authority: CN
Inventors: 刘逸寒; 王洪彬; 路福平; 李艳珍; 李玉
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: CN110218708B

Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，涉及一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型漆酶及其基因、制备方法与应用，其技术方案是利用分子生物学手段和基因工程技术，通过菌种筛选获得一株能够产生漆酶的解淀粉芽孢杆菌，通过PCR技术扩增出该新型漆酶的基因，然后将该新型漆酶基因，分别在枯草芽胞杆菌表达系统、解淀粉芽胞杆菌表达系统和地衣芽胞杆菌表达系统中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性漆酶重组菌株、解淀粉芽胞杆菌高稳定性漆酶重组菌株和地衣芽胞杆菌高稳定性漆酶游离表达重组菌株，实现新型漆酶的制备。同时该新型细菌漆酶在蛋白交联、染料脱色、造纸方面有较好的作用。

Description

一种细菌漆酶及其基因、制备方法与应用

技术领域：

本发明涉及一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型漆酶及其基因、制备方法与应用，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株，以及该细菌漆酶蛋白在蛋白交联、染料脱色、生物制浆方面的应用，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术：

漆酶(苯二酚：氧氧化还原酶，EC 1.10.3.2)是多铜氧化酶家族，其能够氧化多种无机和芳族化合物，特别是酚，同时将分子氧还原成水。漆酶不但具有广泛的催化底物，还具有氧化高难降解且对环境有害化合物的能力，同时还具有特殊的氧化催化性能。与化学氧化催化剂相比，漆酶氧化具有底物特异性、可降解性、反应条件温和、对环境无害等优点，使得漆酶在工业和生物技术等领域具有更为广阔的应用前景。目前，漆酶已被应用于纸浆造纸、有机合成、污水处理、食品等行业，此外，漆酶在服装行业、生物传感器、环境修复、毒品检测和清除军用化学毒剂等方面也有相关的研究报道。漆酶在高等植物、大多数昆虫以及微生物包括真菌、细菌中广泛分布。

真菌漆酶来源广泛，产漆酶的真菌绝大多数为担子菌亚门(Basidiomycotina)，约占80％。目前工业化的商品漆酶主要来源于真菌，但是，一般真菌漆酶在酸性条件下(pH 4-6)和30-55℃下保持较高的活性，而造纸和纺织等工业领域往往伴随着高温、强碱等反应条件，使真菌漆酶的应用受到限制且使用成本较高。而且丝状真菌生长周期长，对培养基要求较高，在发酵罐中容易受到较高的机械损伤，这些问题严重影响了真菌漆酶在工业上的应用。

细菌漆酶包括芽胞杆菌属的CotA蛋白、海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌CueO蛋白等，与真菌漆酶相比，细菌漆酶在铜离子抗性和热稳定性等方面更具有优势。而且细菌漆酶具有自己一些独特的优点：细菌漆酶没有糖基化修饰，分子组成单一，绝大多数为单体酶，最适pH范围广、温度稳定性好、存在Cu²⁺抗性等。这些性质正是目前工业上漆酶应用所需要的。因此，细菌漆酶的研究对于漆酶应用领域的扩展具有十分重要的意义。

染料废水的处理是纺织工业面临的重大问题。具有氧化性强、底物范围广、环境友好和生产成本低等优势的生物漂白系统受到广大科研工作者的关注。染料废水因其高温高碱的特性影响了真菌漆酶的活性，相反，细菌漆酶可以催化染料废水中含有发色基团的化合物如蒽醌、三芳基甲烷、靛青类和偶氮类染料。因此，细菌漆酶可以用来对染料废水进行脱色。

枯草芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌。枯草芽胞杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，枯草芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。

解淀粉芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌。解淀粉芽胞杆菌表达系统具有以下优点：1、在工业生产中，对健康或环境无毒无害；2、细胞壁组成简单，便于蛋白的分泌，并且不含有热源性脂多糖；3、分子生物试验中所用的很多噬菌体和质粒都可作为其转化的工具，且重组DNA比较容易转入。

地衣芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌。解淀粉芽胞杆菌表达系统具有以下优点：1、蛋白被直接分泌到胞外的培养基中，不会积聚，有利于蛋白的下游回收和纯化，降低整个生产链的操作成本；2、胞外蛋白分泌量大，生长温度较高适合用作工业生产宿主菌；3、作为单细胞生物在发酵过程中可以达到很高的细胞密度，且培养基相对比较简单，成本低、产出高，符合工业生产的要求。

在本发明中，新型漆酶编码基因来源于解淀粉芽孢杆菌，它属于细菌，对解淀粉芽孢杆菌基因组中新型漆酶编码基因进行克隆，新型漆酶基因在枯草芽胞杆菌表达系统、解淀粉芽胞杆菌表达系统和地衣芽胞杆菌表达系统中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性漆酶重组菌株、解淀粉芽胞杆菌高稳定性漆酶重组菌株和地衣芽胞杆菌高稳定性漆酶重组菌株，重组菌株发酵后，经过相应的处理，可以得到高稳定性漆酶催化剂，并且该新型重组漆酶可以对蒽醌类和偶氮类染料进行脱色。

发明内容：

本发明的目的在于克服和避免目前工业上生产漆酶所存在的不足之处，并提供一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型细菌漆酶编码基因及表达该新型细菌漆酶基因的工程菌株。

本发明实现目的的技术路线如下：以解淀粉芽孢杆菌的基因组为模板，并根据已报道的解淀粉芽孢杆菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的漆酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2，用来扩增在枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点BamHI、SalI。通过PCR克隆获得地衣芽孢杆菌的漆酶基因Lac，将其与pBSA43载体连接后，构建重组质粒pBSA43-Lac；转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Lac。再次将验证正确的重组质粒pBSA43-Lac，分别在枯草芽胞杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218和地衣芽孢杆菌TCCC11965(TCCC：天津科技大学菌种保藏中心)中成功表达，得到产高稳定性新型漆酶的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高稳定性新型漆酶。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之一为：一种新型细菌漆酶，所述漆酶来源于一株经发明人筛选的解淀粉芽孢杆菌，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示；

所述漆酶以2，2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物测定新型漆酶酶学性质时，最适作用温度为80℃，最适作用pH为5.5；

同时，以ABTS为底物测定该新型漆酶的pH稳定性和热稳定性，结果表明：该新型细菌漆酶在70℃下，pH 6～7的范围内稳定性良好，与已报道的来源于解淀粉芽孢杆菌的漆酶相比，本专利所要保护的新型漆酶的pH稳定性和温度稳定性更好；

所述漆酶的编码基因为Lac，碱基序列如序列表中的SEQ ID No：1所示；

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之二为：将上述基因重新构建重组载体，并在枯草芽胞杆菌WB600、解淀粉芽胞杆菌CGMCC No.11218和地衣芽胞杆菌TCCC11965中的高效表达，得到产高稳定性新型漆酶的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高稳定性新型漆酶；

用于表达所述的新型细菌漆酶的宿主细胞为枯草芽胞杆菌WB600，表达载体为pBSA43；

用于表达所述的新型细菌漆酶的宿主细胞为解淀粉芽胞杆菌CGMCC No.11218，表达载体为pBSA43；

用于表达所述的新型细菌漆酶的宿主细胞为地衣芽胞杆菌TCCC11965，表达载体为pBSA43；

构建重组菌株的实验步骤概述如下：

1、一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型漆酶基因，构建表达该新型漆酶的重组菌株(枯草芽胞杆菌WB600/pBSA43-Lac)及其该新型细菌漆酶的制备过程包括如下步骤：

(1)设计本发明的漆酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2，通过PCR克隆获得解淀粉芽孢杆菌的漆酶基因Lac，将其与大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-Lac，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Lac；得到含有解淀粉芽孢杆菌新型漆酶编码基因的重组质粒；

(2)将重组质粒pBSA43-Lac转化入枯草芽胞杆菌WB600，构建获得重组菌株WB600/pBSA43-Lac；

(3)将重组菌株进行发酵制备高稳定性新型细菌漆酶；

(4)制备高稳定性新型漆酶。

2、一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型漆酶基因，构建游离表达该新型漆酶的重组菌株(解淀粉芽胞杆菌CGMCC No.11218/pBSA43-Lac)及其该新型细菌漆酶的制备过程包括如下步骤：

(1)设计本发明的漆酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2，通过PCR克隆获得地衣芽孢杆菌的漆酶基因Lac，将其与与大肠杆菌-解淀粉芽胞杆菌穿梭质粒pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-Lac，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Lac；得到含有解淀粉芽孢杆菌新型漆酶编码基因的重组质粒；

(2)将重组质粒pBSA43-Lac转化入解淀粉芽胞杆菌CGMCC No.11218，构建获得重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-Lac；

(3)将重组菌株进行发酵制备高稳定性新型细菌漆酶；

(4)制备高稳定性新型漆酶。

3、一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型漆酶基因，构建游离表达该新型漆酶的重组菌株(地衣芽胞杆菌TCCC11965/pBSA43-Lac)及其该新型细菌漆酶的制备过程包括如下步骤：

(1)设计本发明的漆酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2，通过PCR克隆获得地衣芽孢杆菌的漆酶基因Lac，将其与与大肠杆菌-地衣芽胞杆菌穿梭质粒pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-Lac，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Lac；得到含有解淀粉芽孢杆菌新型漆酶编码基因的重组质粒；

(2)将重组质粒pBSA43-Lac转化入地衣芽胞杆菌TCCC11965，构建获得重组菌株TCCC11965/pBSA43-Lac；

(3)将重组菌株进行发酵制备高稳定性新型细菌漆酶；

(4)制备高稳定性新型漆酶。

有益效果：

1、本发明通过特定的能够产生漆酶的高通量菌株筛选，获得一株能够产生漆酶的细菌菌株，即解淀粉芽孢杆菌，通过PCR扩增获得的该菌株的漆酶基因，经测序为一段新的碱基序列。

2、本发明中通过枯草芽胞杆菌表达新型漆酶重组菌株、解淀粉芽胞杆菌表达新型漆酶重组菌株和地衣芽胞杆菌表达新型漆酶重组菌株发酵后制备的新型重组漆酶具有如下的酶学性质的优点：以ABTS为底物测定新型漆酶酶学性质时，最适作用温度为80℃，最适作用pH为5.5；同时该新型细菌漆酶在70℃，pH6～7的范围内活力稳定。

3、该新型细菌重组漆酶对偶氮类和蒽醌类染料具有较好的脱色效果。因此，该重组漆酶在实际应用中具有较大应用潜力。

附图说明：

图1为本发明新型漆酶成熟肽基因的PCR扩增电泳图；

其中：M为DNA Marker，1、2分别为漆酶成熟肽基因Lac；

图2为实施例2转化子重组质粒pBSA43-Lac酶切验证图；

其中：M为DNA Marker，1为重组质粒pBSA43-Lac经BamHI和SalI双酶切图；

图3为本发明实施例3转化子重组质粒pBSA43-Lac酶切验证图；

图4为本发明实施例4转化子重组质粒pBSA43-Lac酶切验证图；

其中：M为DNA Marker，1为重组质粒pBSA43-Lac经BamHI和SalI双酶切图。

图5最适作用温度曲线；

图6最适作用pH曲线。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所使用的地衣芽胞杆菌为TCCC11965，公开于：Development andapplication of a CRISPR/Cas9 system for Bacillus licheniformis genome editing[J].International Journal of Biological Macromolecules,2019,122:329-337，目前保存于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心，公众可从该中心获取菌种。

实施例1：解淀粉芽孢杆菌新型漆酶成熟肽基因的获得

1、新型漆酶成熟肽基因来源于本实验室筛选出的解淀粉芽孢杆菌，利用试剂盒(OMEGA:Bacterial DNA Kit)提取其基因组DNA，其中解淀粉芽孢杆菌基因组DNA的提取步骤如下：

(1)从甘油管中接种划线于LB固体平板中，37℃静置培养12h；

(2)从培养菌体的平板上挑取一单菌落接种于含5mL液体LB培养基中，于220r/min，37℃条件下培养12h；

(3)将菌液分装到灭菌的1.5mL微量离心管中，12000r/min离心1min收集菌体，弃上清；

(4)将沉淀重悬于100μL TE Buffer/分子水中用枪头反复吹打混匀，并加入50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃培养箱中放置10min；

(5)加入100μL的BTL Buffer以及20μL的蛋白酶K，振荡混匀，55℃水浴40-50min；

(6)加入5μL RNase A，盖紧管口，温和地将1.5mL的EP管上下翻转6～8次，室温放置5min；

(7)以12000r/min离心2min，将上清转移到另一EP管中，加200μL BDL Buffer，混合均匀后，65℃水浴10min；

(8)加入200μL无水乙醇，吹吸混匀；

(9)将EP管中的液体转移至吸附柱中静止2min，12000r/min离心1min，将滤液重新倒入吸附柱中静止、离心，重复两次，弃滤液；

(10)加入500μL HBC Buffer，静止两分钟，以12000r/min离心1min，弃滤液；

(11)加入700μL DNA Buffer，静止两分钟，以12000r/min离心1min，弃滤液，重复一次；

(12)以12000r/min空离2min，将吸附柱放到一个新的EP管上晾干；

(13)加入50-100μL的55℃分子水，室温静置3-5min，12000r/min离心1min。

2、通过NCBI基因库查找，根据已报道的解淀粉芽孢杆菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的漆酶成熟肽编码基因的扩增引物如下：

上游引物P1(SEQ ID NO.3)：

5’—CGCGGATCCGATGGCACTGGAAAAATTTG—3’

下游引物P2(SEQ ID NO.4)：

5’—ACGCGTCGACCTGCTTATCCGTGACGTCC—3’

上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点BamHI和SalI。

扩增模板为解淀粉芽孢杆菌基因组DNA，其扩增的反应条件为：

10×Pyrobest BufferⅡ	5μL
		dNTP Mixture(2.5mM each)	5μL
上游引物P1	2μL
		下游引物P2	2μL
DNA模板	2μL
		Pyrobest DNA Polymerase(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	33.5μL
		总体积	50μL

扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min40s反应30个循坏；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到1536bp的条带(图1)，用小量DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，并进行双酶切和纯化回收，得到本发明的解淀粉芽孢杆菌新型漆酶成熟肽编码基因Lac，见序列1。

也可以根据序列1进行全基因合成获得本发明所述的漆酶基因Lac。

实施例2：枯草芽胞杆菌高稳定性新型漆酶重组菌的构建

1、表达载体pBSA43的构建

pBSA43是以大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽胞杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Amp^r基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Km^r基因，可以在枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。

2、新型漆酶表达载体pBSA43-Lac的构建

将经PCR扩增并经BamHI和SalI双酶切后回收的新型漆酶基因(Lac)与同样双酶切的枯草芽胞杆菌表达载体pBSA43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证和测序，确定构建获得正确的重组菌株JM109/pBSA43-Lac。

3、重组表达载体pBSA43-Lac转化枯草芽胞杆菌WB600

将1μL(50ng/μL)的pBSA43-Lac重组质粒加入到50μL的枯草芽胞杆菌WB600感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证(图2)，确定获得表达Lac的枯草芽胞杆菌重组菌株WB600/pBSA43-Lac。

实施例3：解淀粉芽胞杆菌高稳定性新型漆酶重组菌的构建

1、表达载体pBSA43的构建

pBSA43是以大肠杆菌-解淀粉芽胞杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽胞杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Amp^r基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Km^r基因，可以在枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。

2、新型漆酶表达载体pBSA43-Lac的构建

将经PCR扩增并经BamHI和SalI双酶切后回收的新型漆酶基因(Lac)与同样双酶切的解淀粉芽胞杆菌表达载体pBSA43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证和测序，确定构建获得正确的重组菌株JM109/pBSA43-Lac。

3、重组表达载体pBSA43-Lac转化解淀粉芽胞杆菌CGMCC No.11218

将1μL(50ng/μL)的pBSA43-Lac重组质粒加入到50μL的解淀粉芽胞杆菌CGMCCNo.11218感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证(图3)，确定获得表达Lac的解淀粉芽胞杆菌重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-Lac。

实施例4：地衣芽胞杆菌高稳定性新型漆酶重组菌的构建

1、表达载体pBSA43的构建

pBSA43是以大肠杆菌-地衣芽胞杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽胞杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Amp^r基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Km^r基因，可以在枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。

2、新型漆酶表达载体pBSA43-Lac的构建

将经PCR扩增并经BamHI和SalI双酶切后回收的新型漆酶基因(Lac)与同样双酶切的地衣芽胞杆菌表达载体pBSA43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证和测序，确定构建获得正确的重组菌株JM109/pBSA43-Lac。

3、重组表达载体pBSA43-Lac转化地衣芽胞杆菌TCCC11965

将1μL(50ng/μL)的pBSA43-Lac重组质粒加入到50μL的地衣芽胞杆菌TCCC 11965感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证，确定获得表达Lac的地衣芽胞杆菌重组菌株TCCC11965/pBSA43-Lac。

实施例5：漆酶酶活的测定

取200μL含有4mmol/L Cu²⁺的0.1mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝3-8)或0.1mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH＝8-11)于96孔板中，保温1min。加入30μL的底物(50mmol/L的ABTS)，混匀，保温1min。再加入10μL稀释到一定倍数的酶液，混匀，在420nm下测定初始的OD值和反应10min的OD值。

漆酶的最适温度：在pH＝5.5的条件下分别测定其在30-100℃之间的酶活。

漆酶的最适pH：在80℃的条件下分别测定其在pH＝3-7之间的酶活。

漆酶的pH稳定性：在80℃，pH＝5.5的条件下分别测定其在pH＝3-10的缓冲液中保温0-10d的残余酶活。

漆酶的热稳定性：在80℃，pH＝5.5的条件下测定其在50-80℃之间保温0-2h后的残余酶活。

酶活的测定为三次平行实验，结果取平均值。

酶活的定义：在一定的条件下，每分钟氧化1μmol ABTS所需要的酶量定义为一个酶活单位。

酶活力计算：

酶活力

式中：ΔOD代表从反应开始到结束，吸光度的变化量。

V₁代表反应体系的总体积。

Δt代表从反应开始到结束，所用时间。

V₂代表在反应体系中，酶液的体积。

ε代表以ABTS为底物时，其产物在420nm处摩尔吸光系数36mM^-1cm^-1。

d代表吸光杯的内径或光程厚度(cm)。

通过上述方法测定新型漆酶的酶学性质，该新型漆酶酶学性质如下：

以ABTS为底物测定新型漆酶酶学性质时，最适作用温度为80℃(图5)，最适作用pH为5.5(图6)；

以ABTS为底物测定该新型漆酶的pH稳定性和热稳定性，结果表明：该新型细菌漆酶在70℃下，pH 6～7的范围内稳定性良好。在4℃，pH＝6下保存4天时，残余酶活达到300％左右，在4℃，pH＝7下下保存4天时，残余酶活达到200％左右；在4℃，在pH＝6下保存10天时，残余酶活达到200％左右，在4℃，pH＝7下保存10天时，残余酶活达到300％左右(以上酶活均是在80℃，pH5.5条件下测定，且以初始酶活作为100％)。

实施例6：新型漆酶在枯草芽胞杆菌重组菌株中的表达及制备

将枯草芽胞杆菌重组菌株WB600/pBSA43-Lac接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，收集发酵上清，即可获得高稳定性新型漆酶粗酶液，以ABTS为底物测定新型漆酶粗酶液酶活力(pH 5.5、80℃条件下)，枯草芽胞杆菌表达新型漆酶重组菌株发酵后漆酶酶活可达到370U/mL，然后采用分级盐析法沉淀新型漆酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型漆酶纯酶酶粉。

实施例7：新型漆酶在解淀粉芽胞杆菌重组菌株中的表达及制备

将解淀粉芽胞杆菌重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-Lac接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，收集发酵上清，即可获得高稳定性新型漆酶粗酶液，以ABTS为底物测定新型漆酶粗酶液酶活力(pH 5.5、80℃条件下)，解淀粉芽胞杆菌表达新型漆酶重组菌株发酵后漆酶酶活可达到510U/mL，然后采用分级盐析法沉淀新型漆酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型漆酶纯酶酶粉。

实施例8：新型漆酶在地衣芽胞杆菌重组菌株中的表达及制备

将地衣芽胞杆菌重组菌株TCCC11965/pBSA43-Lac接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，收集发酵上清，即可制备获得高稳定性新型漆酶粗酶液，以ABTS为底物测定新型漆酶粗酶液酶活力(pH 5.5、80℃条件下)，地衣芽胞杆菌表达新型漆酶重组菌株发酵后漆酶酶活可达到680U/mL，然后采用分级盐析法沉淀新型漆酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型漆酶纯酶酶粉。

实施例9：新型漆酶对染料的脱色处理及脱色率的计算

利用新型漆酶酶液对蒽醌和偶氮染料进行脱色处理，需要考虑催化反应体系中：反应温度、反应pH值、染料种类及浓度、介体种类及浓度、酶液用量、脱色时间等因素。本发明中使用的染料包括：偶氮荧光桃红、刚果红、活性黑、溴酚蓝、活性蓝19、活性艳蓝K-GR、活性艳蓝KN-R、结晶紫、靛蓝胭脂红、孔雀石绿。

(1)新型漆酶对染料脱色的方法及步骤

漆酶催化染料脱色的处理采用600μL的反应体系：

a、取490μL的含4mmol/L Cu²⁺的0.1mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝5.5、7)或者含4mmol/L Cu²⁺的0.1mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH＝9)，于EP管中，70℃保温1min。

b、加入60μL的介体(2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、盐酸异丙嗪(PZ)、乙酰丁香酮(AS)、丁香醛、3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBt))使其终浓度为0.1mM。

c、加入10μL的浓度为3000mg/L的上述染料。

d、再加入40μL的稀释适当倍数的漆酶酶液(对应酶活力为0.05U/mL)，以在相同实验条件下，加入等量的100℃灭活15min的酶液作为空白对照测其吸光度A₀。

e、于60℃条件下脱色12h，测定其吸光度为A₁。

以上每个脱色处理均重复3次，结果取平均值。

(2)脱色率的计算：

将得到的三株重组菌发酵后，利用制备的新型漆酶酶粉，按照上述脱色步骤，对上述染料进行脱色处理，12h脱色率均达到了50％以上。

实施例10：酶学性质的比较

将本发明中的漆酶氨基酸序列在NCBI上BLAST的结果进行同源性比较，发现与本发明中的漆酶在NCBI中同源性最高的氨基酸序列的漆酶(Sequence ID:WP_013351262.1)，采用实施例2、实施例6相同的方法将本发明所述的漆酶与WP_013351262.1分别在枯草芽孢杆菌中进行表达，并采用实施例5所述方法测定酶活，结果显示，WP_013351262.1重组菌株发酵后漆酶酶活为200U/mL，本发明提供的漆酶的发酵液酶活是WP_013351262.1的2.5倍。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种细菌漆酶及其基因、制备方法与应用

<130> 1

<141> 2019-06-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1536

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌()

<400> 1

atggcactgg aaaaatttgc agatgaactg ccgattatcg aaacactgaa gccgcagaag 60

acatcaaacg gcagcacgta ttatgaagtc acgatgaagg aatgctttca caagctgcac 120

cgtgatctcc cgccgacccg gctgtggggc tataacggtt tgtttcccgg cccgacgatc 180

gacgtgaacc aagatgagaa cgtctatatt aaatggatga atgacctgcc ggataagcat 240

tttctccctg tggaccatac cattcaccat tcagagggcg gccatcagga acccgacgtc 300

aaaaccgtcg tccatttaca cggaggagca acgccgccgg acagcgacgg ctatccggaa 360

gcctggttca cacgggattt caaggagaag gggccttatt ttgaaaaaga ggtataccac 420

tatccaaaca aacagcgcgg ggcgctatta tggtatcacg accacgccat ggcaattacg 480

aggctcaatg tgtacgccgg gcttgccggc atgtatatca tccgcgagcg aaaagaaaag 540

cagctgaagc ttcccgccgg agaatacgac gtaccgctta tgattatgga ccgcacgtta 600

aatgacgacg gttccttgtt ttatccgagc gggcccgata atccttccga aacgctgccg 660

aatccttcaa tcgttccatt cctttgcgga aataccattc tcgtcaacgg caaagcgtgg 720

ccgtatatgg aagtcgaacc gcggacatat cgtttccgta tccttaacgc ctcaaatacg 780

agaacatttt ccctctcgct caataatggc ggccggttta ttcaaatcgg ttctgacggc 840

ggactgctcc cccgttctgt caagacacag tccatcagct tagccccggc tgagcggtat 900

gatgtgctca ttgatttctc cgcttttgac ggagaacata ttattttaac gaacggcacc 960

ggctgcgggg gcgacgtcaa tccggatacc gacgccaatg tgatgcaatt ccgcgtcaca 1020

aaaccgctga agggagaaga caccagccgg aagcctaaat atctgtcagc catgcctgat 1080

atgacatcaa aaagaataca caatatcagg acgcttaaac tcacaaacac gcaagacaaa 1140

tacggccggc cggttttaac actcaataac aagcgctggc atgatcccgt gacagaagcg 1200

ccgcggctcg gctcaacgga aatctggtcg attatcaacc cgacgcgggg aacccatccg 1260

atacacctgc acttggtttc cttccaagtc cttgaccggc gtccttttga cttagaacgt 1320

tataacaaat tcggcgacat tgtgtataca ggccccgccg tcccgccgcc tccaagtgaa 1380

aaaggctgga aagacaccgt gcaggcgcac tccggagaag tcatcagaat cgcggcgaca 1440

ttcgcgcctt acagcggacg gtacgtatgg cattgtcata ttttagaaca tgaagattat 1500

gacatgatga gaccgatgga cgtcacggat aagcag 1536

<210> 2

<211> 512

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌()

<400> 2

Met Ala Leu Glu Lys Phe Ala Asp Glu Leu Pro Ile Ile Glu Thr Leu

1 5 10 15

Lys Pro Gln Lys Thr Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Glu Val Thr Met

20 25 30

Lys Glu Cys Phe His Lys Leu His Arg Asp Leu Pro Pro Thr Arg Leu

35 40 45

Trp Gly Tyr Asn Gly Leu Phe Pro Gly Pro Thr Ile Asp Val Asn Gln

50 55 60

Asp Glu Asn Val Tyr Ile Lys Trp Met Asn Asp Leu Pro Asp Lys His

65 70 75 80

Phe Leu Pro Val Asp His Thr Ile His His Ser Glu Gly Gly His Gln

85 90 95

Glu Pro Asp Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Ala Thr Pro

100 105 110

Pro Asp Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Thr Arg Asp Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Gly Pro Tyr Phe Glu Lys Glu Val Tyr His Tyr Pro Asn Lys

130 135 140

Gln Arg Gly Ala Leu Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Ile Thr

145 150 155 160

Arg Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Ala Gly Met Tyr Ile Ile Arg Glu

165 170 175

Arg Lys Glu Lys Gln Leu Lys Leu Pro Ala Gly Glu Tyr Asp Val Pro

180 185 190

Leu Met Ile Met Asp Arg Thr Leu Asn Asp Asp Gly Ser Leu Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Gly Pro Asp Asn Pro Ser Glu Thr Leu Pro Asn Pro Ser Ile

210 215 220

Val Pro Phe Leu Cys Gly Asn Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Ala Trp

225 230 235 240

Pro Tyr Met Glu Val Glu Pro Arg Thr Tyr Arg Phe Arg Ile Leu Asn

245 250 255

Ala Ser Asn Thr Arg Thr Phe Ser Leu Ser Leu Asn Asn Gly Gly Arg

260 265 270

Phe Ile Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Val Lys

275 280 285

Thr Gln Ser Ile Ser Leu Ala Pro Ala Glu Arg Tyr Asp Val Leu Ile

290 295 300

Asp Phe Ser Ala Phe Asp Gly Glu His Ile Ile Leu Thr Asn Gly Thr

305 310 315 320

Gly Cys Gly Gly Asp Val Asn Pro Asp Thr Asp Ala Asn Val Met Gln

325 330 335

Phe Arg Val Thr Lys Pro Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ser Arg Lys Pro

340 345 350

Lys Tyr Leu Ser Ala Met Pro Asp Met Thr Ser Lys Arg Ile His Asn

355 360 365

Ile Arg Thr Leu Lys Leu Thr Asn Thr Gln Asp Lys Tyr Gly Arg Pro

370 375 380

Val Leu Thr Leu Asn Asn Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Glu Ala

385 390 395 400

Pro Arg Leu Gly Ser Thr Glu Ile Trp Ser Ile Ile Asn Pro Thr Arg

405 410 415

Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Ser Phe Gln Val Leu Asp

420 425 430

Arg Arg Pro Phe Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Phe Gly Asp Ile Val

435 440 445

Tyr Thr Gly Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys Gly Trp Lys

450 455 460

Asp Thr Val Gln Ala His Ser Gly Glu Val Ile Arg Ile Ala Ala Thr

465 470 475 480

Phe Ala Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu

485 490 495

His Glu Asp Tyr Asp Met Met Arg Pro Met Asp Val Thr Asp Lys Gln

500 505 510

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cgcggatccg atggcactgg aaaaatttg 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

acgcgtcgac ctgcttatcc gtgacgtcc 29

Claims

1.一种细菌漆酶，其特征在于，所述细菌漆酶的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种细菌漆酶，其特征在于，编码所述细菌漆酶的基因为Lac,其碱基序列如序列表SEQ ID No：1所示。

3.根据权利要求1所述的一种细菌漆酶，其特征在于，所述细菌漆酶的制备方法包括如下步骤：

(1)将权利要求2所述的基因进行酶切，与表达载体连接得到了新的重组载体；

(2)将重组载体转化入宿主细胞中，得到重组菌株，之后将重组菌株发酵，得到高稳定性细菌漆酶。

4.含有权利要求2所述的漆酶基因的重组载体或重组菌株。

5.根据权利要求4所述的含有漆酶基因的重组载体，其特征在于，表达载体为质粒pBSA43。

6.根据权利要求4所述的含有漆酶基因的重组菌株，其特征在于，宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218或地衣芽孢杆菌TCCC11965。

7.根据权利要求1所述的细菌漆酶在蛋白交联、染料脱色、生物制浆方面的应用。