CN102492633B

CN102492633B - 具有降解氨基甲酸乙酯功能的胶红酵母及其在酒类及食品中的应用

Info

Publication number: CN102492633B
Application number: CN2011103950445A
Authority: CN
Inventors: 徐岩; 吴群
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Huzhou Laohenghe Brewing Co., Ltd.
Priority date: 2011-12-02
Filing date: 2011-12-02
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2031-12-02
Also published as: CN102492633A

Abstract

具有降解氨基甲酸乙酯功能的胶红酵母及其在酒类及食品中的应用，属于生物工程技术领域。氨基甲酸乙酯Ethylcarbamate，简称EC，又称Urethane。本发明提供的一株降解氨基甲酸乙酯EC的酵母菌株，其分类命名为胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo：5081。该菌株来源于中国白酒酿造大曲、黄酒麦曲、健康小鼠粪便以及灌胃EC的小鼠粪便，其能够以EC为唯一碳源生长，最终将EC分解为无毒害的NH₄ ⁺、C₂H₅OH和CO₂；该菌株可用于酿造酒，蒸馏酒，配制酒以及其它食品领域，降低其中的EC含量，提高食品安全性。

Description

具有降解氨基甲酸乙酯功能的胶红酵母及其在酒类及食品中的应用

技术领域

本发明涉及一株能够降解氨基甲酸乙酯的胶红酵母，以及一种通过酶法降解酒类及食品中氨基甲酸乙酯，以提高食品安全性的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，简称EC，又称Urethane)，是烟草叶及香烟的天然成分，也是发酵食品(如面包，酸奶，乳酪等)和酒精饮品(如葡萄酒、白兰地、威士忌、果酒、中国黄酒和日本清酒等)的伴随产物。它能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。自2002年以来，EC已经成为世界卫生组织重点监控物质之一。人类从膳食中摄入的氨基甲酸乙酯，主要来自发酵食品和饮品，其中酒精饮品是已知的氨基甲酸乙酯主要来源。根据公布的2005年2月在意大利罗马召开的JECFA(联合食品添加剂专家委员会)第64次会议对EC的MOE(暴露最大限量，Margin of Exposure)讨论的结论认为，加上酒精饮品后的EC食品总摄入量存在风险，因此应该继续进行降低酒类食品中EC含量的努力。2007年4月10日，世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)正式将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物，与丙烯酰胺同等危险，美国国家毒理计划将其列入“有理由预料引起癌症的物质”名单。因此如何降低酒精饮品中EC的含量正逐渐受到研究人员的重视。

对EC的研究始于20世纪中期，1943年，Nattleship等人就证明其潜在的致癌作用，1971年，Lofroth和Gcjval在发酵食品中发现了EC，1976年，Ough发现酒精饮品中含有EC。由于EC的致癌作用，世界卫生组织对软饮料中EC制定了限量标准。1985年，加拿大报道了某些酒中EC含量高，同年加拿大政府的卫生与福利组织规定了各类酒中的EC限量标准：佐餐葡萄酒30μg/L，强化葡萄酒100μg/L，蒸馏酒150μg/L，烈性酒、水果白兰地400μg/L，日本清酒100μg/L。美国的葡萄酒工业也对葡萄酒中EC含量做出了限定：佐餐葡萄酒15μg/L，餐后甜葡萄酒60μg/L。

国内外很多研究学者对葡萄酒和黄酒等酒精饮品的生产过程中EC的形成做了很多研究报道，主要的形成途径有4类：焦碳酸二乙酯同氨反应形成氨基甲酸乙酯；氨基甲酸磷酸同乙醇反应；尿素同乙醇反应；瓜氨酸与乙醇反应。其中尿素与乙醇的反应被认为是EC的主要形成途径。

目前对于酒精饮品中EC含量控制问题的研究，主要集中于酸性脲酶的使用以及低产尿素酿酒酵母的选育，旨在通过前体尿素的降低来达到控制EC含量的目的。中国新型黄酒工艺也积极通过煎酒温度与时间的控制来控制EC。然而，这些都不能从根本上解决酿造酒中EC的污染问题，EC一经形成，就极稳定，不能被脲酶降解，所以对于已经形成的EC，目前的方法就显得束手无策。因此利用微生物酶法降解EC的研究迫在眉睫，开发微生物合成的EC降解酶，实现其有效应用，对于提高酿造食品安全性具有重要的作用。

发明内容

针对现有技术难点及存在的问题，本发明的目的在于提供一株能够用于酒类及发酵食品中EC去除的胶红酵母菌株。本发明所述的菌株能够通过微生物酶的生物催化作用，在乙醇浓度0～20%，糖浓度0～400g/L，及pH 3.5-11.0的环境中以分解EC的方式达到提高酒类及食品安全性的目的。

本发明的技术方案：一株降解EC的酵母菌株，其分类命名为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：5081。

所述的胶红酵母，其具体筛选步骤如下：(1).将一定量待分离样品中国白酒大曲、黄酒麦曲及小鼠粪便于装有玻璃珠的适量无菌生理盐水中震荡打散，取一定量接种于50mL以EC为唯一碳源的无机盐培养基中富集，进行摇床震荡培养，温度30℃，转速150r·min^-1；当菌液变得浑浊时，进行下一次转接，经过连续驯化培养，最终得到能以EC为唯一碳源的稳定菌液。(2).将(1)中所得菌液在以EC为唯一碳源，另外添加指示剂的固体培养基上进行稀释涂布，挑取能形成变色圈的单菌落作为初筛菌株。(3).将上述初筛菌株进行液态发酵，采用GC-FID方法检测EC降解情况，考察、比较各菌的降解效果，选取EC浓度较低的菌株作为复筛菌株。(4).将上述复筛菌株接种于改进的YPD培养基中，30℃摇床震荡培养72h，取一定量发酵液离心收集菌体，经生理盐水与缓冲液充分洗涤，进行酶活测定。最终得到一株能够高效降解EC的胶红酵母菌株。

所述的胶红酵母菌株CGMCC No：5081，具有耐酒精、耐高渗透压、生长温度范围与生长pH范围广等特性，方便了实际酒体环境中的应用。其菌株生长温度范围为4～37℃；生长pH范围为2.0～12.0；可在分别含400g/L的葡萄糖、2.0mol/L KCl以及6%（v/v）C₂H₅OH的环境中生长。其形态特征：在YPD平板上长出的菌落呈橙红色，菌落粘稠、湿润，表面突起、无褶皱、边缘整齐；在WL平板上长出的菌落与YPD平板形态相似，产酸少。显微镜观察细胞呈卵形至椭圆形，大小为(1.8-5.0)×(2.4-6.1)μm。扫描电镜下，细胞呈椭球状，不形成子囊孢子。

所述具EC降解功能的胶红酵母产EC降解酶的培养条件：碳源可为碳水化合物，脂肪酸，有机酸等；氮源可为有机氮源(如酵母膏，蛋白胨，棉籽粉，麦芽汁，玉米浆等)和无机氮源(如硫酸铵，硝酸铵，磷酸铵，氯化铵等)；另外添加氨基甲酸乙酯或者其类似物如氨基甲酸甲酯，氨基甲酸丙酯，或者酰胺类化合物如甲酰胺，乙酰胺，丁酰胺，乳酰胺，N-甲基乙酰胺，青霉素钠等。培养方式可为静置培养或振荡培养，温度以25^oC -33^oC为宜，培养时间足够微生物的生长以及EC降解酶的产生。

所述的胶红酵母在酒类及食品中的应用，胶红酵母活细胞、冷冻干燥制得的干细胞、固定化细胞均能在乙醇浓度0～20%，糖浓度0～400g/L以及pH 3.5-11.0的环境中有效去除EC。

所述的胶红酵母在酒类及食品中的应用，其适用于各种酿造酒、蒸馏酒、配制酒的酿造工业和食品工业中EC的去除。

所述的胶红酵母在酒类及食品中的应用，用菌株制成的酶制剂处理样品，从而得到EC含量降低、安全性提高的酒类及食品。酒精饮品及食品中添加的EC降解酶酶量为0.1-20 U/L时即可达到较好的EC去除效果。

所述的胶红酵母在酒类及食品中的应用方法，可用于EC去除的酶制剂可为：活细胞，冷冻干燥得到的干菌体，固定化细胞，粗酶或者经过分离纯化的酶等一切形式的来自能够降解EC的胶红酵母CGMCC No：5081的酶制剂。

EC降解酶活性通过检测产物NH₄ ⁺的生成来表征。菌体超声破碎取上清液作为粗酶液待用。10mM EC，0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.0。反应以向300μL底物中加入200μL粗酶液开始，30℃水浴反应10min。 Berthelot反应测定产生的NH₄ ⁺。酶活定义为每分钟分解EC产生1μmol NH₄ ⁺的酶量为1个酶活单位。

本发明中用于EC去除的酶制剂最终可以通过过滤、离心等物理方式去除。

本发明的有益效果：本发明提供的胶红酵母通过微生物酶促反应实现EC的分解，改善了以往酒类及食品中对于已经形成的EC束手无策的局面；胶红酵母可在醇、糖、酸环境中有效降解EC。本发明提供的胶红酵母可作为生物解毒剂，添加到现有的含EC的酒精饮品中，使其更符合现代人们对健康理念的追求；例如可将清酒中EC控制在40μg/L以下，威士忌中EC低于60μg/L，葡萄酒中不高于15μg/L。同时，本发明提供的胶红酵母，对于其他不含酒精类饮品和发酵类食品中EC的去除也存在着广阔的应用潜力。

生物材料样品保藏：一株降解氨基甲酸乙酯EC的酵母菌株，其分类命名为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No：5081，保藏日期：2011年7月18日。

附图说明

图1 本发明的Rhodotorula mucilaginosa CGMCC No：5081菌株放大10000倍的电镜照片。

图2 本发明的Rhodotorula mucilaginosa CGMCC No：5081菌株在以EC为唯一碳源且EC初始浓度为5g/L条件下进行液态发酵时EC的降解曲线图，图中左侧纵坐标表示EC的回收率，单位为%。图中：—□—为刚接种完经灭活的对照组，—■—为接种了菌株Rhodotorula mucilaginosa CGMCC NO：5081的情况。

图3 本发明的Rhodotorula mucilaginosa CGMCC No：5081菌株全细胞降解EC反应体系中EC，以及产物NH₄ ⁺与C₂H₅OH浓度随时间的变化情况。图中左侧纵坐标表示反应体系中EC的浓度，单位为μmol/mL，右侧纵坐标表示NH₄ ⁺与C₂H₅OH浓度，单位为μmol/mL。图中：—■—代表EC浓度，—□—代表NH₄ ⁺浓度，—●—代表C₂H₅OH浓度。

具体实施方式

实施例1：

能够降解EC的胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CGMCC No：5081菌株的筛选

本发明涉及的菌株来源于生产‘口子窖’、‘郎酒’、‘今世缘’、‘茅台’等酱香型白酒生产大曲，‘古越龙山’、‘金枫’等黄酒麦曲，健康小鼠粪便以及灌胃EC的小鼠粪便(灌胃量为10mg/kg/d)。将一定量待分离样品于无菌生理盐水中震荡打散，取适量接种于50mL以EC为唯一碳源，另外添加无机盐的富集培养基中，30℃，150rpm摇床上震荡培养，当菌液变得浑浊时，进行下一次转接，经过连续驯化培养得到能以EC为唯一碳源的稳定菌液。在EC为唯一碳源另外添加指示剂的固体培养基上进行稀释涂布，挑选能形成变色圈的单菌落作为初筛菌株。之后采用GC-FID方法跟踪检测液态发酵过程中EC降解情况，考察、比较各菌的降解效果，选取EC浓度较低的上述菌株作为复筛菌株。

将上述复筛菌株接种于改进的YPD培养基中，30℃摇床培养72h，取一定量发酵液离心收集菌体，经生理盐水与缓冲液充分洗涤，进行酶活测定。最终筛选出具有较高EC降解能力的菌株，经鉴定为胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：5081。

实施例2：

菌株生理生化性质

菌株CGMCC No：5081不发酵糖类，可同化葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、半乳糖、D-木糖、D-核糖、琥珀酸、柠檬酸等多种碳源，不能同化肌醇，可同化硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等无机氮源，不能同化尿素。生长温度范围为4～37 ℃，适温为25～33 ℃；生长pH范围为2.0～12.0，优选4.0～8.0；可在分别含400g/L的葡萄糖、2.0 mol/L KCl以及6%乙醇的环境生长中。

实施例3：

胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CGMCC No：5081菌株好氧降解EC功能

（1）在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基，培养基成分为：酵母膏(1%)，蛋白胨(1%)，葡萄糖(2%)，磷酸二氢钾(0.25%)，磷酸氢二铵(1%)，硫酸铵(0.4%)，氯化钠(0.2%)，七水合硫酸镁(0.05%)，七水合硫酸锌(0.02%)，七水合硫酸亚铁(0.005%)，四水合硫酸锰(0.015%)。另外添加氨基甲酸乙酯或者其类似物如氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丙酯，或者酰胺类化合物如甲酰胺、乙酰胺、丁酰胺、乳酰胺、N-甲基乙酰胺、青霉素钠等，自然pH；将上述实施例1获得的CGMCC No：5081菌株进行接种，30℃，150rpm，进行好氧培养36-60小时；

（2）取上述（1）中培养好的菌液按体积比为4%的接种量接入装有100mL相同培养基的500mL的三角瓶中，30℃，150rpm，进行好氧培养，图2为胶红酵母对EC的降解情况。

实施例4：

菌株CGMCC No：5081全细胞用于中国黄酒中EC去除

（1）按上述实施例3培养方法获得CGMCC No：5081发酵液，离心收集细胞，测定其分解EC的酶活为0.4U/g干菌。

（2）将该细胞添加于市售的两种黄酒样品中，分别为半干型黄酒样品中(样品1：酒精度8%，EC含量88μg/L，pH 3.8)，与半甜型黄酒样品(样品2：酒精度14%，EC含量402μg/L，pH4.1)，样品2为向市售黄酒中额外添加部分EC制得，最终酶浓度均为2U/L，然后于30℃处理一周，结果见下表1所示。

表1 全细胞对黄酒中EC去除效果

样品	初始EC浓度(μg/L)	EC降解率(%)
			样品 1	88.51	33.53
样品 2	402.42	12.26

实施例5：

不同加酶量条件下黄酒中EC去除情况

（1）按上述实施例3培养方法获得CGMCC No：5081发酵液，离心收集细胞。

（2）将收集的细胞添加于同实施例4中市售的半干型黄酒样品中(酒精度8%，EC含量88μg/L，pH3.8)，最终酶浓度分别为2、4、6、10 U/L，然后于30℃处理一周，结果见下表2。

表2 不同加酶量对黄酒中EC去除效果

降解酶添加量(U/L)	2	4	6	10
					处理后EC浓度(μg/L)	83.22	56.13	47.29	40.67

实施例6：

菌株CGMCC No：5081固定化细胞用于不同酒精饮品中EC的去除

（1）CGMCC NO：5081培养方式如实施例3，所得的培养物经离心收集菌体，然后用生理盐水进行洗涤。

（2）取湿细胞2g悬浮于2mL生理盐水中，然后与20mL灭菌的海藻酸钠溶液（2%）混合，逐滴滴入氯化钙溶液中(2%)制成固定化细胞。

（3）该固定化细胞，经过滤，洗涤，取等量分别加入50mL待测日本清酒、中国黄酒、红葡萄酒、苹果酒、中国白酒、威士忌、白兰地样品中，然后于30℃放置30天，结果如下表3所示。

表3 固定化细胞对酒精饮品中EC去除效果

实施例7：

粗酶液用于葡萄酒样品中EC去除

菌株CGMCC No：5081培养方式如实施例3。经离心收集细胞，用含1mM EDTA，1mM DTT的0.1M的磷酸缓冲液（pH7.0）洗涤两次，重悬于相同的缓冲液中，超声进行破碎。破碎液经离心得到的上清液作为粗酶液，再经超滤进行浓缩。将浓缩后的粗酶液添加于某红葡萄酒样品中，EC含量218μg/L，通过向一种市售红葡萄酒样品(乙醇含量13%，pH3.4)中添加部分EC制得，降解酶终浓度为10U/L。30℃摇床处理，EC含量随处理时间的变化如下表4所示。

表4 粗酶液对红葡萄酒中EC去除效果

处理时间(d)	0	4	6	10	20
						EC浓度(μg/L)	218	124	96	74	58

Claims

1.一株降解氨基甲酸乙酯EC的酵母菌株，其分类命名为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：5081。

2.一种权利要求1所述具EC降解功能的胶红酵母产EC降解酶的培养方法，其特征在于：

（1）在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基，培养基成分为：酵母膏1%，蛋白胨1%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0.25%，磷酸氢二铵1%，硫酸铵0.4%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.05%，七水合硫酸锌0.02%，七水合硫酸亚铁0.005%，四水合硫酸锰0.015%；另外添加氨基甲酸乙酯或者其类似物：氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丙酯，或者酰胺类化合物：甲酰胺、乙酰胺、丁酰胺、乳酰胺、N-甲基乙酰胺、青霉素钠，自然pH；将CGMCC No：5081菌株进行接种，30℃，150rpm，进行好氧培养36-60小时；

（2）取上述（1）中培养好的菌液按体积比为4%的接种量接入装有100mL相同培养基的500mL的三角瓶中，30℃，150rpm，进行好氧培养。

3.如权利要求1所述的菌株CGMCC No：5081，其特征在于，该胶红酵母活细胞、冷冻干燥制得的干细胞、固定化细胞均能在乙醇浓度0～20%，糖浓度0～400g/L，及pH 3.5-11.0的环境中有效降解EC。

4.权利要求1所述的菌株CGMCC No：5081的应用方法，其特征在于菌株CGMCC No：5081在各种酿造酒、蒸馏酒、配制酒中用于EC的去除。