CN111593044A - 一种胶红酵母固定化细胞及其应用 - Google Patents
一种胶红酵母固定化细胞及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111593044A CN111593044A CN201910135061.1A CN201910135061A CN111593044A CN 111593044 A CN111593044 A CN 111593044A CN 201910135061 A CN201910135061 A CN 201910135061A CN 111593044 A CN111593044 A CN 111593044A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- immobilized
- cells
- concentration
- rhodotorula mucilaginosa
- immobilized cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 80
- 241000223254 Rhodotorula mucilaginosa Species 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 65
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 47
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims abstract description 32
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims abstract description 32
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims abstract description 32
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- -1 aromatic secondary alcohol Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 21
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 21
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 20
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical group [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 12
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 9
- 229920002582 Polyethylene Glycol 600 Polymers 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 claims description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 2
- 241000235395 Mucor Species 0.000 claims 1
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- 238000004064 recycling Methods 0.000 abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 89
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 16
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 14
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 14
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 7
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 7
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000010757 Reduction Activity Effects 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 6
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 6
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 6
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 5
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 4
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 4
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 3
- KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N Acetophenone Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC=C1 KWOLFJPFCHCOCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000329 aluminium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000007444 cell Immobilization Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- WAPNOHKVXSQRPX-ZETCQYMHSA-N (S)-1-phenylethanol Chemical compound C[C@H](O)C1=CC=CC=C1 WAPNOHKVXSQRPX-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N D-mannopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000010531 catalytic reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940057847 polyethylene glycol 600 Drugs 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001054 red pigment Substances 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种胶红酵母固定化细胞，它是由海藻酸钠作为固定介质、钙盐作为交联剂，将胶红酵母活细胞固定于所述固定介质和交联剂形成的凝胶中制备得到。本发明还提供了前述固定化细胞的制备方法。本发明还提供了一种合成芳香仲醇的方法，它是以前述固定化细胞作为催化剂、葡萄糖作为辅助底物，在水相或两相体系中催化不对称还原反应的方法。本发明能大幅提升胶红酵母将ACP还原成(S)‑1‑PEA的能力，并大幅提升胶红酵母的重复利用次数；相比游离酵母细胞具有十分巨大的优势，产业化前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，尤其涉及一种胶红酵母固定化细胞及其应用。
背景技术
手性芳香仲醇作为重要的药物中间体及手性砌块，在医药合成中起着重要的作用，而 酵母菌比较适合手性芳香仲醇的合成。但游离细胞不利于大规模生产，底物和产物对酵母 细胞具有一定的抑制作用，即便改善反应介质的条件下，仍旧存在细胞重复利用性不佳的 缺点。
有研究报道，对酵母细胞进行固定化可以减慢细胞的失活，即增加细胞的重复利用性， 反应结束后菌体与反应液的分离变得十分简单，避免了离心、萃取等烦琐程序，可以提高 产率，这也为今后放大到连续的反应器操作莫定了基础。
胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)是合成手性芳香仲醇的优良物种，它可以通过 不对称还原ACP(苯乙酮，模式底物芳香仲醇)成高立体选择性的(S)-1-PEA((S)-1-苯乙醇)。由于不同酵母对固定化的方式(包括固定化介质、介质浓度、细胞量、交联剂、 固定化时间等等参数)适应程度不用，固定化酵母细胞的生长状态、催化特定化学反应的 能力、可重复利用的次数均与固定化方式的各种细节息息相关。
目前尚未见胶红酵母固定化细胞生产手性芳香仲醇的报道，主要是因为固定化方式的 参数选择纷繁复杂，难以找到一个优良的参数组合。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种胶红酵母固定化细胞，它是由海藻酸钠作为固 定介质、钙盐作为交联剂，将胶红酵母活细胞固定于所述固定介质和交联剂形成的凝胶中 制备得到；
所述海藻酸钠的浓度是2％～4％，优选3％。
如前述的固定化细胞，所述胶红酵母是Rhodotorula mucilaginosa bs5-1。
如前述的固定化细胞，所述钙盐是氯化钙。
本发明还提供了如前所述的固定化细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)将海藻酸钠加入水中，加热溶解后冷却，得混合物；
(2)将步骤(1)得到的混合物与胶红酵母活细胞悬浊液混合，得混合物；
(3)将步骤(2)得到的混合物加入到形成凝胶所需的过量的钙盐溶液中，反应0.5～1h， 形成凝胶，优选地，反应0.5h。
如前述的固定化细胞制备方法，其特征在于：
所述钙盐是氯化钙，其浓度为1～3％(w/v)；优选地，氯化钙浓度为2％(w/v)；
和/或，所述氯化钙溶液的用量是：每30ml步骤(2)所得混合物加入到300～500ml的氯化钙溶液中。
如前述的固定化细胞制备方法，步骤(2)中，步骤(1)得到的混合物与胶红酵母活细胞悬浊液的体积比是1∶2。
如前述的固定化细胞制备方法，每100ml步骤(2)得到的混合物所含酵母细胞湿重为5～10g；优选地，每100ml步骤(2)得到的混合物所含酵母细胞湿重为8g。
本发明还提供了一种不对称还原手性芳香仲醇的方法，其特征在于，它是以如前所述 的固定化细胞作为催化剂、葡萄糖作为辅助底物，在水相或两相体系中催化手性芳香仲醇 反应的方法；
所述两相体系是PEG-600和水组成的两相体系。
如前述的合成手性芳香仲醇的方法，其特征在于：
单次反应时间是48h；
和/或，底物初始浓度为70mmol/L～175mmol/L，优选地，为70～105mmol/L。
如前述的不对称还原手性芳香仲醇的方法，所述水相体系中还包括吸附树脂；所述吸 附树脂具有吸附反应产物的能力芳香仲醇。
本发明使用海藻酸钙作为包埋剂，能使得到的胶红酵母固定化微粒具有较高的机械强 度、传质性能、稳定性，被固定的细胞活性与游离细胞无显著差别，其底物转化能力也相 对较高。本发明还提供了优良的细胞固定参数组合，包括合理的细胞载量、固定化介质(海 藻酸钠)浓度、交联剂(CaCl2)浓度、固定化时间的组合，使得底物转化率升高。进一 步地，本发明提供了优化后的反应时间、底物浓度、引入树脂的反应体系，大幅提高了底 物转化率以及固定化细胞的重复使用效率。
本发明能大幅提升胶红酵母将ACP还原成(S)-1-PEA的能力，并大幅提升胶红酵母的 重复利用次数。实验证明，当ACP的初始浓度为105mmol/L时，本发明的固定化细胞首 次催化反应时可达到60％以上的转化率，固定化细胞重复使用3次后仍能保证转化率高 于40％；相比之下，游离的胶红酵母在首次催化时的转化率不到30％。
本发明相比游离酵母细胞具有十分巨大的优势，产业化前景广阔。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本 发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理 解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属 于本发明的范围。
附图说明
图1：Ca-Alginate胶珠制备的反应过程。
图2：海藻酸钠浓度对bs5-1不对称还原反应的影响。
图3：固定化细胞中菌体载量对ACP不对称还原反应的影响。
图4：交联剂CaCl2浓度对BS5-1不对称还原反应的影响。
图5：固定化时间对bs5-1不对称还原反应的影响。
图6：bs 5-1的固定化细胞不对称还原ACP的时间进程。
图7：底物浓度对固定化酵母细胞不对称还原反应的影响。
图8：固定化细胞在水相、引入吸附树脂和PEG-600/水两相系统中催化不同底物浓度的反应情况。
图9：游离细胞和固定化细胞稳定性的比较。
具体实施方式
说明：本发明所涉及的百分比浓度，在未做特别说明时，均指质量体积比(w/v)，例如：2％的CaCl2溶液表示每100ml溶剂中含有2g CaCl2。
实验例 胶红酵母的固定
1材料与方法
1.1菌种
Rhodotorula mucilaginosa bs5-1。
1.2试剂
海藻酸钠(Sodium-Alginate，SA)、明胶、聚乙烯醇(PVA)、卡拉胶、戊二醛、Al2(SO4)3。
2方法
2.1固定化细胞的制备
2.1.1卡拉胶包埋法
将卡拉胶配制成一定浓度的水溶液，煮沸溶解，冷却至45℃左右，迅速和菌悬液混合后搅拌均匀(卡拉胶的终浓度为3％)，倾入浅盘，用0.3mol/L KCl溶液浸泡，于4℃ 下硬化4h，切块备用。
2.1.2明胶包埋法
将明胶配制成一定浓度的水溶液，煮沸溶解后冷却，与菌悬液混合搅拌均匀(8％明 胶，10％菌丝体，终体积30mL)后倾入浅盘，加入1％戊二醛交联凝固，切块于4℃下 硬化2h，滤出水洗备用。
2.1.3海藻酸钙包埋法
海藻酸钠(Na-Alg)是一种多糖，为甘露糖醛酸的低聚合体，有遇二价阳离子成凝胶的 性质。海藻酸钙凝胶包埋法正是利用这种性质，将一定浓度的Na-Alg水溶液滴加入CaCl2 水溶液中，Ca2+与Alg快速反应，在Alg液滴周围形成薄膜，随着Ca2+向Alg液滴内部迅速扩散，Alg完全变成凝胶，从而得到实心胶珠(Ca-Alginate bead)，此过程见图1。
具体方法：称取海藻酸钠加入去离子水中，加热溶解制成海藻酸钠溶液后冷却，再与 菌悬液搅拌混匀(3％(w/v)海藻酸钠，10％(w/v)菌丝体，终体积30mL)，然后用带 针头的注射器打入300-500mL 2％CaCl2溶液中，固定1h，用去离子水洗涤后待用。
2.1.4海藻酸铝包埋法
先制备海藻酸钙包埋法(同上)固定化细胞，去离子水洗涤后，移入2％Al2(SO4)3中于常温下搅拌1h，去离子水洗涤后待用。
2.1.5 PVA(聚乙烯醇)-海藻酸钙固定细胞的制备
将一定的PVA和海藻酸钠置于去离子水中加热溶解冷却，配制成的PVA和海藻酸钠的混合液再与菌悬液搅拌混匀(6％PVA，0.6％海藻酸钠，10％菌丝体，终体积30mL)， 然后用带针头的注射器针打入2％CaCl2溶液中，固定1h，用去离子水洗涤后待用。
2.2固定化细胞性能的检测
2.2.1机械强度的分析
(1)压力法：挑选大小均匀的固定化细胞颗粒，以胶珠的正面所能承受的最大压力来表征机械强度。
(2)破裂时间测定：将制得的凝胶小球置于装有50mL生理盐水的250mL三角瓶 中，然后将三角瓶放入摇床中，在30℃、170r/min的条件下进行振荡，定性检测机械强 度。
2.2.2传质性能的检测
传质性能，即传递物质的能力。
选择数量相同、粒度均匀的凝胶小球分别放入100mL的蒸馏水中，添加2滴亚甲基兰液，定时观察亚甲基兰进入各固定化颗粒的情况，定性判断固定化凝胶珠的传质性能。
2.2.3稳定性
(1)细胞固定化后的稳定性
酵母细胞固定一段时间后，取出部分固定化颗粒用PBS缓冲液(0.1mmol/L，pH6.6) 溶解，离心(4℃、6000r/min)10min后收集菌体，用无菌水稀释到合适的菌体浓度后，利用亚甲基蓝染色法进行细胞活性的检测，方法同前所述。
(2)固定化颗粒的稳定性
酵母细胞固定一段时间后，选择粒度均匀的固定化颗粒置于Tris-Hcl、聚乙二醇-600 和乙酸乙酯中检测颗粒球的稳定性。
2.3还原方法
2.3.1固定化酵母菌在水相中催化的不对称还原反应
称取3g(湿重)酵母细胞制备菌体包埋量为10％的固定化细胞，用Tris-Hcl缓冲液(0.05mmol/L，pH 6.6)洗涤两次后，重悬于25mL同一缓冲液中，加入底物ACP至终浓 度70mmol/L、葡萄糖至终浓度2％(w/v)，置于摇床(30℃、170r/min)中反应36h，用等 体积的乙酸乙酯萃取后进行GC(气相色谱)分析。
2.3.2固定化酵母细胞在引入吸附树脂的水相中催化的不对称还原反应
将200μL ACP加到含1g树脂的PBS缓冲液(0.1mol/L、pH 6.6，25mL)中，振荡一 段时间后，向反应系统中加入由3g湿菌制备的固定化细胞和0.5g葡萄糖作辅助底物， 在摇床中(30℃、170r/min)反应36h。
2.3.3固定化酵母细胞在PEG-600/水两相体系中催化的不对称还原反应
取200μL ACP加入到Tris-Hcl(0.05mol/L、pH 6.6)和聚乙二醇组成的两相系统中， 混合摇匀后，再向反应系统中加入由3g湿菌制备的固定化细胞和0.5g葡萄糖作辅助底物，在摇床中(30℃、170r/min)反应36h。
2.4分析方法
GC分析使用GC-960气相色谱仪，HP Chiral 10％3-Cyclodextrin手性色谱柱(30m× 0.32mm×0.25μm)；检测条件：载气为氮气，进样器、色谱柱和FID检测器温度分别 为220℃、110℃和200℃；分流比为1∶100；进样量为0.1mL。分别以底物的转化率 (Conversion)和产物的对映体过量值(e.e.value)表示反应的转化程度和立体选择性，其表达 式如下：
Conversion(％)＝C苯乙醇/C0×100(1)
e.e.(％)＝|(Cs-CR)|/(Cs+CR)×100(2)
其中，C0为底物的初始浓度，C苯乙醇为反应终止时的产物浓度，Cs和CR分别为(S)型和(R)型产物的浓度。
3结果与讨论
3.1固定化细胞的制备及影响因素
3.1.1不同包埋方法制备固定化细胞的比较
理想的固定化体系，除了具备一定的物理化学性质，如传质性能、机械强度、大小等 外，还应具备良好的生物相容性，这是保证固定化细胞进行正常代谢活动和催化反应的前 提。固定化细胞的方法有包埋法、吸附法、共价结合法、交联法、絮凝法等。其中，包埋 法操作简单，条件温和，稳定性好，对细胞活性影响小，制备的固定化颗粒强度好，是目 前研究最广泛的方法。
本实验以海藻酸钙，海藻酸铝，PVA-海藻酸钙，明胶，卡拉胶等作为包埋剂制备固定化细胞，从机械强度、传质性能、稳定性及对细胞活性影响等方面对这几种包埋法进行比较。在反应体系中加入不同方法固定的酵母细胞颗粒时，保持菌体包埋量为10％(3g 湿菌，混合液体积为30mL)，比较结果如表1。
表1不同包埋法的比较
从表1可以看出，海藻酸钙固定的胶红酵母不仅具有较好的还原活性、机械强度和稳 定性，而且该方法操作相对简单，所使用的材料海藻酸钠和CaCl2也是最价廉的，因此，选择海藻酸钙包埋法来固定胶红酵母细胞。
3.1.2海藻酸钠浓度对还原反应的影响
从表1中可以发现，与游离的酵母细胞相比，海藻酸钙固定化细胞的还原活性并没有 降低，说明海藻酸钠作为固定化介质具有良好的生物相容性。同时，为进一步研究海藻酸 钠形成凝胶的网状结构疏密程度对固定化酵母的机械强度和扩散特征的影响，从而影响菌 体的还原活性。本实验分别用不同浓度的海藻酸钠(2％～4％，w/v)与2％CaCl2制备固 定化细胞来催化ACP的还原反应，结果如图2。
保持70mmol/L的底物浓度时，随着海藻酸钠浓度的增加，反应的立体选择性保持稳 定(e.e.＞99％)，酵母细胞的底物转化率在3％Na-Alg包埋时达到最高值。说明在不同的 海藻酸钠浓度下凝胶的疏密影响了固定化细胞的机械强度和传质性能，进而影响底物的转 化率。同时发现，低Na-Alg浓度时，形成的固定颗粒不稳定，反应一段时间后颗粒出现部分溶解；而Na-Alg浓度大于3％后继续增加会给固定化过程带来难度，在较高的海藻 酸钠浓度下，其豁度(胶体溶液的物理特性之一，豁度大粘度大)和密度的增加会导致与 酵母混合不均匀，使胶珠的包埋密度大小不一，滴制过程中产生严重的拖尾现象。因此， 综合上述影响，采用3％的海藻酸钠溶液来制备固定化细胞。
3.1.3固定化细胞载量的确定
在上述用海藻酸钙固定细胞时，使用的方法是把离心得到的酵母菌体，配成质量分数 为30％的细胞菌悬液，将10mL菌悬液与20mL 4.5％海藻酸钠溶液混匀，再用注射器滴入2％的CaCl2溶液中形成固定化细胞颗粒，按此方法制得的固定化颗粒中游离细胞载量为10％。现将含3g(湿重)酵母细胞的菌悬液和4.5％海藻酸钠溶液按1∶2的体积混合， 制备总体积为60mL、37.5mL、30mL、25mL、20mL混合液来制取固定化细胞。即保 持参与包埋的细胞为3g，海藻酸钠浓度为3％的条件下，考察菌体载量分别为5％、8％、 10％、12％、15％的固定化细胞对bs5-1不对称还原ACP的影响，结果如图3。
实验发现，保持细胞用量一定的条件下，随着固定化颗粒中酵母细胞载量的增加(即 固定化颗粒减少)，反应的立体选择性保持稳定，e.e.值维持在99.0％左右；底物的转化率 在菌体载量为8％时达到最高值(72.6％)。同时发现，菌体载量大于10％时反应体系中出 现少量的游离细胞。可能是由于固定化细胞载量太高，导致少量细胞掉落；菌体载量小于 8％时，反应介质的体积过小，固定化颗粒反应后体积变小。因此，综合考虑以上因素，选择菌悬液浓度为8％来制取固定化细胞。
3.1.4交联剂CaCl2浓度对还原反应的影响
氯化钙的浓度不仅影响海藻酸钙颗粒的成型时间和机械强度等，而且可能影响酵母细 胞的还原活性。本实验分别以1％～4％CaCl2溶液与3％海藻酸钠溶液制备固定化细胞， 检测交联剂对细胞活性的影响，结果如图4。
随着CaCl2浓度的增加，产物的e.e.值保持在99.0％左右，底物的转化率在2％CaCl2下达到最高值(68.3％)。同时发现，低浓度CaCl2制备的固定化细胞不稳定，反应一段时 间后固定化颗粒溶解释放出游离细胞。利用高浓度CaCl2制备的固定化细胞时，海藻酸钠 包埋的细胞悬浮在CaCl2溶液上，固定化颗粒形成也不完全；并且高浓度Ca2+形成高渗环境，使细胞脱水扰乱其正常代谢，进而影响菌体的还原活性。综合考虑钙离子浓度对反应的转化率和e.e.值以及固定化颗粒强度的影响，实验交联剂CaCl2的浓度为2％。
3.1.5固定化时间的确定
海藻酸钙凝胶包埋法时，将Na-Alg水溶液滴加入CaCl2水溶液中，Ca2+与Alg快速反应，在Alg液滴周围形成薄膜，随着固定化时间的延长Ca2+向Alg液滴内部迅速扩散， Alg完全变成凝胶，从而得到实心胶珠(Ca-Alginate bead)，如图1。本实验用2％CaCl2处理游离酵母细胞不同时间后，利用亚甲基蓝染色法检测菌体的死活，发现随着CaCl2处理时间的延长，细胞的死亡率上升，说明CaCl2对菌体的的活性有一定的负面影响。
本研究以2％CaCl2做交联剂时，考察固定化时间对固定化酵母细胞活性的影响，结 果如图5。实验发现，固定化时间对bs5-1的立体选择性影响不大，e.e.值保持在99.0％左 右；但固定化时间大于0.5h后，将固定化颗粒继续置于CaCl2水溶液中，随着时间的延长，菌体的底物转化率明显下降。同时，固定化时间越长颗粒的机械强度越好，但传质性 能在0.5h～1h左右最好，因此，在保证固定颗粒的机械强度和传质性能的条件下，综合 考虑底物的转化率和产物的e.e.值，选择最佳固定化时间为0.5h。
3.2水相中固定化细胞不对称还原ACP的反应特性
3.2.1固定化细胞不对称还原ACP的时间进程
为了对海藻酸钙包埋法固定的酵母细胞的反应特性进行研究，对反应过程有较为全面 的认识，测定了固定化酵母细胞在水相体系中不对称还原ACP的反应时间进程，结果如 图6。可以看出，随着反应时间的延长，底物的转化率和产物的e.e.值都呈增长趋势，到达48h左右，反应达到平衡，底物和产物浓度也处于稳定状态。同时，与游离细胞不对 称还原ACP的时间进程相比较，发现反应达到平衡的时间有所延迟，可能是因为海藻酸 钙形成的凝胶网状结构使底物和产物在与细胞接触的过程中形成了一个障碍，限制了和细 胞直接接触的底物和产物浓度，进而降低的反应速率而延缓反应进程；同时也达到保护细 胞，提高反应的转化率。因此，综合考虑反应的转化率和立体选择性，选择48h作为反 应的终点。
3.2.2底物浓度对固定化bs5-1不对称还原ACP的影响
为进一步考察固定化细胞的稳定性，比较了不同底物浓度下游离细胞和固定化细胞在 水相系统中的还原能力，结果如图7。可以看出，在底物浓度为70mmol/L左右，固定化细胞表现出明显的优势，但是底物在更低浓度或高浓度时，固定化菌体并没有显著效果。可能是因为，ACP的不对称还原反应是一个平衡、可逆的反应，前期的结果可见，菌体 也存在选择性氧化(S)-1-PEA合成ACP的能力。因此，菌体还原低底物浓度时，细胞无论 是游离还是固定化状态，最终处于一个转化平衡的稳定状态。底物浓度大于70mmol/L 时，底物和产物虽然受到海藻酸钙形成的凝胶网状结构的阻碍，而使两者与细胞直接接触 的浓度有所下降，但这种保护机制只能隔阻部分底物和产物，随着底物浓度增加，与细胞 接触的底物和产物浓度也上升，进而影响菌体的活性，而使固定化细胞在高底物浓度不能 有效地提高反应活性；对此，将催化高浓度底物后的固定化细胞置于PBS缓冲液(0.1 mmol/L、pH6.6)溶液中溶解，再利用亚甲基兰染色法来检验酵母细胞的死活。结果发现， 和游离细胞的一样，固定化细胞后也部分失活；同时，根据活性胶红酵母能产生红色色素， 则活细胞呈红色而死细胞呈现白色，反应结束后离心的菌体或固定化细胞都呈现部分白 色。
3.3非水相中固定化细胞不对称还原ACP的反应特性
本实验将酵母细胞的固定化和两相系统相结合，同时与水相系统中的反应进行比较， 催化不同浓度(70mmol/L～175mmol/L)的ACP进行还原反应，结果如图8。
结果发现，在不同底物浓度下，固定化细胞在三种反应介质中的反应存在相似性，随 着ACP浓度的增加，底物的转化率呈下降趋势，而产物的e.e.值均保持相对的稳定。ACP浓度为70mmol/L时，固定化细胞在三种反应体系中的底物转化率和产物合成量分别保持在82.5％和57.8％左右。因为，ACP不对称还原合成PEA的反应是一个可逆反应，其最 终状态是底物和产物的浓度在反应体系中达到相对平衡；同时，可能是因为酵母细胞的固 定化已将菌体的还原活性提升到优化的状态，使得底物的转化率提高到79.7％。所以，不 论在水相系统里，还是在引入吸附树脂和PEG-600/水的系统中，细胞的固定化都处于接 近最终的平衡状态。因此，实验通过提高底物浓度来考察不同反应体系对固定化细胞催化 反应的促进作用。
ACP浓度为105mmol/L时，与水相中的反应相比，固定化细胞在PEG-600/水两相系统中催化的底物转化率和产物合成量没有增加，而引入树脂的反应体系所介导的反应，其底物转化率(69.3％)和产物合成量有明显的提高，并且其合成的产物高达72.7mmol/L； 但在引入树脂的反应体系中，ACP浓度高于105mmol/L时，其催化合成的产物量有所下 降。同样地，继续增加底物浓度到175mmol/L，PEG-600/水两相系统和水相系统的催化 还原结果相接近，而引入树脂的反应中固定化细胞的活性增强，其底物的转化率和产物合 成量有所的提高。
对于水相单相系统介导的反应而言，随着ACP浓度的提高，水相中溶解的ACP增加，在单相反应体系中与酵母细胞接触的底物和产物的浓度增高，会降低菌体的还原活性。而在引入树脂的反应系统中，底物浓度低于105mmol/L时，吸附树脂起到较好的缓释底物 作用，降低与菌体直接接触的底物浓度，进而进一步保证了固定化细胞中细胞活性；同时 吸附树脂的产物原位吸附作用，降低水相中的产物浓度进而有利于反应顺向进行。但底物 浓度进一步增大时，在引入树脂的反应系统中的水相里，底物和产物浓度会相应增大，从 而影响固定化细胞的还原活性。因此，引入树脂的反应体系介导的催化反应，其底物转化 率和产物合成量在底物浓度为105mmol/L时达到了最高值，分别为69.3％和72.7mmol/L。
3.4水相中游离菌与吸附树脂反应体系中固定化细胞重复利用的比较
取3g游离细胞和由3g(湿重)菌体制备的固定化细胞分别在水相中和引入吸附树脂的反应体系中催化还原105mmol/L ACP，反应周期为48h，结果如图9。实验发现， 游离细胞和固定化细胞在重复利用多次后，产物的e.e.保持稳定。而引入树脂的反应体系 介导的固定化细胞不仅在重复利用批次上优于水相中的游离细胞，而且在每次转化过程中 底物的转化率上也高出较多；同时，对每次反应后的酵母细胞进行亚甲基蓝染色法的生物 活性检测，固定化细胞的存活率高于游离细胞。
综上，本发明使用海藻酸钙作为包埋剂，能使得到的胶红酵母固定化微粒具有较高的 机械强度、传质性能、稳定性，被固定的细胞活性与游离细胞无显著差别，其底物转化能 力也相对较高。本发明还提供了优良的细胞固定参数组合，包括合理的细胞载量、固定化 介质(海藻酸钠)浓度、交联剂(CaCl2)浓度、固定化时间的组合，使得底物转化率升 高。进一步地，本发明提供了优化后的反应时间、底物浓度、引入树脂的反应体系，大幅 提高了底物转化率以及固定化细胞的重复使用效率。
本发明能大幅提升胶红酵母将ACP还原成(S)-1-PEA的能力，并大幅提升胶红酵母的 重复利用次数，具有十分优良的产业化前景。
Claims (10)
1.一种胶红酵母固定化细胞，其特征在于：它是由海藻酸钠作为固定介质、钙盐作为交联剂，将胶红酵母活细胞固定于所述固定介质和交联剂形成的凝胶中制备得到；
所述海藻酸钠的浓度是2％～4％，优选3％。
2.如权利要求1所述的固定化细胞，其特征在于：所述胶红酵母是Rhodotorulamucilaginosa bs5-1。
3.如权利要求1所述的固定化细胞，其特征在于：所述钙盐是氯化钙。
4.权利要求1～3任一所述固定化细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将海藻酸钠加入水中，加热溶解后冷却，得混合物；
(2)将步骤(1)得到的混合物与胶红酵母活细胞悬浊液混合，得混合物；
(3)将步骤(2)得到的混合物加入到形成凝胶所需的过量的钙盐溶液中，反应0.5～1h，形成凝胶，优选地，反应0.5h。
5.如权利要求4所述的固定化细胞制备方法，其特征在于：
所述钙盐是氯化钙，其浓度为1～3％(w/v)；优选地，氯化钙浓度为2％(w/v)；
和/或，所述氯化钙溶液的用量是：每30ml步骤(2)所得混合物加入到300～500ml的氯化钙溶液中。
6.如权利要求4所述的固定化细胞制备方法，其特征在于：步骤(2)中，步骤(1)得到的混合物与胶红酵母活细胞悬浊液的体积比是1∶2。
7.如权利要求4所述的固定化细胞制备方法，其特征在于：每100ml步骤(2)得到的混合物所含酵母细胞湿重为5～10g；优选地，每100ml步骤(2)得到的混合物所含酵母细胞湿重为8g。
8.一种合成芳香仲醇的方法，其特征在于，它是以权利要求1～3任一所述固定化细胞作为催化剂、葡萄糖作为辅助底物，在水相或两相体系中催化不对称还原反应的方法；
所述两相体系是PEG-600和水组成的两相体系。
9.如权利要求8所述的合成芳香仲醇的方法，其特征在于：
单次反应时间是48h；
和/或，底物初始浓度为70mmol/L～175mmol/L，优选地，为70～105mmol/L。
10.如权利要求8所述的合成芳香仲醇的方法，其特征在于：所述芳香仲醇水相体系中还包括吸附树脂；所述吸附树脂具有吸附反应产物的能力。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910135061.1A CN111593044A (zh) | 2019-02-20 | 2019-02-20 | 一种胶红酵母固定化细胞及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910135061.1A CN111593044A (zh) | 2019-02-20 | 2019-02-20 | 一种胶红酵母固定化细胞及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111593044A true CN111593044A (zh) | 2020-08-28 |
Family
ID=72183191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910135061.1A Pending CN111593044A (zh) | 2019-02-20 | 2019-02-20 | 一种胶红酵母固定化细胞及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111593044A (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1114983A (zh) * | 1995-04-28 | 1996-01-17 | 广东省微生物研究所 | 一种酵母固定化载体和制造方法 |
| CN101565679A (zh) * | 2009-03-04 | 2009-10-28 | 中国药科大学 | 一种红酵母细胞以及不对称转化生产光学活性醇的方法 |
| CN102492633A (zh) * | 2011-12-02 | 2012-06-13 | 江南大学 | 具有降解氨基甲酸乙酯功能的胶红酵母及其在酒类及食品中的应用 |
| CN102925334A (zh) * | 2012-10-18 | 2013-02-13 | 江南大学 | 一种降低酒精饮品中氨基甲酸乙酯的集成控制方法 |
| CN104178432A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-03 | 成都医学院 | 一种胶红酵母及其应用 |
| CN105164230A (zh) * | 2013-03-08 | 2015-12-16 | 索拉兹米公司 | 产油微生物润滑剂 |
| CN109554359A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-04-02 | 河北省科学院生物研究所 | 固定化包埋微生物的方法及其制备的含有微生物的固定化小球及其应用 |
| WO2021163346A2 (en) * | 2020-02-12 | 2021-08-19 | The Scripps Research Institute | Long-acting gm-csf and methods of use |
-
2019
- 2019-02-20 CN CN201910135061.1A patent/CN111593044A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1114983A (zh) * | 1995-04-28 | 1996-01-17 | 广东省微生物研究所 | 一种酵母固定化载体和制造方法 |
| CN101565679A (zh) * | 2009-03-04 | 2009-10-28 | 中国药科大学 | 一种红酵母细胞以及不对称转化生产光学活性醇的方法 |
| CN102492633A (zh) * | 2011-12-02 | 2012-06-13 | 江南大学 | 具有降解氨基甲酸乙酯功能的胶红酵母及其在酒类及食品中的应用 |
| CN102925334A (zh) * | 2012-10-18 | 2013-02-13 | 江南大学 | 一种降低酒精饮品中氨基甲酸乙酯的集成控制方法 |
| CN105164230A (zh) * | 2013-03-08 | 2015-12-16 | 索拉兹米公司 | 产油微生物润滑剂 |
| CN104178432A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-03 | 成都医学院 | 一种胶红酵母及其应用 |
| CN109554359A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-04-02 | 河北省科学院生物研究所 | 固定化包埋微生物的方法及其制备的含有微生物的固定化小球及其应用 |
| WO2021163346A2 (en) * | 2020-02-12 | 2021-08-19 | The Scripps Research Institute | Long-acting gm-csf and methods of use |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HUI LIU等: "Asymmetric Ketone Reduction by Immobilized Rhodotorula mucilaginosa", 《CATALYSTS》 * |
| QUN WU等: "Immobilized Rhodotorula mucilaginosa: A Novel Urethanase-Producing Strain for Degrading Ethyl Carbamate", 《APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY》 * |
| 于梅艳: "胶红酵母固定化方法研究", 《中州大学学报》 * |
| 赵春海: "产油脂酵母菌的遗传改良和油脂的发酵生产", 《中国博士学位论文全文数据库》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nilsson et al. | The use of bead polymerization of acrylic monomers for immobilization of enzymes | |
| US8906404B2 (en) | Three dimensional porous polymeric structure having a pore-size range of 1/10 to 10 times the average pore size | |
| Kokufuta | Functional immobilized biocatalysts | |
| CN110331139B (zh) | 一种南极假丝酵母脂肪酶b的固定化方法 | |
| CN111533919B (zh) | 一种手性中空结构的金属-有机框架材料的合成方法及应用 | |
| CN111285951B (zh) | 一种脂肪酶/聚离子液体-苯乙烯微球/水凝胶催化材料及其制备方法和应用 | |
| Ulu et al. | The carboxylated multi-walled carbon nanotubes/l-asparaginase doped calcium-alginate beads: Structural and biocatalytic characterization | |
| CN113512545A (zh) | 一种合成固定化脂肪酶及其拆分扁桃酸对映体的新方法 | |
| CN111593044A (zh) | 一种胶红酵母固定化细胞及其应用 | |
| EP2316932B1 (en) | Enzyme-functionalized supports | |
| Wu et al. | Polyethyleneimine-MOF composite as a support for immobilization of lipase with enhanced activity in kinetic resolution | |
| Maury et al. | Catalytic activity of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia encapsulated in silica aerogels in esterification and hydrolysis as a function of the gel and solvent hydrophobicities | |
| CN106636294A (zh) | 一种固定化双酶耦合反应生产非天然氨基酸产品的工艺 | |
| CN110760498B (zh) | 一种谷氨酸脱羧酶的共交联固定化方法 | |
| JP2002526070A (ja) | 酵素のマイクロビーズ固定化方法 | |
| CN101525603B (zh) | 固定化α-氨基酸酯水解酶及其制备与应用 | |
| CN1149284C (zh) | 以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶及制法 | |
| CN111647591A (zh) | 利用固定化酶制备他汀中间体的方法 | |
| CN112458075B (zh) | 一种利用双交联颗粒凝胶填充柱实现微生物催化过程强化的方法 | |
| Kim et al. | Cephalexin synthesis using immobilized Xanthomonas citri cells | |
| Xenakis et al. | Lipase immobilization on microemulsion-based polymer gels | |
| JP2010022287A (ja) | 微生物内包高分子ゲルビーズの製造方法及び土壌改質材。 | |
| CN1082068A (zh) | 双水相乳化法制备的微珠及其制备方法 | |
| EP1116789B1 (en) | Immobilised enzyme and method for synthesizing an optically active cyanohydrin | |
| Wang et al. | Functionalized poly (ionic liquid) s bridging Pd NPs and lipase for highly efficient dynamic kinetic resolution of chiral amine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200828 |