CN102057035A - 通过修饰的转运蛋白表达而最小化氨基甲酸乙酯产生的功能增强的酵母 - Google Patents

通过修饰的转运蛋白表达而最小化氨基甲酸乙酯产生的功能增强的酵母 Download PDF

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Abstract

本发明提供了酿酒酵母菌株，其已转化，以在磷酸甘油酸激酶(PGK1)启动子和终止子序列的调控下组成型表达DUR3(编码尿素转运蛋白蛋白质)，产生降低的氮分解代谢物阻抑，其中该转化的酵母菌株可进一步转化，以组成型表达诸如尿素羧化酶、脲基甲酸酯水解酶或尿素酰胺裂合酶的尿素降解酶，这也产生降低的氮分解代谢物阻抑；产生该菌株的方法；该菌株产生具有低于30ppb的降低的氨基甲酸乙酯浓度的发酵饮料或食品的方法和用途。

Description

通过修饰的转运蛋白表达而最小化氨基甲酸乙酯产生的功能增强的酵母
背景技术
氨基甲酸乙酯(也称为尿烷)作为来源于用酵母发酵食物和饮料的直接副产物形成。例如，氨基甲酸乙酯(可能的致癌剂)的形成通过尿素与乙醇的反应而存在于发酵葡萄汁(grape must)(葡萄酒(wine))中。
可以用通过DUR1，2的组成型表达降解尿素的酵母菌株来产生具有低氨基甲酸乙酯浓度的发酵饮料或食品(Coulon等，2006，Am.J.Enol.Vitic.：113-124)。
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，DUR3基因编码在某些条件下主动转运尿素至酵母细胞内的尿素转运蛋白(DUR3p)。DUR3基因的转录正常情况下受到氮分解代谢物阻抑(NCR，ElBerry等，1993，J.Bacteriol.175：4688-4698；Goffeau等，1996，Science 274(5287)，546-547；Johnston等，1994，Science 265(5181)，2077-2082)。这只是利用糖类的酵母细胞中涉及氮代谢的合成代谢酶和分解代谢酶的调节网络的一个方面。
概述
本发明部分涉及提供用于降低发酵饮料或食品中氨基甲酸乙酯浓度的产品和方法，其使用已转化来在发酵条件下表达尿素转运蛋白如DUR3以主动转运尿素至酵母细胞内的酵母菌株。还可以修饰酵母以在发酵条件下表达胞内尿素降解酶活性，如DUR1，2。
本发明部分提供已转化以在发酵条件下例如组成型表达DUR3的新的酵母菌株，以及用于酵母菌株的功能增强以使该酵母在发酵条件下例如组成型表达酵母DUR3的方法，以及该酵母菌株在降低发酵饮料或食品氨基甲酸乙酯中的用途。
在本发明的另一实施方案中，提供已转化以组成型表达DUR1，2和DUR3的新的酵母菌株，以及该酵母菌株在降低发酵饮料或食品氨基甲酸乙酯中的用途。
在本发明的另一实施方案中，提供转化以不断表达DUR3p的酵母菌株和转化以不断表达DUR3p和尿素酰胺裂合酶(amidolyase)二者的酵母菌株，该尿素酰胺裂合酶包含尿素羧化酶(urea carboxylase)和脲基甲酸酯水解酶活性二者。
在本发明的另一实施方案中，提供已转化以在发酵条件下持续摄取尿素的酵母菌株。其中该酵母可以组成型表达DUR3。
在本发明的另一实施方案中，提供已转化以在发酵条件下持续摄取并同时降解尿素的酵母菌株。其中该酵母菌株可以组成型表达DUR1，2和DUR3二者。
在本发明的另一实施方案中，提供用于修饰酵母菌株的方法，其包括转化该酵母菌株以在发酵条件下降低尿素转运蛋白表达的氮分解代谢物阻抑。其中该尿素转运蛋白可以由DUR3编码，且其中该尿素转运蛋白可以是DUR3p。
在本发明的另一实施方案中，提供用于修饰酵母菌株以组成型表达DUR3的方法。其中该方法可以包括将1/2TRP1-PGKp-D UR3-PGKt-kanMX-1/2TRP1盒整合入TRP1基因座。其中该方法可以包括用包含编码DUR3p的编码序列的新的核酸转化该酵母菌株。其中该方法可以包括用包含不受氮分解代谢物阻抑的启动子的重组核酸转化该酵母。
在本发明的另一实施方案中，提供通过上文该功能增强的酵母菌株，如在发酵条件下例如通过组成型表达来表达DUR3或DUR1，2和DUR3二者的菌株的用途来产生发酵饮料或食品的方法。
在本发明的另一实施方案中，提供组成型表达DUR3或DUR1，2和DUR3二者的转化的酵母菌株以降低发酵饮料或食品中氨基甲酸乙酯的浓度的用途。其中该发酵饮料或食品可以是葡萄酒，且降低的氨基甲酸乙酯的浓度可以是30ppb以下。
在本发明的另一实施方案中，提供用组成型表达DUR3或DUR1，2和DUR3二者的转化的酵母菌株产生的具有降低的氨基甲酸乙酯浓度的发酵饮料或食品。其中该发酵饮料或食品可以是葡萄酒，且降低的氨基甲酸乙酯的浓度可以是30ppb以下。
附图简述
图1.DUR3遗传盒。
图2显示酿酒酵母DUR3p蛋白质序列(SEQ ID NO：7)。
图3显示酿酒酵母DUR3编码序列(SEQ ID NO：8)。
图4显示在DUR1，2起始密码子ATG处终止的DUR1，2基因上游区域的部分序列(SEQ ID NO：9)。突出显示两个推定的NCR元件GATAA(G)框(一个在位点-54至-58，另一个在位点-320至-324)以及推定的TATAA框。
图5显示DUR3基因上游区域的部分序列(SEQ ID NO：10)。
图6显示多蛋白质序列比对，说明DUR3p(序列NP_011847.1(SEQ ID NO：7))和其他7种蛋白质(序列NP_595871.1(SEQ ID NO：11)、XP_452980.1(SEQ ID NO：12)、NP_982989.1(SEQ ID NO：13)、XP_364218.1(SEQ ID NO：14)、XP_329657.1(SEQ ID NO：15)、NP_199351.1(SEQ ID NO：16)和NP_001065513.1(SEQ ID NO：17))之间的同源性。
图7显示DUR3p(SEQ ID NO：7)与(预测的)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)尿素转运蛋白的BLAST比较并显示共有序列。在其他实施方案中，本发明的尿素转运蛋白在最佳比对时，可以与酿酒酵母DUR3p序列或与粟酒裂殖酵母尿素转运蛋白或与此图中显示的共有序列具有各种程度的同一性，如80％同一性。
图8显示Chardonnay葡萄酒中的葡萄酒酵母菌株522、522DUR1，2[522EC-的另一种命名]、522DUR3和522DUR1，2/DUR3[522EC-DUR3的另一种命名]的发酵谱(重量损失)。Chardonnay葡萄酒产生自接种至最终OD600＝0.1并在20℃孵育至完成(～300小时)的未过滤的Calona Chardonnay葡萄汁。
图9是本发明的DUR3自身克隆盒的示意图。
图10是自身克隆的leu2-PGK1p-kanMX-PGK1p-DUR3-PGK1t-leu2盒通过PGK1启动子同向重复的重组，用kanMX标记和随后的标记丧失整合入酿酒酵母工业菌株的LEU2基因座的示意图。
发明详述
本文未直接定义的任意术语应理解为具有与本发明的领域内所理解的通常与它们相关的意义。在下文或说明书中的其他地方讨论了某些术语，以向描述本发明实施方案的组合物、设备、方法等及如何产生或使用它们的实施者提供其他指导。应理解，可以以一种以上的方式表述同一事物。因此，可以将其他语言和同义词用于本文所讨论的任意一个或多个术语。本文是否阐述或讨论术语并不重要。提供了一些同义词或可替代的方法、材料等。除非明确地说明，一个或几个同义词或等同物的列举不排除其他同义词或等同物的使用。实例(包含术语的实例)在说明书中的使用只是为了说明性目的，而不限制本发明的实施方案的范围和意义。
本文所提到的“酵母菌株”可以是酿酒酵母的菌株。在其他实施方案中，本发明可以例如使用贝酵母(S.bayanus)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)酵母菌株。
在其他方面，本发明涉及用于发酵以产生各种产品，如发酵饮料或食品的酵母菌株。“发酵饮料或食品”可以是但不限于葡萄酒、白兰地酒、威士忌、蒸馏酒精、乙醇、清酒(sake)、雪利酒、啤酒、生面团、面包、醋或酱油。
在各个方面，本发明涉及基因的修饰和重组基因的用途。在此背景中，术语“基因”按照其通常定义使用，意指有效连接的核酸序列组。在本发明的背景中，基因的修饰可以包含在基因中有效连接的各个序列中任一序列的修饰。“有效连接”指特定序列直接或间接地相互作用以实现它们的预期功能，如基因表达的介导和调节。有效连接的序列的相互作用可以通过例如蛋白质介导，而该蛋白质又反过来与这些序列相互作用。
在本发明的背景中，“启动子”指当转录调节区有效连接至目的序列时，能够介导或调节目的核苷酸序列以期望的空间或时间模式及期望的程度转录的核苷酸序列。当序列功能性连接使得允许待通过转录调节区介导或调节的目的序列的转录时，转录调节区和目的序列“有效连接”。在一些实施方案中，为了有效连接，转录调节区可以和目的序列位于相同的链上。在一些实施方案中，转录调节区可以位于目的序列的5’。在这类实施方案中，转录调节区可以直接是目的序列的5’或这些区域间可以存在间插序列。在一些实施方案中，转录调节序列可以位于目的序列的3’。转录调节区和目的序列的有效连接可以需要适当的分子(如转录激活蛋白质)结合至转录调节区上，因此本发明包含在体外或在体内提供这类分子的实施方案。
本发明的各种基因和核酸序列可以是重组序列。术语“重组”意指一些事物已重新组合，因此提到核酸构建体时，此术语指由通过分子生物学技术在某一点连接在一起或形成的核酸序列组成的分子。当与蛋白质或多肽一起提到时，术语“重组”指利用通过分子生物学技术产生的重组核酸构建体表达的蛋白质或多肽分子。当与遗传组成一起提到时，术语“重组”指具有在天然存在的亲代基因组中不存在的新的等位基因组合的配子或子代或细胞或基因组。重组核酸构建体可以包含连接至或通过操作以连接至在自然界不连接或在自然界中在不同位点连接的核酸序列的核苷酸序列。因此，称核酸构建体为“重组体”是指利用遗传工程通过人为干预操作的核酸分子。
重组核酸构建体可以例如通过转化引入宿主细胞。这类重组核酸构建体可以包括已经分离出来并重新引入宿主物种细胞中的来源于相同宿主细胞物种或来源于不同宿主细胞物种的序列。
作为宿主细胞最初转化的结果或者作为随后重组和/或修复事件的结果，重组核酸序列可以整合进入宿主细胞基因组。备选地，重组序列可以作为染色体外元件保持。这类序列例如可以通过用如转化的酵母菌株的生物体作为通过突变、群体交配或原生质体融合进行的菌株改进方法的起始菌株来复制。如术语“重组”在本文的使用，认为产生的保留了本发明重组序列的菌株本身是“重组体”。
在本发明的各个方面，可以利用如在例如Itakura等，美国专利号4,598,049；Caruthers等，美国专利号4,458,066；和Itakura美国专利号4,401,796和4,373,071中公开的技术化学合成核酸分子。如本文所用的术语，这类合成的核酸本质就是“重组体”(是组合该分子的组成部分的连续步骤的产物)。
转化是通过将一个或多个外源核酸掺入细胞从而改变细胞所携带的遗传物质的方法。例如，可以利用各种方法转化酵母(Gietz等，1995)。通过将外源核酸掺入细胞遗传物质中，或者利用细胞暴露于外源核酸所产生的细胞内源遗传物质的改变可以实现这种转化。转化体或转化细胞是通过对外源核酸的摄取已在功能上增强的细胞或细胞后代。如本文所用，这些术语适用于通过随后的细胞世代保持了期望的遗传改变的转化细胞的后代，并与同样可以存在于随后的细胞世代的细胞中的其他突变或改变无关。
用于产生葡萄酒的转化宿主细胞可以例如包含酿酒酵母或裂殖酵母属的菌株，如Bourgovin(RC 212酿酒酵母)、ICV D-47酿酒酵母、71B-1122酿酒酵母、K1V-1116酿酒酵母、EC-1118酿酒酵母、Vin13、Vin7、N96和WE352。存在酵母菌株的各种商业来源，如Lallemand Inc.(加拿大)、AB Mauri(澳大利亚)和Lesaffre(法国)。
在各种实施方案中，本发明的一些方面可以利用具有尿素转运活性，如DUR3的尿素转运活性的内源或外源酶。类似地，在一些实施方案中，本发明的一些方面可以利用具有尿素降解活性，如DUR1，2p的尿素羧化酶和脲基甲酸酯水解酶活性的内源或外源酶。这些酶可以与DUR3p或DUR1，2p同源，或与具有相关活性的DUR3p或DUR1，2p的区域同源。
当序列(如天然DUR3p或DUR1，2p或天然DUR3或DUR1，2核酸序列和用于本发明中的其他蛋白质或核酸序列)最佳比对时，序列间的同源性程度可以表示为同一性百分比，意指序列间精确匹配的出现。可以利用各种算法，如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math 2：482的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法，Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性检索方法和这些算法的计算机化执行程序(如Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group，Madison，WI，U.S.A.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)进行用于同一性比较的序列的最佳比对。也可以利用描述于Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10中的BLAST算法(利用公开的默认设置值)进行序列比对。可以通过National Center For Biotechnology Information(通过互联网在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得进行BLAST分析的软件。BLAST算法涉及首先通过鉴定待查序列中长度W的短字串来鉴定高得分序列对(HSP)，该字串与数据库序列中相同长度的字串比对时将匹配或满足一定的正值阈值分数T。T称为相邻字串得分阈值。最初的相邻字串命中作为种子用于起始检索以发现更长的HSP。字串命中沿着每条序列在两个方向延伸，直至累积比对得分可以增加。当满足以下参数时，每个方向上字串命中的延伸停止：累积比对得分从它的最大达到值降低量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分趋向零或更低值；或者达到任一条序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。对于双链核酸比较，BLAST程序可以利用如下作为默认值：字串长度(W)11、BLOSUM62评分矩阵(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)比对(B)50、期望值(E)10(在其他实施方案中其可以改变为1或0.1或0.01或0.001或0.0001；尽管远高于0.1的E值不可以鉴定功能上相似的序列，但它可以用于检查具有较低显著性的命中，对短区域的相似性，E值在0.1和10之间)、M＝3、N＝4。对于蛋白质比较，BLASTP可以利用如下默认值：G＝11(缺口开放罚分)；E＝1(缺口延伸罚分)；E＝10(期望值，在该设置下，预期在与所检序列具有相同大小的数据库中偶然出现具有等于或好于所定义的比对分数S的10个命中；可以增加或减少E值以改变检索的严格性)；和W＝3(字串大小，对于BLASTN默认值是11，对于其他blast程序默认值是3)。BLOSUM矩阵为比对中的每个位点指定概率分数，该概率分数基于在相关蛋白质的共有序列模块间出现置换的已知频率。在BLAST2.0中默认使用BLOSUM62(缺口存在罚分＝11；每个残基的缺口罚分＝1；λ比率＝0.85)置换矩阵。各种其他矩阵可以用作BLOSUM62的替代，其包含：PAM30(9，1，0.87)；PAM70(10，1，0.87)；BLOSUM80(10，1，0.87)；BLOSUM62(11，1，0.82)和BLOSUM45(14，2，0.87)。利用BLAST算法的两个序列间统计学相似性的一个测量是最小总和概率(smallest sum probability，P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率的指示。在本发明的其他实施方案中，如果在测试序列的比较中，最小总和概率小于约1、优选小于约0.1、更优选小于约0.01和最优选小于约0.001，则认为核苷酸或氨基酸序列基本相同。
在一些实施方案中，本发明的核酸和蛋白质序列可以基本相同，如与DUR3p或DUR1，2p，或DUR3或DUR1，2核酸序列基本相同。当最佳比对时，这些序列的基本同一性可以用同一性百分比反映，例如同一性百分比可以是大于50％、80％到100％、至少80％、至少90％或至少95％，在基因寻靶底物的情况下，其可以指基因寻靶底物的一部分与靶序列的一部分的同一性，其中同一性的程度有利于同源配对和重组和/或修复。两条核酸序列基本相同的另一个指示是这两条序列在中等严格条件下，或优选在严格条件下互相杂交。例如，在中等严格条件下，可以在0.5MNaHP04、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中，在65℃进行与结合滤膜的序列的杂交，并在0.2x SSC/0.1％SDS中在42℃下洗涤(参见Ausubel等，(编辑)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，1卷，Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley & Sons，Inc.，纽约，在2.10.3页)。备选地，例如，在严格条件下，可以在0.5M NaHP04、7％SDS、1mM EDTA中，在65℃进行与结合滤膜的序列的杂交，并在0.1x SSC/0.1％SDS中在68℃洗涤(参见Ausubel等，(编辑)，1989，同上引文)。根据目的序列，可以按照已知方法修改杂交条件(参见Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- -Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第二章，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，纽约)。通常，在限定的离子强度和pH下，选择的严格条件为对于特定序列而言比其热熔点低约5℃。对于严格杂交，洗涤可以例如是至少15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟或120分钟。
正如本领域所熟知，可以在多肽，如DUR3或DUR1，2的结构中进行一些修改和改变，而基本不改变该肽的生物学功能，从而获得生物学上等同的多肽。在本发明的一方面，具有尿素转运活性的蛋白质可以包含通过保守氨基酸取代而不同于天然DUR3序列的蛋白质。类似地，具有尿素羧化酶/脲基甲酸酯水解酶活性的蛋白质可以包含通过保守氨基酸取代而不同于天然DUR1，2序列的蛋白质。如这里所用，术语“保守氨基酸取代”指在蛋白质中的给定位点上用一个氨基酸对另一个氨基酸进行取代，其中可以进行这种取代而不实质上造成相关功能的损失。在进行这类改变时，可以基于侧链取代基，例如，它们的大小、电荷、疏水性、亲水性等的相对类似性进行类似氨基酸残基的取代，并可以通过常规测试，针对它们对蛋白质功能的影响测定这类取代。
在一些实施方案中，可以进行将一个氨基酸残基取代为另一个具有类似疏水性值(例如，在加或减2.0的值之内)的氨基酸残基的保守氨基酸取代，其中下面可以是具有约-1.6的亲水指数的氨基酸残基，如Tyr(-1.3)或Pro(-1.6)。赋予氨基酸残基如下疏水性值(如美国专利号4,554,101中所详述，其在此处引用作为参考)：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；和Trp(-3.4)。
在其他实施方案中，可以进行将一个氨基酸残基取代为另一个有类似亲水指数(例如，在加或减2.0的值之内)的氨基酸残基的保守氨基酸取代。在这类实施方案中，可以基于其疏水性和电荷特性来指定每个氨基酸残基的亲水指数，如下：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。
在其他实施方案中，可以进行将一个氨基酸残基取代为同类的另一个氨基酸残基的保守氨基酸取代，其中将氨基酸分为非极性、酸性、碱性和中性类，如下：非极性：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met；酸性：Asp、Glu；碱性：Lys、Arg、His；中性：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。
在其他实施方案中，保守氨基酸改变包含根据亲水性或疏水性、大小或体积或电荷考虑的改变。一般可以将氨基酸表征为疏水的或亲水的，这主要取决于氨基酸侧链的特性。根据Eisenberg等(J.Mol.Bio.179：125-142，184)的标准化的共有疏水性标度(consensus hydrophobicity scale)，疏水氨基酸显示大于零的疏水性，而亲水氨基酸显示小于零的疏水性。遗传编码的疏水氨基酸包含Gly、Ala、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Met和Trp，遗传编码的亲水氨基酸包含Thr、His、Glu、Gln、Asp、Arg、Ser和Lys。非遗传编码的疏水氨基酸包含叔丁基丙氨酸，而非遗传编码的亲水氨基酸含瓜氨酸和高半胱氨酸。
可以根据其侧链特性进一步细分疏水或亲水氨基酸。例如，芳香族氨基酸是具有包含至少一个芳香环或杂芳香环的侧链的疏水氨基酸，该环可以含有一个或多个取代基，如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，其中R独立地是(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)链烯基、取代的(C1-C6)链烯基、(C1-C6)炔基、取代的(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元杂芳基、取代的5-20元杂芳基、6-26元烷杂芳基(alkheteroaryl)或取代的6-26元烷杂芳基。遗传编码的芳香族氨基酸包含Phe、Tyr和Tryp。
非极性氨基酸是具有如下侧链的疏水氨基酸，该侧链在生理pH下不带电荷并且具有这样的化学键，在该化学键中，两个原子中的每个原子一般平均占有这两个原子共用的电子对(即侧链不是极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包含Gly、Leu、Val、Ile、Ala和Met。可以将非极性氨基酸进一步细分为包含脂肪族氨基酸，脂肪族氨基酸是具有脂肪烃侧链的疏水氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸包含Ala、Leu、Val和Ile。
极性氨基酸是具有如下侧链的亲水氨基酸，该侧链在生理pH不带电荷，但是其具有这样的化学键，在该化学键中，两个原子之一更近地占有这两个原子共用的电子对。遗传编码的极性氨基酸包含Ser、Thr、Asn和Gln。
酸性氨基酸是具有小于7的侧链pKa值的亲水氨基酸。由于氢离子的失去，酸性氨基酸在生理pH下通常具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包含Asp和Glu。碱性氨基酸是具有大于7的侧链pKa值的亲水氨基酸。由于水合氢离子的结合，碱性氨基酸在生理pH下通常具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包含Arg、Lys和His。
本领域技术人员将理解，上述分类不是绝对的，可以将一个氨基酸分在一种以上的类别中。此外，可以基于指定的测定或与以前鉴定的氨基酸比较，根据已知行为和/或特征性化学、物理或生物学特性来分类氨基酸。
在本发明的各个方面，可以调节宿主的尿素转运和降解活性，以使得它在发酵条件下，如在葡萄酒发酵条件下处于所期望的水平。术语“发酵条件”指在该条件下，生物体，如酿酒酵母通过发酵产生能量，即发生发酵的培养条件。广义地定义，发酵是厌氧反应的总和，在缺乏氧气的情况下该厌氧反应可以为微生物的生长提供能量。通过底物水平的磷酸化提供发酵中的能量。在发酵中，一种有机化合物(能量源)起到电子供体的作用，而另一有机化合物是电子受体。各种有机底物，如糖类、氨基酸、嘌呤和嘧啶都可以用于发酵。在一方面，本发明涉及能够进行产生乙醇的糖发酵的生物体，如酵母。
在葡萄酒发酵中，葡萄汁的培养条件来源于用作原料的果汁。例如，葡萄汁的主要组分是葡萄糖(通常约75-150g/l)、果糖(通常约75-150g/l)、酒石酸(通常约2-10g/l)、苹果酸(通常约1-8g/l)和游离氨基酸(通常约0.2-2.5g/l)。但是，在主要反应是将糖类转化为乙醇的方法中，实际上可以将任意水果或含糖的植物体汁液加工为醇饮料。
葡萄酒酵母通常在约3.2至4.5的pH范围内生长和发酵，并且需要约0.85的最小水活性(或者约88％的相对湿度)。可以让发酵自发进行，或者可以通过用先前已发酵的葡萄汁接种来起始发酵，在这种情况下，可以用约106到约107cfu/ml果汁的酵母群体接种果汁。可以给葡萄汁通气以增大酵母群体。一旦发酵开始，二氧化碳的快速产生通常将维持厌氧条件。发酵的温度通常是10℃-30℃，发酵的持续时间可以例如从几天延长至几周。
在一个方面，本发明提供能够降低发酵醇饮料中的氨基甲酸乙酯浓度的酵母菌株。例如，本发明可以用于提供具有小于40ppb(μg/L)、35ppb、30ppb、25ppb、20ppb、15ppb、10ppb或5ppb(或50ppb和1ppb间的任意整数值)的氨基甲酸乙酯浓度的葡萄酒。在其他实施方案中，本发明可以用于提供具有小于约500ppb、400ppb、300ppb、200ppb、150ppb、100ppb、90ppb、80ppb、70ppb、60ppb、50ppb、40ppb、30ppb、20ppb或10ppb(或500ppb和10ppb间的任意整数值)的氨基甲酸乙酯浓度的强化(fortified)葡萄酒或蒸馏酒精。
在其他实施方案中，本发明可以提供能够在葡萄汁中维持降低的尿素浓度的酵母菌株。例如，尿素浓度可以维持在约15mg/l、10mg/l、5mg/l、4mg/l、3mg/l、2mg/l或1mg/l以下。
在一方面，本发明提供筛选在发酵条件下具有期望水平的尿素降解活性的发酵生物体的天然突变体的方法。例如，可以筛选缺少DUR3的NCR的酵母菌株。酵母突变和筛选方法的实例参见2000年10月31日发给Mortimer等的美国专利号6,140,108。在这类方法中，可以用诱变剂如乙基甲磺酸、亚硝酸或羟胺处理酵母菌株，产生具有碱基对取代的突变体。可以例如通过在适合的培养基上涂板来筛选具有改变的尿素降解活性的突变体。
在其他实施方案中，可以利用定点诱变改变宿主中尿素转运或尿素降解活性的水平。例如，可以利用定点诱变从酵母启动子，如DUR3或DUR1，2启动子除去NCR介导元件。例如，可以通过取代来缺失或修饰如图4中所示的天然DUR1，2启动子序列中的GATAA(G)框。在一个实施方案中，例如，可以通过将G取代为T来修饰一个或两个GATAA框，这样序列变为TATAA。定点诱变的方法公开于例如Rothstein，1991；Simon和Moore，1987；Winzeler等，1999；和Negrittoet等，1997中。在其他实施方案中，也可以突变编码在酿酒酵母中介导NCR的Gln3p和Gat1p的基因以调节NCR。然后可以将缺乏NCR的筛选或改造的启动子有效连接至DUR3编码序列，以在发酵条件下介导DUR3的表达。
可以相对于非转化的亲本菌株测量本发明酵母菌株的相对尿素转运或降解酶活性。例如，可以筛选本发明的转化的酵母菌株，以在发酵条件下具有高于亲本菌株的尿素转运或降解活性，或者在相同发酵条件下，活性以一定比例高于亲本菌株的活性，如活性为亲本菌株活性的至少150％、200％、250％、300％、400％或500％。类似地，可以利用类似的活性倍数，相对于衍生自本发明重组核酸的非重组序列测定由本发明重组核酸表达或编码的酶的活性。
在本发明的一方面，可以提供包含具有DUR3编码序列或其同源物的重组核酸分子的载体，该核酸分子处于介导DUR3多肽的受调节表达的异源启动子序列的控制下。为了提供这类载体，可以将来源于酿酒酵母的DUR3可读框(ORF)插入含有可调节重组DUR3基因表达的表达盒的质粒中。可以将重组分子引入选定的酵母菌株以提供具有改变的尿素转运活性的转化菌株。在其他实施方案中，也可以通过用另一个启动子置换天然启动子来影响宿主，如酿酒酵母中天然DUR3编码序列同源物的表达。也可以用其他调节元件来构建利用内源编码序列的重组表达盒。可以将重组基因或表达盒整合进入宿主如酿酒酵母的染色体DNA中。
可以从适合的天然酿酒酵母启动子筛选用于本发明的其他实施方案中的启动子，如PGK1或CAR1启动子。这类启动子可以与其他调节元件如PGK1或CAR1终止子一起使用。可以使用各种天然或重组启动子，其中筛选或构建启动子以在选定的条件，如酿酒条件下介导尿素降解活性，如DUR1，2p活性的表达。例如，可以将各种组成型启动子有效连接至DUR3编码序列。
根据本发明的一个方面，提供发酵糖类的方法，如发酵葡萄酒的方法，该方法使用宿主，如用调节该宿主尿素转运(摄取)活性的重组核酸转化的酵母菌株。例如，在酿造葡萄酒的酵母菌株中，可以调节DUR3基因的NCR以增强尿素的摄取。根据本发明的该方面，可以利用酵母菌株进行葡萄汁发酵，以引起有限量的氨基甲酸乙酯产生。
尽管本文公开了本发明的各种实施方案，但是可以根据本领域技术人员的常识在本发明范围内进行许多改变和修改。这类修改包含为了以基本相同的方式达到相同的效果而用已知等同物取代本发明的任意方面。数字范围包含定义该范围的数字。在此说明书中，词语“包含”用作开放式术语，基本上等同于短语“包含但不限于”，并且词语“包括”具有相应的意义。本文对参考文献的引用不应理解为承认这类参考文献是本发明的现有技术。本说明书中引用的所有出版物(包含但不限于专利和专利申请)在此引用作为参考，就如每一单个出版物被明确和单独地说明在此引用作为参考并如同在此进行了充分陈述。本发明包含基本上如前文所述并参考实施例和附图的所有实施方案和变体。
在本发明的一个实施方案中，提供转化以在发酵条件下降低尿素转运蛋白表达的氮分解代谢物阻抑的酵母菌株。例如，该尿素转运蛋白可以由DUR3编码，且该尿素转运蛋白可以是DUR3p。
在本发明的另一实施方案中，提供转化以在发酵条件下降低尿素转运蛋白表达和尿素降解酶表达二者的氮分解代谢物阻抑的酵母菌株。该尿素转运蛋白可以由DUR3编码，而该尿素降解酶可以由DUR1，2编码，且该尿素转运蛋白可以是DUR3p，而该尿素降解酶可以是尿素羧化酶/脲基甲酸酯水解酶。
在本发明的另一实施方案中，提供已转化以在发酵条件下不断摄取尿素的酵母菌株。该酵母可以例如组成型表达DUR3。
在本发明的另一实施方案中，提供已转化以在发酵条件下不断摄取尿素并同时降解尿素的酵母菌株。其中该酵母菌株可以组成型表达DUR1，2和DUR3二者。
在本发明的另一实施方案中，提供用于修饰酵母菌株的方法，其包括转化该酵母菌株以在发酵条件下降低尿素转运蛋白表达的氮分解代谢物阻抑。该尿素转运蛋白可以例如由DUR3编码，且该尿素转运蛋白可以是DUR3p。
在本发明的另一实施方案中，提供用于修饰酵母菌株的方法，其包括转化该酵母菌株以在发酵条件下降低尿素转运蛋白表达和尿素降解酶表达的氮分解代谢物阻抑。该尿素转运蛋白可以由DUR3编码，而该尿素降解酶可以由DUR1，2编码，且该尿素转运蛋白可以是DUR3p，而该尿素降解酶可以是尿素羧化酶或脲基甲酸酯水解酶。
在本发明的另一实施方案中，提供用于修饰酵母菌株以组成型表达DUR3的方法。该方法可以包括将1/2TRP1-PGKp-DUR3-PGKt-kanMX-1/2TRP1盒整合入TRP1基因座。备选地，该方法可以包括用包含编码DUR3p的编码序列的重组核酸转化该酵母菌株。备选地，该方法可以包括用包含不受氮分解代谢物阻抑的启动子的重组核酸转化该酵母。
在本发明的另一实施方案中，提供用转化以在发酵条件下降低尿素转运蛋白表达的氮分解代谢物阻抑的酵母菌株产生发酵饮料或食品的方法。该尿素转运蛋白可以由DUR3编码，且该尿素转运蛋白可以是DUR3p。
在本发明的另一实施方案中，提供用转化以在发酵条件下降低尿素转运蛋白表达和尿素降解酶表达二者的氮分解代谢物阻抑的酵母菌株产生发酵饮料或食品的方法。该尿素转运蛋白可以由DUR3编码，而该尿素降解酶可以由DUR1，2编码。该尿素转运蛋白可以是DUR3p，而该尿素降解酶可以是尿素羧化酶或脲基甲酸酯水解酶。
在本发明的另一实施方案中，提供组成型表达DUR3以降低发酵饮料或食品中氨基甲酸乙酯浓度的转化的酵母菌株的用途。
在本发明的另一实施方案中，提供组成型表达DUR1，2和DUR3二者以降低发酵饮料或食品中氨基甲酸乙酯浓度的转化的酵母菌株的用途。
在本发明的另一实施方案中，提供组成型表达DUR3以产生具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯浓度的葡萄酒的转化的酵母菌株的用途。
在本发明的另一实施方案中，提供组成型表达DUR1，2和DUR3二者以产生具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯浓度的葡萄酒的转化的酵母菌株的用途。
在本发明的另一实施方案中，提供用组成型表达DUR3的转化的酵母菌株产生的具有降低的氨基甲酸乙酯浓度的发酵饮料或食品。
在本发明的另一实施方案中，提供用组成型表达DUR1，2和DUR3二者的转化的酵母菌株产生的具有降低的氨基甲酸乙酯浓度的发酵饮料或食品。
在本发明的另一实施方案中，提供用组成型表达DUR3的转化的酵母菌株产生的具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯浓度的葡萄酒。
在本发明的另一实施方案中，提供用组成型表达DUR1，2和DUR3二者的转化的酵母菌株产生的具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯浓度的葡萄酒。
实施例
在此参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。实施例后是所使用的实验方法的描述。实施例1：
酿酒酵母葡萄酒菌株中DUR3基因的克隆和组成型表达。
用抗生素抗性标记kanMX进行克隆筛选。转化了酵母菌株UCDavis 522(Montrachet)、Prise de Mousse(EC1118)和K7-01(清酒酵母)以组成型表达DUR3或DUR1，2和DUR3二者。广泛的测试表明，转化的酵母基本上等同于其亲本菌株。这表示，预期的DUR3或DUR1，2和DUR3二者的组成型表达是唯一的遗传和代谢修饰。实施例2：
用DUR3基因盒转化酵母。
用包含PGK1启动子和终止子信号控制下的DUR3基因的重组核酸转化酵母。PGK1启动子不受NCR。DUR3基因盒-1/2TRP1-PGKp-DUR3-PGKt-kanMX-1/2TRP1。实施例3：
用重组酵母进行发酵研究以确立降低的氨基甲酸乙酯的出现。
DUR3的组成型表达产生酵母菌株，其不仅重吸收作为精氨酸代谢的副产物排泄的尿素，还吸收天然存在于葡萄汁中的尿素。在暴露于522DUR3酵母菌株的葡萄酒中观察到氨基甲酸乙酯的显著降低(～81％)，暴露于K7DUR3和PDMDUR3酵母菌株后分别观察到25％和13％的降低(数据在表1中)。还已显示，组成型表达DUR3的酵母与组成型表达DUR1，2的酵母同样有效地降低氨基甲酸乙酯浓度。
在552和K7酵母菌株中，DUR1，2和DUR3都组成型表达的组合将氨基甲酸乙酯降低至大约与DUR1，2或DUR3单独组成型表达相同的程度。但是，PDMEC-DUR3(DUR1，2和DUR3)是能够将葡萄酒葡萄汁中的氨基甲酸乙酯降低至大于PDMDUR3(DUR3)或PDMEC(DUR1，2)菌株单独的程度的酵母菌株的实例。实施例4：
允许除去选择标记的自身克隆盒。
图9和10显示允许筛选转化酵母和随后通过同向重复的重组除去抗生素抗性标记的DUR3遗传盒leu2-PGK1p-kanMX-PGKp-DUR3-PGK1t-leu2，其按下文所述在本实施例中使用。
用包含PGK1启动子和终止子信号控制下的DUR3基因的重组核酸转化酵母，该重组核酸允许筛选转化酵母和随后通过同向重复的重组除去抗生素抗性标记。该PGK1启动子不受NCR。DUR3基因盒-leu2-PGK1p-kanMX-PGKp-DUR3-PGK1t-leu2。用leu2-PGK1p-kanMX-PGKp-DUR3-PGK1t-leu2盒转化了4个菌株：CY3079、Bordeaux Red和DUR1，2转化的菌株D80ec-和D254ec-。这产生了D254ec-的55个菌株、D80ec-的125个菌株、Bordeaux Red的约200个菌株和CY3079的约300个菌株。每个菌株选择约20-60个克隆进行微发酵(mini-fermentation)以测定EC降低。在实验室条件下2个CY3079克隆具有94.2％和46.5％的EC降低；3个Bordeaux Red克隆具有57.6％-64.9％的EC降低；D80ec-克隆具有60.8％-66.1％的EC降低；和2个D254ec-克隆具有87.5％和75.1％的EC降低。用于以上实施例的实验方法
pHVX2D3的构建
为了将DUR3置于组成型PGK1启动子和终止子信号的控制下，将DUR3 ORF克隆入pHVX2。使用包含构建入它们的5’末端的Xho1限制酶位点的以下引物，从522基因组DNA扩增DUR3 ORF：DUR3forXho1(5′-AAAACTCGAGATGGGAGAATTTAAACCTCCGCTAC-3′)(SEQ ID NO：1)DUR3revXho1(5′-AAAACTCGAGCTAAATTATTTCATCAACTTGTCCGAAATGTG-3′)(SEQ ID NO：2)。
PCR、0.8％琼脂糖凝胶显示和PCR净化(Qiagen，美国-PCR纯化试剂盒)后，用Xho1(Roche，德国)消化PCR产物(插入片段)和pHVX2(载体)二者。用SAP(Fermentas，美国)处理消化的载体以防止再环化后，在22℃连接插入片段和线性化的SAP处理的载体(T4 DNA连接酶-Fermentas，美国)过夜；用连接混合物(5μl)转化DH5αTM感受态细胞(Invitrogen，美国)，随后在补充100μg/mL氨苄青霉素(Fisher，美国)的LB(Difco，美国)平板上培养。收集源自随机选择的转化体菌落的质粒(Qiagen，美国-QIAprep Spin Miniprep试剂盒)并通过EcoR1(Roche，德国)消化；用内部-外部引物进行PCR以鉴定具有期望的插入片段的质粒。将产生的包含PGK1p-DUR3-PGK1t的质粒命名为pHVX2D3。
pHVXKD3的构建
通过用Xho1和Sal1(Fermentas，美国)双消化从pUG6获得kanMX标记。消化后，凝胶纯化(Qiagen，美国-凝胶提取试剂盒)1500bp的kanMX条带并连接入线性化的SAP处理的pHVX2D3的Sal1位点。用连接混合物(5μl)转化培养在LB-氨苄青霉素(100μg/mL)上的DH5αTM感受态细胞。通过从24个随机选择的菌落分离的质粒的HindIII(Roche，德国)消化来鉴定重组质粒。将产生的包含PGK1p-DUR3-PGK1t-kanMX的质粒命名为pHVXKD3。
pUCTRP1的构建
用各自在它们的5’末端包含BamH1和后面的Apa1位点的TRP1特异性引物，从522基因组DNA PCR扩增TRP1编码序列：BamH1Apa1TRP1ORFfwd(5′-AAAAAAGGATCCAAAAAAGGGCCCATGTCTGTTATTAATTTCACAGG-3′)(SEQ ID NO：3)BamH1Apa1TRP1ORFrev(5′-AAAAAAGGATCCAAAAAAGGGCCCCTATTTCTTAGCATTTTTGACG-3′)(SEQID NO：4).。
扩增、净化和定量后，将～750bp的片段连接入线性化的SAP处理的pUC18的BamH1(Roche，德国)位点。最初通过蓝/白筛选(在补充50μg/mL Xgal的LB-氨苄青霉素上培养)和随后通过HindIII/EcoR1消化确认来鉴定重组质粒。产生的包含TRP1的质粒称为pUCTRP1。
pUCMD的构建
用盒特异性引物从pHVXKD3质粒DNA扩增位于pHVXKD3内的PGK1p-DUR3-PGK1t-kanMX盒：pHVXKfwdlong(5′-CTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAG-3′)(SEQ ID NO：5)pHVXKrevlong(5′-CTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGG-3′)(SEQ ID NO：6).。
扩增、净化和定量后，为了便于连接入线性化的SAP处理的pUCTRP1的平端EcoRV(Fermentas，美国)位点，用多核苷酸激酶(New England Biolabs，美国)处理PCR产生的～6500bp的平端片段。
最初用E-lyse分析鉴定重组质粒，然后通过Apa1(Stratagene，美国)/Sal1消化确认。简言之，通过在琼脂糖凝胶的孔内裂解菌落，然后进行电泳，E-lyse有效地针对质粒DNA的存在筛选大量菌落。更具体而言，在选择性培养基上成斑块后，将菌落的小等份试样悬于5μl TBE缓冲液中，然后与10μl SRL缓冲液(25％ v/v蔗糖、50μg/mLRNA酶、1mg/mL溶菌酶)混合。通过吹吸混合后，将细胞悬液上样至0.2％(w/v)SDS-0.8％(w/v)琼脂糖凝胶的孔内。孔内细胞悬液变得澄清表明细胞裂解(～30分钟)后，将DNA在20V电泳45分钟，然后在80V电泳45分钟。最后按需要用SYBRTM Safe(Invitrogen，美国)对凝胶进行染色。
线性DUR3盒转化进入酿酒酵母并筛选转化体。
用Apa1(Stratagene，美国)从pUCMD切割6536bp的DUR3盒并在0.8％琼脂糖凝胶上显示。从凝胶分离并提取(Qiagen，美国-凝胶提取试剂盒)预期的6536bp的条带。提取、净化并用Nanodrop ND-1000分光光度计(Nanodrop，美国)定量后，用250ng线性盒转化酿酒酵母菌株522，522EC-、PDM、PDMEC-、K7和K7EC-。用醋酸锂/聚乙二醇/ssDNA法转化酵母菌株。转化后，在涂布于补充300μg/mL G418(Sigma，美国)的YPD平板上之前，将细胞在YPD中于30℃恢复2小时。将平板在30℃孵育至菌落出现。
Calona Chardonnay
从Calona Vineyards、Okanagan Valley获得未过滤的Chardonnay葡萄汁(23.75白利糖度、pH 3.41、氨91.6mg/L、FAN 309.6mg/L)并用于修饰的酵母的接种。将来自新划线培养的YPD平板的亲本菌株(522、PDM、K7和K9)以及适当的功能增强的菌株的单菌落接种入5mL YPD并培养过夜(30℃-旋转轮)。将细胞传代培养至50mL YPD(OD600＝0.05)中并再次培养过夜(30℃-180转/分钟水浴摇床)。通过离心(5000转/分钟、4℃、5分钟)收集细胞并用50mL无菌水洗涤一次。将细胞沉淀悬于5mL无菌水中并测量OD600。用细胞悬液接种装有200mL从Calona Vineyards，Kelowna，BC，加拿大获得的未过滤的Chardonnay葡萄汁的无菌的250mL Schott瓶至最终OD600＝0.1。用装有无菌水的灭菌(70％v/v乙醇)蒸汽塞在无菌条件下密封瓶子。在20℃孵育密封瓶，并每天称重以监测CO2产生。在Excel中对数据作图以产生发酵谱。在发酵结束时，通过离心(5000转/分钟、4℃、5分钟)除去细胞，并将～50mL葡萄酒倒入无菌的50mL Schott瓶中。在70℃水浴中孵育瓶子整48小时以最大化EC产生，然后保存在4℃直至进行GC/MS分析。
通过SPME和GC-MS定量葡萄酒中的氨基甲酸乙酯。
将Chardonnay葡萄酒在70℃加热48小时以刺激氨基甲酸乙酯产生。将10mL葡萄酒样品吸入20mL的样品小管。加入小磁力搅拌棒和3克NaCl并用PTFE/硅氧烷膜(septan)盖上小管。将小管放在22℃的搅拌器上并搅拌使其平衡15分钟。使用前将SPME纤维(65μm碳蜡(carbowax)/二乙烯基苯)在250℃调节30分钟。样品平衡后，将纤维插入液面上空间。30分钟后，将纤维从样品小管移出并插入注射口15分钟。每个样品运转前进行空白运转。用外标法进行定量。在包含12％(v/v)乙醇和1mM酒石酸(pH 3.1)的蒸馏H2O中，按0.1mg/mL制备氨基甲酸乙酯(Sigma-Aldrich，Milwaukee，WI)标准贮存液。用5、10、20、40、90μg/L的EC浓度制备校准标准。该标准溶液于4℃保存在冰箱中。用Agilent 6890N GC作为界面的5973N Mass Selective Detector定量葡萄酒中的氨基甲酸乙酯。使用60m x 0.25mm内径、0.25μm厚度的DBWAX熔凝硅石空心柱(J&W Scientific，Folsom，CA)。载气是36cm/秒恒流的超高纯度氦。注射器和输送线(transfer line)温度设在250℃。烘箱温度最初设在70℃2分钟，然后按8℃/分钟升至180℃并保持3分钟。然后按程序将温度按20℃/分钟提高至220℃，并在220℃保持15分钟。总运行时间是35.75分钟。注射模式是无分流5分钟(清洗流：5mL/分钟，清洗时间：5分钟)。用电子碰撞离子化以选择性离子监测(SIM)模式操作MS；MS quad温度150℃，MS源温度230℃。溶剂延迟为8分钟。用100毫秒的停留时间监测到特异性离子44、62、74、89。用质量62针对可靠的EC标准的质谱进行定量。
发酵谱显示在图8中，由功能增强的菌株和对照菌株产生的乙醇的最终量显示在表2中。表1
酿制葡萄酒的过程中氨基甲酸乙酯降低的总结。通过GC/MS定量由清酒酵母菌株(K7、K7EC-(8)、K7DUR3、K7EC-DUR3)和葡萄酒酵母菌株(522、522EC-、522DUR3、522EC-DUR3、PDM、PDMEC-、PDMDUR3、PDMEC-DUR3)从未过滤的Calona Chardonnay葡萄汁产生的Chardonnay葡萄酒中的氨基甲酸乙酯(μg/L)。在20℃孵育发酵至完成(～300小时)。EC-DUR1，2的组成型表达DUR3DUR3的组成型表达EC-DUR3组合的DUR1，2和DUR3的组成型表达
Figure BPA00001276299400231
表2
Chardonnay葡萄酒中由葡萄酒酵母菌株(522、522DUR1，2[522EC-的另一种命名]、522DUR3和522DUR1，2/DUR3[522EC-DUR3的另一种命名])产生的乙醇。发酵结束时通过LC测量乙醇含量(％v/v)。发酵谱在图3中给出。用双因素方差分析对数据进行统计显著性(p≤0.05)分析。
Figure BPA00001276299400241
S：在p≤0.05显著，n：不显著

Claims (28)

1.酵母菌株，其已转化，以在发酵条件下降低尿素转运蛋白蛋白质的基因表达的氮分解代谢物阻抑。
2.权利要求1的酵母菌株，其中所述尿素转运蛋白由DUR3编码。
3.权利要求1的酵母菌株，其中所述尿素转运蛋白是DUR3p。
4.权利要求1至3中任一项的酵母菌株，其进一步转化，以在发酵条件下降低尿素降解酶的基因表达的氮分解代谢物阻抑。
5.权利要求4的酵母菌株，其中所述尿素降解酶由DUR1，2编码。
6.权利要求4的酵母菌株，其中所述尿素降解酶是尿素羧化酶/脲基甲酸酯水解酶或尿素酰胺裂合酶。
7.权利要求1至6中任一项的酵母菌株，其进一步转化，以在发酵条件下不断摄取尿素。
8.权利要求7的酵母菌株，其中已转化所述酵母以组成型表达DUR3。
9.权利要求4的酵母菌株，转化其以在发酵条件下不断摄取并不断降解尿素。
10.权利要求9的酵母菌株，其中转化所述酵母菌株以组成型表达DUR1，2和DUR3。
11.用于修饰酵母菌株的方法，其包括转化所述酵母菌株以在发酵条件下降低尿素转运蛋白的基因表达的氮分解代谢物阻抑。
12.权利要求11的方法，其中所述尿素转运蛋白由DUR3编码。
13.权利要求11的方法，其中所述尿素转运蛋白是DUR3p。
14.权利要求11、12或13的方法，其中其进一步转化所述酵母菌株，以在发酵条件下降低尿素降解酶的基因表达的氮分解代谢物阻抑。
15.权利要求14的方法，其中所述尿素降解酶由DUR1，2编码。
16.权利要求14的方法，其中所述尿素降解酶是尿素羧化酶、脲基甲酸酯水解酶或尿素酰胺裂合酶。
17.权利要求11至16中任一项的方法，其中转化所述酵母菌株以组成型表达DUR3。
18.权利要求11至17中任一项的方法，其中用包含编码DUR3p的编码序列的重组核酸转化所述酵母菌株。
19.权利要求18的方法，其中将所述编码DUR3p的编码序列有效连接至不受氮分解代谢物阻抑的启动子。
20.产生发酵饮料或食品的方法，其包括在发酵条件下维持权利要求1至10中任一项的酵母菌株，以产生具有降低的氨基甲酸乙酯浓度的发酵饮料或食品。
21.权利要求1至10中任一项的转化的酵母菌株的用途，其用于产生具有降低的氨基甲酸乙酯浓度的发酵饮料或食品。
22.权利要求20的方法，其中所述发酵饮料或食品具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯浓度。
23.权利要求21的用途，其中所述发酵饮料或食品具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯浓度。
24.权利要求20或22的方法，其中所述发酵饮料或食品是葡萄酒。
25.权利要求21或23的用途，其中所述发酵饮料或食品是葡萄酒。
26.具有降低的氨基甲酸乙酯浓度的发酵饮料或食品，其使用权利要求1至10中任一项的转化的酵母菌株产生。
27.权利要求26的发酵饮料或食品，其是葡萄酒。
28.权利要求27的葡萄酒，其具有低于30ppb的氨基甲酸乙酯浓度。
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