CN1082068A - 双水相乳化法制备的微珠及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明用双水相乳化成珠的方法制备出内部有 空隙或无空隙结构的微珠介质。制备工艺的特征是 先用两种带电相反的高分子物质在水溶液中混合形 成双水相，分离浓相后，将浓相乳化分散于水或其它 极性溶剂或该极性溶剂与水的混合溶液中，乳化稳定 后在用物理冷却或/和化学交联的方法固化微珠。 冷却速度是制备内部不同空隙结构微珠的关键。微 珠经进一步化学固化或化学修饰，可用于细胞培养、 层析分离和固定化酶过程。

Description

本发明属于高分子材料的成型、处理及其应用，涉及一种微珠介质制备的双水相乳化成珠方法，制备的微珠直径在10-450μm间。

将水溶性高分子物质制成微珠，目前国内外主要采用水/油乳化聚合法（emulsion  polymerization），即把一种水溶性物质的水溶液，搅拌分散于油相中，乳化形成微液滴，同时用化学的方法固定微液滴，制备出球形的微珠（Wissman，K.W.，et  al.，In  Vitro，21，7，391，1985）。由于水油两相界面张力大，乳化分散困难，要求较高的搅拌速度，同时还需须引入分散剂才能实现所需的乳化。对于不同的水溶性物质，乳化体系一般不同，分散剂种类和量、油的种类、化学反应的浓度、时间都需要严格选择和控制，工艺技术复杂，制备过程较难掌握控制。另外，分散剂作为表面活性物质，同时还造成制备的微珠不易清洗，需要用乙醇和丙酮反复漂洗微珠除去分散剂和油类物质，以适应对微珠有高纯度要求的过程，如贴壁依赖性动物细胞的培养。

在层析分离过程中，要求填充的介质具有较大的比表面积，即介质越小越好，但是填充介质越小，填充的柱子的流动阻力越大，难于提高流动相的流速，这在大规模分离过程中很不利。具体应用中，在流速和比表面积上只好采用折中的办法。在固定化酶中，同样要求固定化酶载体有高比表面积和快的传质性能，也存在上述问题。

本发明的目的之一在于克服已有技术上的缺点，提供一种双水相体系乳化制备微珠的方法，在缓和的搅拌条件下实现乳化分散，不引入有机油类物质，不需加入分散剂，乳化条件温和，制备工艺简单、易于掌握控制，制备的微珠易于漂洗的优点。

本发明的又一个目的是，制备内部包含大量空隙的微珠介质，使一定大小的微珠即具有较大的比表面，又具有较低的流动阻力。

本发明的本质是，先用两种带相反电荷的高分子物质在水中形成双水相，分离浓相后，再将浓相作为分散相乳化分散于一连续相中，形成微珠，连续相可以是原来的稀相，也可以换成水或其他弱极性溶剂，或弱极性溶剂与水的混合溶液，或弱极性溶剂的混合溶液，最后用物理和/或化学的方法，固化乳化稳定的微珠，制备出10-450μm直径的微珠，还可以对微珠进行处理，以用于不同的目的。

上述双水相的形成，是由于两种带相反电荷的水溶性高分子化合物静电结合成为部分互溶于水的聚电解质复合物所致。

所选用的带正电的高分子物质是蛋白质及其化学修饰物。蛋白质在pH＜pI下带正电，呈聚阳离子特性，如A类明胶、血红朊、鸡白蛋白、聚赖氨酸等。宜选用较高pI点的蛋白质。可以对蛋白进行化学修饰，提高其pI点，如用醇类和蛋白质上的羧基进行酯化反应，中和掉负电性基团，或用碳二亚胺类接上正电性基团。所选用的带负电的高分子物质可以是糖类，如阿拉伯树胶、褐藻酸钠、羧甲基纤维素、琼脂糖等;含有酸基的高分子物质，如苯乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物、聚乙烯基甲基醚-顺丁烯二酸酐共聚物、聚乙烯基苯磺酸和甲醛-萘磺酸缩聚物等;以及蛋白质及其化学修饰物，蛋白质在pH＞pI时带负电，宜选用较低pI点的蛋白质，如碱法明胶。可以对蛋白进行化学修饰，降低其pI点，如用琥珀酸酐、苯酐或苯磺酰氯与蛋白质上的正电性基团氨基反应，同时接上负电性的羧基或磺酸基。

两种带电荷相反的高分子物质在水中混合形成双水相，可通过调pH值使两种高分子物质电性相反，电量接近相等，以及用水稀释或用离子交换或电渗析等方法降低溶液离子强度，从而增大两高聚物间的电性吸引，以获得最适宜的双水相成相条件。

上述方法的根本在于降低盐浓度和改变蛋白质带电性和电量，因此在水中混合高分子物质、调pH、稀释这三步的顺序可以改变，如先调pH，再混合、稀释;先调pH，再稀释、混合;先稀释，再混合、调pH;先混合，稀释，再调pH均可。

浓相的分离可以采用离心或静置沉降的方法。也可在冷却后用过滤的方法分离固化的浓相。

形成的双水相中，高分子物质主要集中于一相，即浓相，稀相中高分子物质的含量很小，在0.2%（wt）以下，还可减小到0.005%（wt）以下。这类双水相系统具有两相界面张力低、密度差小的特点。

以浓相作为分散相，分散于连续相中，即可乳化形成微珠。连续相可以是以上稀相，也可以换成水或其他弱极性溶剂，或弱极性溶剂与水的混合溶液，或弱极性溶剂的混合溶液。浓相与这些弱极性溶剂的分散相平衡后，两相中水的含量可以低于50%，但两相仍具有界面张力低、密度差小的特点。这些弱极性溶剂可以是醇或酮或酯，如甘油、乙二醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯。具有脱水性质的溶剂，如乙醇、丙酮，只能与水混合作为分散相，否则浓相脱水变为固体，无法乳化分散。

乳化分散时，分散相/连续相的体积比即相比控制在1/20-4/5间。

提高浓相/稀相比，有利于制备较大的微珠，并提高微珠的单位体积（乳化分散容器的体积）产率。搅拌速度同样影响制备的微珠的大小，搅拌速度大，制备的微珠小，反之则大。可以简单地通过调节浓相/稀相比和搅拌速度来获得所需粒度的微珠。

制备100-250μm的微珠，如细胞培养微载体，为提高微珠的体积产率，更合适的相比在1/5-1/2间。

不同的高分子物质，适宜的乳化条件有一定的差别。例如对于Bloom300的高强度明胶，制备100μm以上的微珠，应在50-55℃60rpm搅拌速度下分散，然后维持在40℃稳定乳化。而Bloom225的低强度明胶，不易制备大微珠，在制备100μm以上微珠时，应选择50%-75%甘油的水溶液为连续相。总之，强度大的高分子物质较难分散，可采用先升温使其分散，再降温稳定乳化;强度小的高分子物质，容易分散，但不易形成较大的微珠，可以加入粘度大，对细胞无毒性和容易清洗的水溶性物质，以提高微珠粒径。

待乳化分散稳定后，可以通过物理和/或化学的方法固化微珠。

明胶形成的浓相在温度低于其胶凝点时将由液态变为具有固态性质的凝胶态，简单地用冷却的方法即可物理固化微珠。

可采用以下三类冷却方式物理固化微珠：

1）.快速冷却：可制备空隙大小和分布均一的微珠（见照片-1）。采用的冷却方式可以是将乳化液直接投入冷水或在低温下水浴冷却乳化液。

2）.慢速冷却：制备表面光滑性好，内部空隙分布不均微珠（见照片-2）。采用的冷却方式可以是在低于胶凝点5-15℃的温度下水浴冷却乳化液。

3）.胶凝点处缓慢冷却：可制备空隙少或没有空隙、透明性好的微珠。

冷却固化过程是可逆的，固化的微珠升温后液化，可重新乳化分散。因此，物理固化后筛分微珠，粒度不合格的微珠液化后重新乳化，可提高昂贵的原料的利用率。

为了使微珠在较高温度下不液化，可将物理固化的微珠进一步化学固化。

也可以不经物理固化，在乳化时加入能起化学交联作用的物质直接化学固化微珠。由于不经物理固化，制备的微珠内部无空隙或极少空隙。

能起化学交联作用的物质，可以是醛类、环氧化物和氧化剂。

醛类物质中包括多元醛、一元醛，最好戊二醛和甲醛。环氧化物中最好是多氧撑的物质，如1，4-丁二醇二甘油醚。若浓相中含糖类，也可以用氧化剂氧化糖为多元醛而把蛋白和糖交联在一起。氧化剂最好是具有选择氧化能力的物质，如高碘酸钠。高碘酸钠可将糖中相邻的羟基氧化为醛基，使糖变为多元醛。

化学固化后的微珠，需还原微珠上游离的醛基，或中和这些醛基，避免这些醛基将微珠和微珠交联在一起。可以用稀的蛋白质或氨基酸溶液中和游离的醛基。

可进一步处理微珠，使微珠用于不同的目的，如细胞培养微载体、层析分离介质、固定化酶载体等。

制备细胞培养微载体，需要进一步处理微珠，使微珠能耐湿热灭菌，并具有良好的细胞培养性能。

如用明胶-阿拉伯树胶体系制备细胞培养微载体，乳化、冷却固化后，要进一步化学交联到足够的程度，使微珠耐湿热灭菌。在化学固化前，先用盐水或无Ca2+、Mg2+PBS溶液浸泡和漂洗微珠，然后再悬浮微珠于水中，加入交联剂化学固化。选用戊二醛作为交联剂较佳。

化学固化后，漂洗微珠一次，将微珠加入0.5%明胶溶液，中和微珠表面游离的醛基，再漂洗两次后，用硼氢化钠还原。也可以化学固化后，漂洗一次，直接进入还原过程。硼氢化钠的作用一是脱色，二是稳定交联键。

为抑制硼氢化钠与水反应，将微珠悬浮于饱和四硼酸钠溶液中进行还原，并加入乙醇，至没有气泡出现。

微珠经漂洗两次后，可在无Ca2+、Mg2+的PBS中分装灭菌。或浸泡在60%乙醇溶液中保存。长期保存，应用乙醇梯度脱水，60℃下干燥。

为使微珠耐湿热灭菌，也可以不用硼氢化钠还原微珠，采用升温强化化学交联的方法固化微珠。其关键是，在保证微珠不液化的条件下，逐渐升高温度使化学交联得到稳定和强化。适宜的方法是，用戊二醛在25℃交联10-15hr.，然后升温到70℃，维持5-10hr.，再升温到100℃，维持10-15hr.。该法戊二醛的用量多，交联度大，载体有一定耐酶分解的能力。

还可以化学修饰微载体，使微载体带更多的正电，以提高细胞的贴壁速度。如用甲醇酯化负电性的羧基，或用碳二亚胺与羧基反应，同时接上正电性的氨基、酰氨基。

为使微珠用于层析分离过程，可以用化学修饰的方法进一步处理微珠，给微珠接上正电性、负电性基团，以用于离子交换层析;给微珠接上极性或非极性强度不同的基团，以用于吸附层析;给微珠接上能和某种物质特异结合的配体，如辅酶、单克隆抗体等，以用于吸附层析。也可以将酶接到载体上，将酶固定在载体上，用于酶催化反应。

实施例一：

明胶-阿拉伯树胶体系乳化制备细胞培养微载体，慢冷固化微珠，用蛋白溶液中和游离的醛基，硼氢化钠还原交联键，使微珠具有热稳定性。

酸法猪皮明胶（pI8.5以上，Bloom300）10g，在40℃下充分溶于100g水中。10g阿拉伯树胶溶于100ml水中，若溶液浑浊有杂质，离心除去杂质。两溶液在40℃下混和，用10%盐酸调pH至4.1，加40℃水1800ml，充分混合。离心分离浓相，以1/5的相比（浓相体积/稀相体积），在50℃60rpm搅拌下分散浓相于稀相中，降温至40℃维持乳化10min，20℃水浴冷却。用不锈钢筛筛分100μm-250μ微珠，室温下用1MNaCl水溶液充分浸泡和漂洗微珠，再悬浮于2000ml0.02MPBS中，在200rpm搅拌下，加25%戊二醛8ml，反应1小时。用0.02MPBS漂洗微珠一次，200rPM下悬浮于40℃0.5%明胶溶液中和1小时。用0.02MPBS漂洗两次，200rPm下悬浮于2000ml pH9.3饱和四硼酸钠溶液中，加入0.9g NaBH₄，并加入乙醇至不再有气泡出现，维持反应1小时，再用0.02MPBS漂洗微珠两次，70% 80% 90% 100%乙醇梯度脱水，60℃下干燥。

制备的微载体以1.5mg/ml的浓度，在转瓶中用含10%小牛血清的199培养基培养Vero细胞。接种细胞至细胞浓度达2.4×10⁶个/ml，控制搅拌速度为45rpm。一周后细胞密度达1.57×10⁶个/ml，即每毫克微载体上生长的细胞数超过10⁶个。然后将培养液换为2%小牛血清的199培养液，接种JBV病毒，病毒滴度变化如下：

44小时 ＜10⁶pfu/ml

72小时 10^6.3pfu/ml

96小时 10^6.8pfu/ml

120小时 10^6.9pfu/ml

可进一步化学修饰微珠以用于细胞培养以外的不同目的。

实施例二：

明胶-阿拉伯树胶体系，以甘油和水的混合物为连续相，快速冷却固化微珠，再用逐渐升温的方法强化交联固化微珠，并用氨基酸中和游离的醛基。

100ml10%酸法猪皮明胶（pI高于8.5，Bloom225）与110m10%阿拉伯树胶在40℃下混合，调pH为3.7，加水1800ml，充分混合，离心分离浓相，以1/3相比，50rpm搅拌下乳化分散浓相于50%甘油的水溶液中，维持乳化10min，在缓慢搅拌下将乳化液到入2000ml  0℃的水中。用水漂洗微珠一次，在200rpm搅拌下将微珠悬浮于1000ML水中，加30ml戊二醛，25℃反应12hr，70℃8hr，100℃10hr。交联后的微珠用水漂洗一次，在40℃下用0.5%甘氨酸中和30min.，最后用水漂洗微珠二次，制备出直径以130-250为主、空隙大小和分布均匀的微珠，该微珠具有较强的耐热和酶分解的能力。

可进一步化学修饰微珠以用于不同目的。

实施例三：

化学修饰的明胶-阿拉伯树胶体系，以10%乙醇水溶液为连续相，在胶凝点处缓慢冷却固化微珠，并用高碘酸钠化学固化微珠。

10g干燥的酸法明胶粉，在0.1NHCL的无水甲醇溶液中浸泡10天，得到甲酯化的明胶。在40℃下，将10%的该明胶溶液与10%阿拉伯树胶溶液混合，调pH为4.3，加水2800ml，充分混合后，离心分离浓相，以1/8相比，70rpm搅拌，40℃下乳化分散浓相于10%乙醇的水溶液中，10分钟后，降温至34℃，33℃水浴20分钟，32.5℃水浴15分钟，32℃水浴15分钟，然后25℃水浴冷却。微珠用水漂洗一次后，200rpm搅拌下，用5%高碘酸钠醛化交联1hr.，漂洗一次后，制备出直径以40-90μm为主、内部空隙极少或没有的微珠。

可进一步化学修饰微珠以用于不同目的。

实施例四：

用甲醛直接化学固化乳化的微珠。

例三中制备的浓相以1/8的相比，在40℃、40rpm搅拌下乳化于水中，维持乳化10min后，降温至35℃，再稳定10min，加入0.6ml  8%甲醛溶液，15min后，用35℃0.02MPBS漂洗一次，得到内部无空隙或空隙极少的微珠。

可进一步化学修饰微珠以用于不同目的。

实施例五：

两种化学改性的明胶制备微珠，用1，4-丁二醇二甘油醚交联。

10g用0.1NHCL的无水甲醇溶液处理得到的甲酯化明胶，和10g用5%琥珀酸酐的丙酮溶液处理得到的琥珀酰化明胶，在40℃下分别溶在100ml水中，待充分溶解后，混合二溶液，调pH至6.5，加水1800ml，充分混合，离心分离浓相，然后在40℃，40rpm搅拌下，以2/5乳化分散浓相于甘油中，维持乳化30分钟，15分钟水浴冷却，漂洗微珠一次，200rpm搅拌下将微珠悬浮于1500ml水中，加入1，4-丁二醇二甘油醚1ml交联30min。得到的微珠整体由明胶组成。

可进一步化学修饰微珠以用于不同目的。

实施例六：

明胶-羧甲基纤维素体系，用甲醛固化。

酸法猪皮明胶（pI8.5以上，Bloom300）10g，在40℃下充分溶于100g水中。10g羧甲基纤维素溶于100ml水中，若溶液浑浊有杂质， 离心除去杂质。两溶液在40℃下混和，用10%盐酸调pH至4.0，加40℃水1800ml，充分混合。离心分离浓相，以1/9的相比，在50℃60rpm搅拌下分散浓相于稀相中，降温至40℃维持乳化10min，15℃水浴冷却，再漂洗微珠一次。进一步化学固化微珠，在200rpm搅拌下将微珠悬浮于1500ml水中，加入4ml  30%甲醛溶液，反应10min后用氢氧化钠溶液调pH至9，再以1℃/min升温至50℃，5min后漂洗微珠一次，得到直径以30-80μm为主的微珠。

可进一步化学修饰微珠以用于不同目的。

实施例七：

血红朊-阿拉伯树胶体系

40℃下，50g  10%血红朊溶液于50g  10%阿拉伯树胶溶液混合，调pH至4.8，加水900ml，离心分离浓相，在40℃  50rpm搅拌下，以1/5的相比乳化分散浓相于稀相中，维持乳化15min，15℃水浴冷固化微珠，得到50-100μm的微珠。

可进一步处理微珠以用于不同目的。

实施例八：

明胶和苯乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物体系

在60℃下，将200g  5%明胶和200g  5%苯乙烯-马来酸酐共聚物 混合，调pH至4.0，加水1600ml，离心分离浓相，在60℃90rpm搅拌下，以1/8的相比将浓相乳化分散于稀相中，维持乳化15min，5℃下水浴冷却，得到直径以30-90μm为主的微珠。

可进一步处理微珠以用于不同目的。

Claims (22)

1、一种双水相乳化制备微珠的方法，其特征在于，采用两种带电相反的高分子物质，在水溶液中混合形成双水相；分离浓相后，以浓相作为分散相乳化分散于一连续相中，形成微珠，连续相可以是原来的稀相或水或其它弱极性溶剂或该弱极性溶剂与水的混合溶液，乳化稳定后用物理或/和化学的方法固化微珠，制备10-450μm直径的微珠；还可以进一步对微珠进行处理，以用于不同目的。

2、按权利要求1所述的方法，其特征在于所说的带正电的高分子物质是蛋白质及其化学修饰物，如明胶、血红朊、鸡白蛋白、聚赖氨酸等;所说的带负电的高分子物质可以是糖类，如阿拉伯树胶、褐藻酸、羧甲基纤维素、琼脂糖等，含有酸基的合成高聚物，如苯乙烯-马来酸酐共聚物，聚乙烯基甲基醚-顺丁烯二酸酐共聚物、聚乙烯基苯磺酸和甲醛-萘磺酸缩聚物等，以及蛋白质及其化学修饰物，如碱法明胶。

3、按权利要求1所述的方法，其特征在于，两种带电相反的高分子物质，在水中混合形成双水相，可以通过调节pH值使两高分子物质带电性相反、电量接近相等，以及加水稀释降低溶液离子强度，从而增大两高聚物间的电性吸引以利于形成双水相。

4、按权利要求1所述的方法，其特征在于所说的作为乳化连续相的弱极性溶剂为甘油、乙二醇、乙醇、丙酮等。

5、按权利要求1所述的方法，其特征在于乳化分散时的相比（分散相体积与连续相体积比）在1/20-4/5间。

6、按权利要求1所述的方法，其特征在于，制备细胞培养微载体乳化分散的最佳相比在1/5-1/2间。

7、按权利要求1所述的方法，其特征在于，物理固化微珠采用快速冷冻的方法，如将乳化液直接投入冷水，制备空隙大小和分布均一的微珠。

8、按权利要求1所述的方法，其特征在于，物理固化微珠采用慢速冷冻的方法，如将乳化液在低于胶凝点3-5℃的温度以下水浴冷却，制备表面光滑性好，内部空隙分布不均微珠。

9、按权利要求1所述的方法，起其特征在于在胶凝点缓慢冷却固化微珠，制备空隙少，透明性好的微珠。

10、按权利要求1所述的方法，起其特征在于直接化学固化微珠是，在乳化液中加入能使浓相发生化学交联的物质，化学固化乳化形成的微珠。

11、按权利要求1、10所述的方法，起其特征在于，采用的能使浓相或物理固化的微珠化学固化的物质是含有醛基的有机物、环氧化物、氧化剂等。

12、按权利要求1、11所述的方法，起其特征在于，采用的含有醛基的有机物是戊二醛和甲醛。

13、按权利要求1、11所述的方法，起其特征在于，采用的环氧化物是1，4-丁二醇二甘油醚。

14、按权利要求1、11所述的方法，起其特征在于，采用的氧化剂是能氧化邻位羟基为醛基的高碘酸钠。

15、按权利要求1所述的方法，起其特征在于，进一步处理微珠，可用稀的蛋白质或氨基酸溶液中和微珠上游离的醛基。

16、按权利要求1所述的方法，起其特征在于，进一步处理微珠，可用硼氢化合钠还原微珠。

17、按权利要求1、15所述的方法，起其特征在于，用硼氢化合钠还原微珠，反应在四硼酸钠溶液中进行。

18、按权利要求1、15所述的方法，起其特征在于，用硼氢化合钠还原微珠，在反应进行的溶液中加入乙醇。

19、按权利要求1所述的方法，起其特征在于，进一步处理微珠以增强微珠抗热和酶分解的能力，化学交联微珠时采用在保证微珠不液化的条件下逐渐升温强化化学交联。

20、一种双水相乳化制备的微珠是由蛋白质、糖类或合成高聚物构成，球形，粒度10-450μm，空隙直径1-50μm，内部结构典型地呈三种形态：内部空隙大小、分布均匀;内部空隙大小、分布不均、表面光滑;内部空隙极少或没有、透明的微珠。

21、按权利要求2所述的微珠，其特征在于，进一步处理微珠制备微载体，用于培养贴壁依赖性动物细胞。

22、按权利要求2所述的微珠，其特征在于，进一步处理微珠，采用化学修饰的方法，给微珠接上正电性、负电性基团、或不同极性或非极性强度的基团、和对特定物质具有亲和作用的配体、或具有特定功能的酶，使微珠用于细胞培养、层析分离和固定化酶催化反应等过程。

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