CN111057700A - 一种基于天然多糖颗粒的脂肪酶界面固定化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于天然多糖颗粒的脂肪酶界面固定化的方法。该方法将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，剪切均质使壳聚糖颗粒均匀分散；添加京尼平，交联壳聚糖颗粒，在维持温度以及pH恒定的条件下交联，形成交联壳聚糖颗粒的分散液；将交联壳聚糖颗粒的分散液进行高压微射流处理，分散颗粒；在所得的壳聚糖颗粒分散液中添加矿物油，形成水包油型皮克林乳液，添加脂肪酶，乳液离心分层后取乳析层，得到表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的核壳结构微球，实现脂肪酶界面固定化。相比游离酶，微球可在两相体系下稳定油水界面形成乳液，在油水界面处催化脂质水解的反应的活力大幅提高，加工稳定性高，不需要有机溶剂增溶脂质底物，可直接应用于食品加工中。

Description

一种基于天然多糖颗粒的脂肪酶界面固定化的方法
技术领域
本发明涉及脂肪酶固定，特别是涉及一种基于天然多糖颗粒脂肪酶界面固定化的方法；属于脂肪酶应用技术领域。
背景技术
脂肪酶的脂质底物不溶于水，工业应用中常加入有机溶剂或表面活性剂增溶底物，但是对于食品加工，应避免使用有毒有机溶剂和表面活性剂增溶底物。食品通常是油水共存的多相体系，因此有限的油水界面面积和界面张力对酶的变性作用成为制约酶催化效率的主要因素。这就要求固定化酶的材料具有界面活性，通过稳定油水界面形成乳液的方式给脂肪酶提供足够大的油水界面面积及缩短底物传质距离，并减轻界面张力对脂肪酶的变性作用。并且固定化酶的材料应选择食品原料，具有生物安全性。
传统脂肪酶固定化技术主要用于改善脂肪酶在非水环境下的稳定性。传统的固定化方法包括物理吸附，包埋，交联和共价连接。吸附是一种简单且廉价的方法，解吸是该方法的主要缺点，导致在回收和再利用过程中酶的损失。包埋和包封提供了对酶的微环境的更多保护，控制孔径对于防止酶泄露同时确保底物扩散至关重要。共价和亲和力附着防止蛋白质从载体泄漏，但是共价连接可能导致酶活性的丧失，而且需要载体表面官能化，增加额外的步骤。交联可以提供无载体固定，但是需要优化交联参数以防止活性位点阻塞或变性。中国发明专利申请2014107493334公开了一种可用于高酸值餐厨废弃油脂转化生物柴油的壳聚糖修饰生物炭基固定化酶的制备方法。采用花生壳制成的多孔结构的生物炭，壳聚糖修饰生物炭的孔隙结构，相反电荷的静电吸附促进脂肪酶分子在基质载体上的固定。该申请利用壳聚糖与酶的静电相互作用增强脂肪酶在有机溶剂中的稳定性，但其载体整体是不具有界面活性的。
纳米材料由于其高表面积而成为新型酶稳定化材料，使酶的活性和稳定性增强。纳米粒子可以通过减少侧向蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质与载体的相互作用来操纵酶的微环境，从而导致酶活性增加。实际上，结合到纳米级载体上(接近酶本身的流体动力学半径)的固定化酶的保留活性可以接近天然酶的活性。中国专利申请201510250417公开了一种四氧化三铁纳米颗粒用于固定脂肪酶。中国专利申请201810537000公开了一种氨基化改性磁性纳米四氧化三铁-二氧化硅颗粒用于固定脂肪酶。两者都能改善脂肪酶在中的稳定性。但是目前大多数纳米材料生物安全性未受过验证，不能直接用于食品加工，而且未有报道这些纳米颗粒具有界面活性。从食品原料中制备界面活性纳米颗粒并进一步构建由其等级组装的微米尺度结构用于固定化酶是目前食品用酶的现实需求。利用界面活性纳米颗粒构建具有界面活性的微球，同时呈现出纳米和微米形态，可改善实际加工操作性和安全性。
发明内容
为了解决上述现有技术在固定化材料的界面活性和生物安全性方面的不足，尤其是有机溶剂配合，难以在食品加工中直接应用的问题，本发明目的在于提供一种采用食品原料构造的荷载脂肪酶的核壳结构微球，在两相体系下提高脂肪酶脂质水解反应活性和加工稳定性，无需有机溶剂，可直接应用于增加食品风味成分和营养价值的一种基于天然多糖颗粒的脂肪酶界面固定化的方法。
本发明利用天然可食用的壳聚糖制备了具有界面活性的纳米级颗粒，壳聚糖纳米颗粒粒径大小均衡，界面活性高。壳聚糖颗粒可制备稳定性高的皮克林乳液。壳聚糖颗粒通过静电作用吸附脂肪酶至油滴表面，通过油芯固化形成微球。微球具有界面活性，可增加两相体系界面面积，降低界面张力对酶的变性作用，提高酶与底物的接触机会，无需有机溶剂，为脂肪酶在食品绿色加工中的应用提供新的途径。
本发明首先利用壳聚糖分子在中性pH条件下溶解性下降的特点，通过调节pH结合微射流分散制备壳聚糖纳米颗粒。壳聚糖纳米颗粒具有界面活性，通过剪切制备稳定的皮克林乳液，并使油芯固化。乳液油滴表面的正电荷的壳聚糖纳米颗粒通过静电相互作用吸附负电荷的脂肪酶，温和的静电吸附有利于保留酶催化活性，形成表面吸附酶的核壳结构微球，利于实际加工操作。本发明的微球具有良好的生物相容性，降低了界面张力对酶的变性作用，提高酶催化能力，增强了酶的加工稳定性，为脂肪酶在食品绿色加工中的应用提供新的途径。目前尚没有结合纳米颗粒技术和宏观微球的固定化酶的报道。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种基于天然多糖颗粒的脂肪酶界面固定化的方法，包括如下步骤：
(1)将壳聚糖溶解于乙酸溶液中；调节溶液pH值为1-8，剪切均质使壳聚糖颗粒均匀分散；按照体积分数0.001-1％添加质量浓度为0.5-2％的京尼平，交联壳聚糖颗粒，在维持温度以及pH恒定的条件下，35-45℃交联24-48h，形成交联壳聚糖颗粒的分散液；将交联壳聚糖颗粒的分散液进行高压微射流处理，分散颗粒，控制颗粒粒径为30-100nm，ζ-电位20-50mV；
(2)在步骤(1)所得的壳聚糖颗粒分散液中添加矿物油，矿物油中含0.5-2wt％的12-羟基硬脂酸，预热使12-羟基硬脂酸溶解；60-80℃均质乳化，形成水包油型皮克林乳液，冷却至室温使油芯固化；按水包油型皮克林乳液水相质量的0.0125-2.5％添加脂肪酶，调节乳液pH到1-8，混合搅拌，乳液离心分层后取乳析层，得到表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的核壳结构微球，实现脂肪酶界面固定化。
为进一步实现本发明目的，优选地，步骤(1)中，所述的乙酸溶液的质量浓度1-10％的，制成的壳聚糖溶液的质量浓度为0.1-1％。
优选地，步骤(1)中，所述的调节溶液pH值为1-8是通过滴加盐酸或NaOH进行；步骤(2)中所述的调节乳液pH到1-8是通过滴加盐酸或NaOH进行。
优选地，步骤(1)中，交联剂京尼平在35-45℃恒温水溶中交联壳聚糖颗粒。
优选地，步骤(1)中，添加质量浓度为0.5-2％的京尼平后混合搅拌5-10min。
优选地，步骤(1)中，进行高压微射流处理的微射流压力50-150MPa，高压微射流处理重复2-5次；所述的剪切均质的转速为5000-10000rpm。
优选地，步骤(2)中，矿物油按油体积分数20-50％混合，小型均质搅拌机均质速率8000-30000rpm，均质乳化的时间1-2min，均质温度60-80℃，所得乳液的粒径范围为10-40μm。
优选地，步骤(2)中，所述预热的温度为60-80℃；所述的混合搅拌的时间为0.5-1h；所述的乳液离心分层的离心转速为1000-3000rpm。
优选地，步骤(2)中，脂肪酶的加入是用脂肪酶水溶液形式加入，脂肪酶水溶液中脂肪酶的质量浓度为5％-10％。
优选地，步骤(1)中，所述的壳聚糖颗粒的平均粒径为30-100nm；步骤(2)中所述的表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的核壳结构微球的粒径为10-40μm；
所述的表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的核壳结构微球在油水两相体系下稳定油水界面并高效催化脂质底物水解，按水包油型皮克林乳液水相质量的0.0125-2.5％添加脂肪酶，调节乳液pH到1-7.5时，催化脂质水解反应的活力稳定为0.2-1.3U/mg；其中，按水包油型皮克林乳液水相质量的2.5％添加脂肪酶，调节乳液pH到6.5时，催化脂质水解反应的活力为1.2-1.3U/mg，循环催化15次后酶活保留率大于70％。
相对于现有技术存在的不足，本发明具有如下优点和有益效果：
1)本发明借助常见食品载体(壳聚糖)构造纳米颗粒，粒径30-100nm，电位20-50mV,与脂肪酶(电位-20mV)静电相互作用能力强。
2)本发明所得的核壳结构微球可在油水两相体系下稳定油水界面并高效催化脂质底物水解，不需要使用有机溶剂增溶脂质底物，由于本发明方法原料环保，不含有机溶剂，核壳结构微球可直接用于食品加工。
3)本发明壳聚糖纳米颗粒具有界面活性,实现油水界面稳定效果，制备乳液粒径范围为10-40μm，通过油相固化形成稳定性强的微球。
4)本发明利用壳聚糖与脂肪酶之间静电相互作用实现酶在固化油滴表面的富集与固定，提高酶的稳定性。制备的包覆壳聚糖和脂肪酶的微球相较游离酶，在两相体系下高效催化脂质水解反应，催化循环次数增加，加工pH稳定性增强。酯水解反应酶活1.2-1.4U/mg，循环催化15次后酶活保留率大于70％，在pH2.5-pH6.5范围之间酶活大于0.6U/mg。
附图说明
图1为对比例2和实施例1所制备的壳聚糖纳米颗粒的SEM图
图2为实施例1制备的吸附脂肪酶的微球的激光共聚焦显微镜图
图3为实施例2中制备的荷载脂肪酶的微球的酶固定化率。
图4为对比例2所制备的壳聚糖纳米颗粒和实施例1制备的微球降低油水界面张力的图。
图5为微球在油水两相体系下稳定油水界面形成乳液的图。
图6为对比例1、对比例2、实施例1的游离脂肪酶，吸附脂肪酶的纳米颗粒和吸附脂肪酶的微球分别催化棕榈酸对硝基苯酯水解反应的活力对比图。
图7为实施例2中游离酶和不同pH的微球催化棕榈酸对硝基苯酯水解反应的活力对比图。
图8显示实施例3中不同酶含量的微球催化棕榈酸对硝基苯酯水解反应的活力变化图。
图9为实施例4中微球循环催化棕榈酸对硝基苯酯水解反应的活力变化图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
对比例1
(1)准备4mL脂肪酶质量浓度为0.25wt％的溶液，搅拌30min。
(2)添加4mL的矿物油，矿物油含浓度为2.5mg/mL棕榈酸对硝基苯酯作为底物，均质乳化1min。反应1min后的添加1M NaCO3至乳液体系终止反应；静置分层，取下层水相，10000rpm离心30min，测定410nm吸光值。以水解棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)生成水溶性对硝基苯酚(p-NP)为模型反应测定两相体系下脂质底物转化率，根据p-NP的标曲计算。
对比例2
(1)将壳聚糖均匀分散于1.0％乙酸溶液中，制成0.5wt％的溶液。缓慢调节溶液到pH值为6.5，10000rpm剪切5min，在维持温度以及pH恒定的条件下，按溶液体积分数0.08％添加京尼平来交联壳聚糖，37℃交联24h。交联完成后，100MPa均质三次分散壳聚糖颗粒。取4mL壳聚糖颗粒分散液，添加脂肪酶至质量浓度为0.25wt％，混合搅拌30min。
(2)添加4mL的矿物油，矿物油含浓度为2.5mg/mL棕榈酸对硝基苯酯作为底物，均质乳化1min。反应1min后的添加1M NaCO3至乳液体系终止反应；静置分层，取下层水相，10000rpm离心30min，测定410nm吸光值。以水解棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)生成水溶性对硝基苯酚(p-NP)为模型反应测定测定两相体系下脂质底物转化率，根据p-NP的标曲计算。
实施例1
(1)将壳聚糖均匀分散于1wt％乙酸溶液中，制成0.5wt％的溶液；缓慢调节溶液到pH值为6.5，10000rpm剪切5min，在维持温度以及pH恒定的条件下，按溶液体积分数0.08％添加京尼平来交联壳聚糖，37℃交联24h；交联完成后，100MPa均质三次分散壳聚糖颗粒；
(2)取4mL壳聚糖颗粒分散液，添加4mL含0.5wt％的12羟基硬脂酸的矿物油，80℃均质乳化1min形成皮克林乳液，乳液冷却至室温后按乳液水相质量浓度0.25wt％来添加脂肪酶，调节乳液pH值为6.5，混合搅拌30min，2000rpm离心10min，收集乳析层，用去离子水洗涤，得到表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的微球，分散于去离子水中至4mL备用。
(3)添加4mL的矿物油，矿物油含浓度为2.5mg/mL棕榈酸对硝基苯酯作为底物，均质乳化1min。反应1min后的添加1M NaCO3至乳液体系终止反应；静置分层，取下层水相，10000rpm离心30min，测定410nm吸光值。以水解棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)生成水溶性对硝基苯酚(p-NP)为模型反应测定两相体系下脂质底物转化率，根据p-NP的标曲计算。
壳聚糖颗粒粒径和形态测定方法：颗粒分散液稀释至0.05％，取2微升平铺在云母片上，过夜风干，喷金，扫描电镜观察。
微球粒径和形态测定方法：用荧光染料FITC共价标记脂肪酶，采用激光共聚焦显微镜于488nm下观察。
酶的固定化率的测定方法：微球体系10000rpm离心10min,通过离心分离乳析层和水层，用考马斯亮蓝法测定水层的蛋白含量。计算公式：(脂肪酶的添加量-水层蛋白质含量)/脂肪酶的添加量*100％
油水界面张力的测定方法：采用悬滴法测定壳聚糖颗粒和微球的界面活性。
图1是对比例2和实施例1制备的壳聚糖颗粒的扫描电镜图像，说明颗粒粒径约为50nm。
图2为实施例1制备的微球的激光共聚焦显微镜图。圆形油滴构成微球的核体，油滴表面存在明显的吸附层，并且显现红色荧光，说明脂肪酶与油滴表面的壳聚糖层相互作用形成壳体，形成微球直径约5-20μm之间。
图3是实施例1制备的微球的酶的固定化率，大于95％的固定化率说明脂肪酶不易从微球表面解吸，物理稳定性较强。
图4是实施例1制备的微球降低的界面张力，说明微球具有界面活性。
图5是实施例1制备的微球在两相体系下作为稳定剂所形成的乳液。说明微球具有界面活性，在两相体系中可以通过形成乳液制造足够大的两相界面面积，有利于脂肪酶催化。
图6显示对比例1中的游离脂肪酶，对比例2中的脂肪酶-壳聚糖颗粒和实施例1中的微球在两相体系下催化脂质底物水解的反应的活性。结果表明对比例1的游离酶的水解酶活0.20U/mg，而对比例2的脂肪酶-壳聚糖纳米颗粒的酶活0.63U/mg，实施例1的微球的酶活1.20U/mg。说明微球可以在不使用有机溶剂增溶底物的两相体系中有效催化脂质(棕榈酸对硝基苯酯)的水解。
实施例2
(1)将壳聚糖均匀分散于1％乙酸溶液中，制成0.5wt％的溶液；缓慢调节溶液分别到pH值为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5和7.5，10000rpm剪切5min，在维持温度以及pH恒定的条件下，按溶液体积分数0.08％添加京尼平来交联壳聚糖，37℃交联24h；交联完成后，100MPa均质三次分散壳聚糖颗粒；
(2)取4mL壳聚糖颗粒分散液，添加4mL含0.5wt％的12羟基硬脂酸的矿物油，80℃均质乳化1min形成皮克林乳液，乳液冷却至室温后按乳液水相质量浓度0.25wt％来添加脂肪酶，调节乳液pH值为1.5，混合搅拌30min，2000rpm离心10min，收集乳析层，用去离子水洗涤，得到表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的微球，分散于去离子水中备用。
(3)微球在两相体系下催化脂质底物水解的反应的活性的测定方法同实施例1。
图7显示在不同pH条件下制备的微球催化棕榈酸对硝基苯酯水解反应的酶活，在pH2.5-7.5范围内酶活稳定在0.6U/mg-1.2U/mg范围，说明微球化后脂肪酶的pH稳定性增强。
实施例3
(1)将壳聚糖均匀分散于1％乙酸溶液中，制成0.5wt％的溶液；缓慢调节溶液到pH值为6.5，10000rpm剪切5min，在维持温度以及pH恒定的条件下，按溶液体积分数0.08％添加京尼平来交联壳聚糖，37℃交联24h；交联完成后，100MPa均质三次分散壳聚糖颗粒；
(2)取4mL壳聚糖颗粒分散液，添加4mL含0.5wt％的12羟基硬脂酸的矿物油，80℃均质乳化1min形成皮克林乳液，乳液冷却至室温后按乳液水相质量浓度的0.0125-2％来添加脂肪酶，调节乳液pH值为6.5，混合搅拌30min，2000rpm离心10min，收集乳析层，用去离子水洗涤，得到表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的微球，分散于去离子水中备用。
(3)微球在两相体系下催化脂质底物水解的反应的活性的测定方法同实施例1。
图8显示微球的酶添加量在0.25-2％范围内，酶活稳定在0.9U/mg-1.2U/mg。
实施例4
(1)将壳聚糖均匀分散于1％乙酸溶液中，制成0.5wt％的溶液；缓慢调节溶液到pH值为6.5，10000rpm剪切5min，在维持温度以及pH恒定的条件下，按溶液体积分数0.08％添加京尼平来交联壳聚糖，37℃交联24h；交联完成后，100MPa均质三次分散壳聚糖颗粒；
(2)取4mL壳聚糖颗粒分散液，添加4mL含0.5wt％的12羟基硬脂酸的矿物油，80℃均质乳化1min形成皮克林乳液，乳液冷却至室温后按乳液水相质量浓度的0.0125-2％来添加脂肪酶，调节乳液pH值为6.5，混合搅拌30min，2000rpm离心10min，收集乳析层，用去离子水洗涤，得到表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的微球，分散于去离子水中备用。
(3)乳化体系低温10000rpm离心15min，去除上层破乳析出的油相，收集下层水相中微球，重新添加同体积矿物油，振荡乳化1min，持续循环14次。每次循环中酶活测定：10000rpm离心15min后取少量下层水相，10000rpm离心30min，测定产物410nm吸光值，来计算酶活力。比较每次体外循环的酶活力值。
图9显示实施例4中微球循环催化棕榈酸对硝基苯酯水解反应后的酶活力变化。前8次循环酶活力值也逐渐增加，这说明微球稳定性高，反复催化效果好。当第11次循环结束后酶活力值变化趋于稳定，变化不明显，趋于稳定。说明微球化后脂肪酶催化稳定性增强。
需要说明的是，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型的实施例，这些都应当视为属于本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于天然多糖颗粒的脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，调节溶液pH值为1-8，剪切均质使壳聚糖颗粒均匀分散；按照体积分数0.001-1％添加质量浓度为0.5-2％的京尼平，交联壳聚糖颗粒，在维持温度以及pH恒定的条件下，35-45℃交联24-48h，形成交联壳聚糖颗粒的分散液；将交联壳聚糖颗粒的分散液进行高压微射流处理，分散颗粒，控制颗粒粒径为30-100nm，ζ-电位20-50mV；
(2)在步骤(1)所得的壳聚糖颗粒分散液中添加矿物油，矿物油中含0.5-2wt％的12-羟基硬脂酸，预热使12-羟基硬脂酸溶解；60-80℃均质乳化，形成水包油型皮克林乳液，冷却至室温使油芯固化；按水包油型皮克林乳液水相质量的0.0125-2.5％添加脂肪酶，调节乳液pH到1-8，混合搅拌，乳液离心分层后取乳析层，得到表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的核壳结构微球，实现脂肪酶界面固定化。
2.根据权利要求1所述的基于天然多糖颗粒脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的乙酸溶液的质量浓度1-10％的，制成的壳聚糖溶液的质量浓度为0.1-1％。
3.根据权利要求1所述的基于天然多糖颗粒脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的调节溶液pH值为1-8是通过滴加盐酸或NaOH进行；步骤(2)中所述的调节乳液pH到1-8是通过滴加盐酸或NaOH进行。
4.根据权利要求1所述的基于天然多糖颗粒脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，步骤(1)中，交联剂京尼平在35-45℃恒温水溶中交联壳聚糖颗粒。
5.根据权利要求1所述的基于天然多糖颗粒脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，步骤(1)中，添加质量浓度为0.5-2％的京尼平后混合搅拌5-10min。
6.根据权利要求1所述的基于天然多糖颗粒脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，步骤(1)中，进行高压微射流处理的微射流压力50-150MPa，高压微射流处理重复2-5次；所述的剪切均质的转速为5000-10000rpm。
7.根据权利要求1所述的基于天然多糖颗粒脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，步骤(2)中，矿物油按油体积分数20-50％混合，小型均质搅拌机均质速率8000-30000rpm，均质乳化的时间1-2min，均质温度60-80℃，所得乳液的粒径范围为10-40μm。
8.根据权利要求1所述的基于天然多糖颗粒脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述预热的温度为60-80℃；所述的混合搅拌的时间为0.5-1h；所述的乳液离心分层的离心转速为1000-3000rpm。
9.根据权利要求1所述的基于天然多糖颗粒脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，步骤(2)中，脂肪酶的加入是用脂肪酶水溶液形式加入，脂肪酶水溶液中脂肪酶的质量浓度为5％-10％。
10.根据权利要求1所述的基于天然多糖颗粒的脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的壳聚糖颗粒的平均粒径为30-100nm；步骤(2)中所述的表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的核壳结构微球的粒径为10-40μm；
所述的表面包覆脂肪酶和壳聚糖颗粒的核壳结构微球在油水两相体系下稳定油水界面并高效催化脂质底物水解，按水包油型皮克林乳液水相质量的0.0125-2.5％添加脂肪酶，调节乳液pH到1-7.5时，催化脂质水解反应的活力稳定为0.2-1.3U/mg；其中，按水包油型皮克林乳液水相质量的2.5％添加脂肪酶，调节乳液pH到6.5时，催化脂质水解反应的活力为1.2-1.3U/mg，循环催化15次后酶活保留率大于70％。
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