CN105950604B - 一种酶的固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酶的固定化方法，尤其涉及一种用于啤酒生产的酶的固定化方法。该方法中将α‑乙酰乳酸脱羧酶的缓冲溶液中加入到氯化钙溶液中反应得到形成带有初步固定化酶的纳米花结构，然后将得到的纳米花分散到的海藻酸钠溶液，之后将得到的分散液以一定的滴加速度逐滴加入到氯化钙溶液中搅拌固化得到微球最终产品。根据本发明的固定化酶方法制备的微球能够使固定化酶活保持在游离酶活的98％以上，同时也使固定酶具有稳定性和可重复性利用性，为其在工业上的应用提供了广泛前景。

Description

一种酶的固定化方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地涉及一种酶的固定化方法，尤其涉及一种用于啤酒生产的酶的固定化方法。
背景技术
酶制剂作为生物工程研究的硕果之一，在啤酒行业得到了普及和提高。近几年啤酒企业为了提高质量，降低成本，增加效益，越来越多地使用酶制剂。通过使用酶制剂，可以弥补麦芽中酶活力的不足，加大辅料用量，改善麦汁成分，提高啤酒发酵度，缩短发酵周期，增加产量等。在生产过程中补充外加酶，始终贯穿于啤酒生产的全过程之中，它可使操作简便，效益提高。如耐高温α-淀粉酶应用在糊化时，可达到无麦芽糊化，使辅料比例增加，酒质清淡爽口；采用液体高效糖化酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽质量差、酶活力不足，提高麦汁中可发酵性糖的含量；发酵液中添加脯氨酸内切酶，可以增强啤酒的非生物稳定性；向发酵液中添加α-乙酰乳酸脱羧酶，可以方便快捷的降低双乙酰含量等。
酶制剂一般是以液态形式加入到糖化或发酵罐等罐体中，这种外源酶一旦加入就难以分离并再利用，由于酶制剂价格一般比较高，单次利用对成本不利。另外，添加到发酵罐内的酶制剂不会经过蒸煮过程变性析出，一般在成品酒经巴氏灭菌后仍存在一定的酶活力，以后在啤酒存放过程中，受到残余酶的作用，啤酒口味会变甜、寡淡。不仅如此，酶的添加量也应受到严格控制，例如糖化酶对羧肽酶有一定的破坏作用，故若用量不当，会影响啤酒的泡沫稳定性，并使成品酒呈一定的涩味。最后，酶制剂一般不可能将生产菌带入酶中，但是生产过程不可能是无菌操作，会带来一定量的微生物，增加染菌的风险。总之，使用酶制剂的单位成本及其产生的效果都应仔细核算，投入和产出应做到平衡或得益更多一些。酶制剂的这些限制因素导致了其应用受到一定影响。
将酶或酵母细胞固定化是改善上述酶制剂问题，提高发酵效率的有效手段之一。固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，克服了游离酶的上述不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点，因此酶或细胞的固定化受到研究者日益重视。
但固定化酶也存在明显的问题。限制固定化酶产业化应用的主要原因有：
(1)酶固定化的成本较高。固定化成本包括酶、载体以及所用化学试剂的费用、制备工艺费用及固定化效率等。以载体为例，目前国内研究固定化所用的载体材料几乎都集中在海藻酸盐、卡拉胶或一些大孔树脂等有机材料上，虽然固定化效果较好，载体材料耐腐蚀性差，有压力存在时经一段时间后易变形，并且无法再生。。另外，连续操作需要的设备比较复杂，这些因素大大增加细胞固定化的成本，限制了此技术在国内的工业化应用。
(2)固定化对活性影响较大。酶的三维构象对微环境非常敏感，一些固定化方法如吸附法，对酶分子的三维构象、柔顺性等无明显不良影响，因而可获得较高的固定化酶活性。但由于酶三维构象的变换自由度与游离酶相似，酶的稳定性难尽人意。其它的一些固定化方法如共价法，由于酶的三维构象及其柔顺性受到限制，而且所用的固定化载体有可能会触及到酶的活性敏感区，常伴随酶活性的大量丧失。如何获得具有理想三维构象柔顺性的固定化酶体系一直是生物催化剂多相反应体系难以解决的科学问题之一。
尽管如此，随着生物、信息和纳米技术的发展，以及对环境保护意识的增强，人们还再根据传统酶固定化技术存在的问题，不断探索改进、完善和发展新的酶固定化方法。因此，具有工业化应用前景的载体，高效稳定的固定化技术，高活性长寿命的固定化酶或细胞以及其在啤酒酿造行业中的实际应用性，是目前该领域的研究重点和难点所在。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种酶的固定化方法，该方法操作简单，重复性好，可以大大提高固定化酶的稳定性和重复性，从而降低啤酒产业的生产成本。
根据本发明的酶的固定化方法，所述方法包括如下步骤：
(1)在含有待固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的缓冲溶液中加入到氯化钙溶液A中，在一定温度下反应一段时间，离心分离，洗涤，得到形成带有初步固定化酶的纳米花结构，其中相对于每毫克载体Ca3(PO4)2，固定化酶的含量约为0.12～3.13mg。
(2)将上述步骤(1)中得到的纳米花分散到的海藻酸钠溶液中，搅拌。
(3)将上述步骤(2)中得到的分散液以一定的滴加速度逐滴加入到氯化钙溶液B中，搅拌固化后得到直径约为1至2μm的微球，离心分离，将微球用蒸馏水洗涤三次，得到包覆了海藻酸钙(ALG)的酶和磷酸钙的微球最终产品。
优选地，步骤(1)中所述ALDC缓冲溶液为PBS缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液)，其中ALDC浓度为0.05-2mg/ml，优选为1.2mg/ml，PBS的浓度为4mmol/L。
优选地，步骤(1)中所述氯化钙溶液A的浓度为0.1-0.5mol/L，优选为0.1-0.3mol/L，进一步优选为0.2mol/L。
优选地，步骤(1)中所述ALDC缓冲溶液与所述氯化钙溶液A的体积比为1:1至200:1，优选为30:1至80:1，进一步优选为50:1。
优选地，步骤(1)中，反应温度为0至60℃，优选为0至40℃，进一步优选为25℃，反应时间为1至24小时，优选为4至18小时，进一步优选为12小时。
优选地，步骤(2)中，所述海藻酸钠的浓度为0.01至0.06g/ml，优选为0.02至0.04g/ml，进一步优选为0.03g/ml；所述纳米花中含有的ALDC与所述海藻酸钠重量比为17:100至17:500，优选为17:150至17:400，进一步优选为17:300。
优选地，步骤(2)中，所述搅拌时间为0.5至2小时，优选为1小时。
优选地，步骤(3)中，所述滴加速度为1至10ml/min，优选为1至5ml/min，进一步优选为3ml/min。
优选地，步骤(3)中，所述氯化钙溶液B的浓度为0.5至2.5mol/L，优选为1.0至2.5mol/L，进一步优选为2.0mol/L。
优选地，步骤(3)中，所述搅拌固化时间为5分钟至60分钟，优选为5分钟至30分钟，进一步优选为15分钟。
根据本发明的一个方面，提供了一种包覆了海藻酸钙的酶和磷酸钙的微球，所述微球根据本发明的酶固定化方法制备。
根据本发明的一个方面，提供了一种根据本发明的酶固定化方法制备的包覆了海藻酸钙的酶和磷酸钙的微球在啤酒生产中的用途。
有益效果
根据本发明的固定化酶方法与其他的酶固定方法相比，能够充分保留酶的活性甚至提高酶的活性。但是由于纳米结构一些共有的缺点，如机械强度弱，粒径小，对外界环境敏感等，限制了纳米花固定酶的稳定性和重复利用性，使其不能在工业上得到广泛应用。而本发明的发明人将此纳米花固定化酶用海藻酸钠包覆之后制备成2mm左右的微球，使得固定化酶活能保持在游离酶活的98％以上。同时也使固定酶具有了稳定性和可重复性利用性。为其在工业上的应用提供了广泛前景。
附图说明
图1为实施例1中制备的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花结构的SEM扫描图。
图2为实施例1中制备的海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球的照片。
图3为样品的酶活性测试结果的柱状图，其中图3a为游离ALDC的酶活性；图3b为根据实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花的酶活性；图3c为根据实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球的酶活性；以及图3d为根据对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆的ALDC微球酶活性。
图4为pH值对样品酶活性的影响曲线，其中图4a为pH值对游离ALDC的酶活性的影响曲线；图4b为pH值对根据实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花的酶活性的影响曲线；图4c为pH值对根据实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球的酶活性的影响曲线；以及图4d为pH值对根据对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆的ALDC微球酶活性的影响曲线。
图5为温度对样品酶活性的影响曲线，其中图5a为温度对游离ALDC的酶活性的影响曲线；图5b为温度对根据实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花的酶活性的影响曲线；图5c为温度对根据实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球的酶活性的影响曲线；以及图5d为温度对根据对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆的ALDC微球酶活性的影响曲线。
图6为表示重复性利用的实验结果的柱状图，其中图6a为根据实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花的重复性利用的实验结果；图6b为根据对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆的ALDC微球酶活性重复性利用的实验结果；图6c为根据实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球的酶活性的重复性利用的实验结果。
具体实施方式
在根据本发明的酶的固定化方法的步骤(1)中所述ALDC缓冲溶液为PBS缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液)，其中ALDC浓度为0.05-2mg/ml，当控制ALDC浓度在此范围内时，形成的纳米花形貌良好，即，表面积较大，而不会形成表面光滑的圆球等形貌；而当ALDC浓度不在此范围内时，即小于0.05mg/ml或者大于2mg/ml时，形成的纳米颗粒表面的褶皱突起较小，即表面可能较为光滑，这使得比表面积较小，不利于酶的固定化。ALDC的浓度优选为1.2mg/ml，在此浓度下形成的纳米花形貌最佳，即纳米颗粒的表面积最大化且，颗粒粒径适当，团聚现象小。
优选地，步骤(1)中所述氯化钙溶液A的浓度为0.1-0.5mol/L，优选为0.1-0.3mol/L，进一步优选为0.2mol/L。
优选地，步骤(1)中所述ALDC缓冲溶液与所述氯化钙溶液A的体积比为1:1至200:1，优选为30:1至80:1，进一步优选为50:1。当所述ALDC缓冲溶液与所述氯化钙溶液A的体积比小于1:1时，则由于溶液中钙离子含量过大，有可能导致酶不能稳定地固定在纳米花表面上，这可能是由于纳米花表面存在大量钙阳离子而导致削弱了酶与纳米花表面的相互静电作用引起；当所述ALDC缓冲溶液与所述氯化钙溶液A的体积比大于200:1时，则由于溶液中钙离子含量过小，也有可能导致酶不能稳定地固定在纳米花表面上，这可能是由于钙离子含量过少使得酶与纳米花表面的相互作用太小。
优选地，步骤(1)中，反应温度为0至60℃，优选为0至40℃，进一步优选为25℃，反应时间为1至24小时，优选为4至18小时，进一步优选为12小时。
优选地，步骤(2)中，所述海藻酸钠的浓度为0.01至0.06g/ml，优选为0.02至0.04g/ml，进一步优选为0.03g/ml；所述纳米花中含有的ALDC与所述海藻酸钠重量比为17:100至17:500，优选为17:150至17:400，进一步优选为17:300。当所述纳米花中含有的ALDC与所述海藻酸钠重量比在17:100至17:500的范围内时，可以确保海藻酸钠具有良好的溶解状态，同时保证溶液具有适当的粘稠度，而当所述纳米花中含有的ALDC与所述海藻酸钠重量比低于17:100或高于17:500时，可能由于所述海藻酸钠的含量过低或过高，而导致溶液粘稠度不适当或海藻酸钠不能很好地溶解。
优选地，步骤(2)中，所述搅拌时间为0.5至2小时，优选为1小时。
优选地，步骤(3)中，所述滴加速度为1至10ml/min，优选为1至5ml/min，进一步优选为3ml/min，当滴加速度控制在1至10ml/min范围内时，可以确保形成的颗粒的球形完整，而当滴加速度不在此范围内时，形成的颗粒粒度不够均匀，且形貌不规整。
优选地，步骤(3)中，所述氯化钙溶液B的浓度为0.5至2.5mol/L，优选为1.0至2.5mol/L，进一步优选为2.0mol/L。当所述氯化钙溶液B的浓度控制在0.5至2.5mol/L范围内时，可以确保海藻酸钠小球瞬间凝固，而不致变形或严重团聚。
以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。
以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。
实施例1
(1)将45ml浓度为1.2mg/ml的ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中加入0.9ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液中，于25℃反应12小时，12000rpm离心10min，并且用蒸馏水离心洗涤三次，得到Ca3(PO4)2–ALDC纳米花。
(2)用紫外-可见分光光度计法计算步骤(1)得到的上清液以及洗涤液中的酶含量可以获得Ca3(PO4)2–ALDC纳米花上的酶负载量为1.9mg/Ca3(PO4)2(1mg)。取负载了17mgALDC酶的纳米花分散在0.03mol/L的10ml的海藻酸钠溶液中，搅拌1小时获得均一的分散液。
(3)将步骤(2)中得到的分散液用注射器以3ml/min的速度滴入100ml的浓度为2.0mol/L的CaCl2溶液中，搅拌固化15min后，离心分离，用蒸馏水洗涤三次，获得海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球，直径约为2mm，具体参见图2。
图1为步骤(1)中得到的Ca3(PO4)2-ALDC纳米花结构的SEM扫描图，从图中可以看出，纳米花具有完整的花型结构以及多孔结构，这种结构增加了其比表面积以及ALDC的活性。
图2为步骤(3)中得到的海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球的照片，从图中可以看出，得到的海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球粒径分布均匀，直径约为2mm。
实施例2
除了将步骤(1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中ALDC的浓度设置为0mg/ml以外，即不含ALDC，按照实施例1相同的方法制备海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2纳米花微球。
实施例3
除了将步骤(1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中ALDC的浓度设置为0.05mg/ml以外，按照实施例1相同的方法制备海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球。
实施例4
除了将步骤(1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中ALDC的浓度设置为0.1mg/ml以外，按照实施例1相同的方法制备海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球。
实施例5
除了将步骤(1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中ALDC的浓度设置为0.2mg/ml以外，按照实施例1相同的方法制备海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球。
实施例6
除了将步骤(1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中ALDC的浓度设置为0.6mg/ml以外，按照实施例1相同的方法制备海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球。
实施例7
除了将步骤(1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中ALDC的浓度设置为0.8mg/ml以外，按照实施例1相同的方法制备海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球。
实施例8
除了将步骤(1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中ALDC的浓度设置为1mg/ml以外，按照实施例1相同的方法制备海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球。
实施例9
除了将步骤(1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中ALDC的浓度设置为1.4mg/ml以外，按照实施例1相同的方法制备海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球。
实施例10
除了将步骤(1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中ALDC的浓度设置为1.8mg/ml以外，按照实施例1相同的方法制备海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球。
实施例11
除了将步骤(1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液中ALDC的浓度设置为2mg/ml以外，按照实施例1相同的方法制备海藻酸钙包覆的Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球。
表1初始ALDC浓度对负载量/Ca3(PO4)2(mg)的影响
Figure BDA0001009365440000111
其中所述“初始酶量”为反应开始前，ALDC的PBS缓冲溶液中含有的酶的总量＝ALDC初始浓度×PBS缓冲溶液的体积；所述“总负载量”为反应结束后被固载的酶量＝初始酶量-上清液中的酶量；所述“ALDC负载量/Ca3(PO4)2(mg)”为每毫克磷酸钙负载的酶量。
初始酶浓度对负载量的影响见表1，从表中可以看出，随着初始酶浓度的增加，纳米花中每毫克磷酸钙所结合的酶量逐步增加，从0.12mg/Ca3(PO4)2(1mg)逐渐升至3.14mg/Ca3(PO4)2(1mg)。但当ALDC初始浓度继续增加，超过2.0mg/ml后，ALDC负载量增加不多，因为ALDC负载量已趋于饱和。
对比实施例1
(1)取10ml浓度为1.7mg/ml的ALDC的PBS(4mmol/L，pH＝7.4)缓冲液分散在0.03mol/L浓度为10ml的海藻酸钠溶液中，搅拌1小时获得均一的分散液。
(2)将步骤(1)中得到的分散液用注射器以3ml/min的速度滴入2.0M，100ml的CaCl2溶液中，搅拌固化15min后，用蒸馏水洗涤三次，获得海藻酸钙包覆ALDC微球。
实验实施例1：酶活性测试
将游离ALDC、实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花、实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球以及对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆的ALDC微球为样品，检测其ALDC的活性。
ALDC酶活性的检测以α-乙酰乳酸为底物，在pH 6.0，温度30℃的条件下，将每分钟ALDC反应转化生成1μmol乙偶姻所需的酶量定义为一个酶活力单位。
酶活性测定步骤：
(1)乙偶姻标准曲线的绘制。将乙偶姻标准品配置成不同浓度的溶液，各种浓度取400μL，加入4.6ml显色剂，30℃显色40min后于波长522nm处读取吸光值，用吸光值对乙偶姻浓度作图，制得乙偶姻标准曲线图。
(2)游离ALDC酶活性的测定。将原酶液稀释一定的倍数，取20μL稀释酶液于试管中，加入MES缓冲溶(pH值6.0)300μL，30℃水浴预热10min后，在反应管中加入80μL的α-乙酰乳酸为底物，迅速混合后置于30℃恒温水浴中精确反应20min后，迅速加入4.6mL显色剂，混匀，置于30℃显色40min后于波长522处读取吸光值，对照标准曲线，求得转化生成乙偶姻的量。
(3)实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花、实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球以及对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆的ALDC微球酶活性的测定。取含有与游离酶等量酶的此三种固定化酶样品进行实验，对照标准曲线，得到这三种固定化酶作用下转化生成乙偶姻的量。
(4)将游离酶的酶活性设为100％，用固定化酶的酶活性除以游离酶的酶活性，可得三种固定化酶的相对酶活。
结果见图3，从图3中可以看出根据本发明的方法制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球能保持自由酶活性的98％以上。而仅由海藻酸钙包覆ALDC的活性仅为自由酶的70％左右。
实验实施例2：pH值对产品性质的影响
分别用pH为3.5、4、4.5、5、5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，pH为6、6.5的MES缓冲溶液以及pH为7、7.5、8的Tris-HCl缓冲溶液代替酶活测定步骤(2)中的MES缓冲液，其余条件不变，对所述四种样品进行酶活测试，可以获得pH对四种样品活性的影响曲线。将最适pH值处的活性(即最高活性设为100％，其余pH处活性为相对于最高活性的相对活性)
图4为pH值对样品酶活性的影响曲线，其中图4a为pH值对游离ALDC的酶活性的影响曲线；图4b为pH值对根据实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花的酶活性的影响曲线；图4c为pH值对根据实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球的酶活性的影响曲线；以及图4d为pH值对根据对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆的ALDC微球酶活性的影响曲线。
从图4中可以看出游离酶在pH超过5以后活性急剧下降，而ALDC-Ca3(PO4)2纳米花的酶活性在pH3.5～7.5范围内仍能保持85％以上的活性，但当pH超过7.5时，活性也会急剧下降。而海藻酸钙与ALDC可以较好地克服pH的影响(图4d的曲线)，因此制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球的酶活性即使在pH大于7.5时，仍然能够保持85％以上的活性。
实验实施例3：温度对产品性质的影响
将实验实施例1的酶活性测试步骤(2)中的反应温度(恒温水浴，非显色温度)分别设置为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃，其余反应条件不变，对四种样品进行酶活性测试，可以获得温度对四种样品活性影响曲线。将最适温度处的活性(即最高活性)设为100％，其余温度处活性为相对于最高活性的相对活性。
图5为温度对样品酶活性的影响曲线，其中图5a为温度对游离ALDC的酶活性的影响曲线；图5b为温度对根据实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花的酶活性的影响曲线；图5c为温度对根据实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球的酶活性的影响曲线；以及图5d为温度对根据对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆的ALDC微球酶活性的影响曲线。
温度对四种样品的影响见图5，从图中可以看出，根据本发明的方法制备得到的海藻酸钙包覆Ca3(PO4)2–ALDC的纳米花微球在45～75℃范围内仍能保持85％的以上的活性，而仅由海藻酸钙包覆ALDC在55℃以上，游离酶在65℃以上才能保持较好的活性。
实验实施例4：重复利用性实验
将根据实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花、根据实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球以及根据对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆的ALDC微球三种样品进行酶活测定步骤(3)中的与底物进行反应后，将此三种样品离心取出洗涤后重复步骤(3)。如此重复6次，获得三种固定化酶重复使用6次每次的酶活。将第一次的酶活设为100％，其余使用后的酶活为相对于最高酶活的相对酶活。
图6为表示重复性利用的实验结果的柱状图，其中图6a为根据实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花的重复性利用的实验结果；图6b为根据对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆的ALDC微球酶活性重复性利用的实验结果；图6c为根据实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆ALDC-Ca3(PO4)2纳米花微球的酶活性的重复性利用的实验结果。
对三种样品做了重复性利用的实验，实验结果如图6所示，根据实施例1的步骤(3)中制备的海藻酸钙包覆Ca3(PO4)2–ALDC纳米花微球在重复利用六次时依旧能够保证酶活在70％以上。而根据对比实施例1中制备的海藻酸钙包覆ALDC在重复利用六次时能保证酶活在60％以上。但是根据实施例1的步骤(1)中制备的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花在重复利用六次时，酶活仅为原酶活的25％左右。由此可见，海藻酸钙包覆Ca3(PO4)2–ALDC相比于单纯的ALDC-Ca3(PO4)2纳米花和海藻酸钙包覆ALDC具有很好的可重复利用性。

Claims (16)

1.一种酶的固定化方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将含有待固定化的α-乙酰乳酸脱羧酶的磷酸盐缓冲溶液中加入到氯化钙溶液A中，在反应温度为0至60℃下反应1至24小时，离心分离，洗涤，得到形成带有初步固定化酶的纳米花结构，其中相对于每毫克载体Ca3(PO4)2，固定化酶的含量为0.12～3.13mg，所述α-乙酰乳酸脱羧酶的磷酸盐缓冲溶液中的α-乙酰乳酸脱羧酶浓度为0.05-2mg/ml，磷酸盐的浓度为4mmol/L，所述氯化钙溶液A的浓度为0.1-0.5mol/L，所述α-乙酰乳酸脱羧酶的磷酸盐缓冲溶液与所述氯化钙溶液A的体积比为1:1至200:1；
(2)将上述步骤(1)中得到的纳米花分散到海藻酸钠溶液中，搅拌，所述海藻酸钠的浓度为0.01至0.06g/ml，所述纳米花中含有的α-乙酰乳酸脱羧酶与所述海藻酸钠重量比为17:100至17:500，所述搅拌时间为0.5至2小时；
(3)将上述步骤(2)中得到的分散有纳米花的海藻酸钠溶液以1至10ml/min的滴加速度逐滴加入到氯化钙溶液B中，搅拌固化后得到直径为1至2μm的微球，离心分离，将微球用蒸馏水洗涤三次，得到包覆了海藻酸钙的酶和磷酸钙的微球最终产品，所述氯化钙溶液B的浓度为0.5至2.5mol/L，所述搅拌固化时间为5分钟至60分钟。
2.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(1)中所述α-乙酰乳酸脱羧酶为1.2mg/ml。
3.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(1)中所述氯化钙溶液A的浓度为0.1-0.3mol/L。
4.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(1)中所述氯化钙溶液A的浓度为0.2mol/L。
5.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(1)中所述α-乙酰乳酸脱羧酶的磷酸盐缓冲溶液与所述氯化钙溶液A的体积比为30:1至80:1。
6.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(1)中所述α-乙酰乳酸脱羧酶的磷酸盐缓冲溶液与所述氯化钙溶液A的体积比为50:1。
7.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(1)中，反应温度为0至40℃，反应时间为4至18小时。
8.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(1)中，反应温度为25℃，反应时间为12小时。
9.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述海藻酸钠的浓度为0.02至0.04g/ml；所述纳米花中含有的α-乙酰乳酸脱羧酶与所述海藻酸钠重量比为17:150至17:400；所述搅拌时间为1小时。
10.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述海藻酸钠的浓度为0.03g/ml；所述纳米花中含有的α-乙酰乳酸脱羧酶与所述海藻酸钠重量比为17:300。
11.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述滴加速度为1至5ml/min。
12.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述滴加速度为3ml/min。
13.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述氯化钙溶液B的浓度为1.0至2.5mol/L；所述搅拌固化时间为5分钟至30分钟。
14.根据权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述氯化钙溶液B的浓度为2.0mol/L；所述搅拌固化时间为15分钟。
15.一种包覆了海藻酸钙的α-乙酰乳酸脱羧酶和磷酸钙的微球，所述微球根据权利要求1至14中任意一项所述的酶固定化方法制备。
16.根据权利要求15中所述的包覆了海藻酸钙的α-乙酰乳酸脱羧酶和磷酸钙的微球在啤酒生产中的用途。
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