CN111909427A - 壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球及其制备与应用 - Google Patents

壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于多孔微球的技术领域，公开了壳聚糖‑纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球及其制备与应用。所述制备方法：1)将壳聚糖、纤维素硫酸酯溶于离子液体中，获得混合溶液；2)将磁性粒子分散于混合溶液中，得到磁性悬浮液；将油相、乳化剂和致孔剂混合，获得乳化体系；3)将磁性悬浮液分散于乳化体系中，在加热的条件下乳化，醇沉，降温，后续处理，获得壳聚糖‑纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球。本发明的方法简单，条件温和，绿色环保。所制备的磁性多孔复合微球孔隙丰富，比表面积大，活性位点多，对脂肪酶固定效果好。所述磁性多孔复合微球在酶固定、蛋白质吸附分离、蛋白药物传递中应用。

Description

壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球及其制备与应用
技术领域
本发明属于多孔微球的技术领域，具体涉及一种壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球及其制备与应用。所述多孔复合微球在固定化脂肪酶、蛋白质吸附分离、蛋白药物传递中的应用。
背景技术
随着微米技术的迅速发展，多孔微球作为酶固定化载体的应用越来越广泛。与传统微球相比，多孔微球具有相互连接的内孔和外孔结构，导致其较低的质量密度和较大的比表面积，使其具有出色的吸附能力。更重要的是，利用天然高分子材料构成的多孔微球是实现绿色化学和环境友好的有效途径。
壳聚糖是一种天然的聚阳离子聚合物，由甲壳素脱乙酰得到。作为自然界中唯一的碱性多糖，因其固有的大量吸附基团常被用作构建酶载体的基质。然而，壳聚糖机械阻力弱，在普通溶剂中溶解度低，在酸溶液中稳定性差，为了克服这一问题，壳聚糖常与其他聚合物结合，形成具有改善性能的强复合物。
纤维素是经常被用来与壳聚糖复合的原料。目前，基于壳聚糖和纤维素的复合微球已有相关报道，常用的制备方法有乳液聚合法、化学交联法、乳化-固化法等。中国专利ZL201110447643.7(申请号201110447643.7)公开了一种乳液聚合法制备的磁性纤维素壳聚糖复合微球，制备过程简单、环保，但是制备得到的复合微球机械强度小、形状不规则、粒径分布较大，微球直径在200～500μm左右；中国专利ZL201610841187.7(申请号201610841187.7)公开了一种化学交联法制备的壳聚糖纳米纤维素基复合球状吸附材料，制得的复合球状吸附材料吸附能力强，但是制备过程中壳聚糖和纳米纤维素在普通溶剂中溶解度低，需要通过化学交联固化成球，同时化学交联剂还存在着环境污染和潜在的细胞毒性的问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的制备方法。本发明采用乳化-溶剂蒸发法，将壳聚糖和纤维素硫酸酯溶于离子液中，离子液中的阴离子与壳聚糖的羟基形成氢键、阳离子与纤维素硫酸酯的硫酸基团之间的静电相互作用促进了网络的形成，从而提高了壳聚糖和纤维素硫酸酯在离子液中的溶解度。通过添加纳米四氧化三铁(Fe3O4)以及乳化剂和致孔剂的调节，壳聚糖与纤维素硫酸酯之间强烈的静电相互作用使得它们迅速结合成聚电解质复合物，Fe3O4通过氢键和静电作用与聚电解质紧密结合，致孔剂以液滴的形式均匀分散于复合物中，经溶剂挥发固化后，形成稳定的磁性多孔复合微球。解决了壳聚糖遇酸溶解、机械强度低以及纤维素溶解度差、吸附能力有限的问题，同时拓宽了壳聚糖-纤维素硫酸酯复合微球的应用领域，如蛋白质吸附分离、蛋白药物传递和酶固定等。
本发明的另一目的在于提供上述方法制备得到的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球。
本发明的再一目的在于提供上述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的应用。所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球在酶固定、蛋白质吸附分离、蛋白药物传递中的应用，特别是固定化脂肪酶中的应用(用作固定酶的载体)。本发明的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球克服了壳聚糖机械强度差，纤维素溶解度低和吸附能力有限等缺点，提高了复合微球的固定化脂肪酶能力。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的制备方法，包括以下步骤：
1)将壳聚糖、纤维素硫酸酯溶于离子液体中，获得混合溶液；
2)将磁性粒子分散于混合溶液中，得到磁性悬浮液；将油相、乳化剂和致孔剂混合，获得乳化体系；
3)将磁性悬浮液分散于乳化体系中，在加热的条件下乳化，醇沉，降温，后续处理，获得壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球。
所述纤维素硫酸酯的聚合度(DP)为290～340，取代度(DS)为0.30～0.42。
所述壳聚糖脱乙酰度大于95％，分子量为150～300kDa。
所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([Emim]Ac)、1-乙基-3-甲基-咪唑硫氰酸盐([Emim]SCN)、1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸盐([Emim]DEP)中的一种以上。
所述壳聚糖和纤维素硫酸酯的质量比为(1～8)：(2～1)，优选为(1～6)：1。
所述壳聚糖和纤维素硫酸酯的质量与离子液体的体积比为2％～5％(g/mL)，即(0.02～0.05)g:1mL。
所述磁性粒子为纳米Fe3O4。
所述磁性粒子与混合溶液的质量体积比为(0.15～0.4)g：1mL。
所述油相为液体石蜡、真空汞油、花生油、矿物油中一种以上；
所述乳化剂为司盘-80、吐温-80中一种以上；
所述致孔剂为硫酸钠、乙二醇、甲醇、聚乙二醇中一种以上。所述致孔剂包含硫酸钠时，硫酸钠以溶液的形式使用，硫酸钠溶液的浓度为(0.1～0.4)g/mL。
所述油相：乳化剂：致孔剂的体积比为(1～3)：(1～2)：1，且油相含量≥乳化剂的含量。
所述磁性悬浮液与乳化体系的体积比为1：(2～8)。
步骤2)中所述分散为搅拌0.5～4h；所述搅拌的转速为500～1000rpm。
步骤3)中所述加热的温度为80～100℃，乳化的时间为1～6h。
步骤3)中所述降温的速率为1～10℃/10min，所述降温是指降至室温。
步骤3)中所述醇沉是指乳化完的体系在乙醇中进行沉淀；乙醇的用量为乳化完体系体积的2～4倍。
步骤3)中所述后续处理是指采用磁铁分离出微球，采用乙醇和水分别进行洗涤，干燥，获得壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球。
所述乳化的转速为800-1500r/min。
步骤1)中溶解的温度为80℃～110℃；溶解的时间为1～4h。
所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球通过上述方法制备得到。通过本发明方法制备的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的平均粒径为8-20μm，孔径为17-22nm，孔隙度为35-50％。
所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球在酶固定、蛋白质吸附分离、蛋白药物传递中的应用(作为载体)，特别是固定化脂肪酶中的应用(用作固定酶的载体)。
所述应用，包括以下步骤：将壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球在缓冲溶液中浸泡，取出微球，将微球与脂肪酶混合，恒温震荡，后续处理，获得固定化酶。所述缓冲溶液为pH 6～9的磷酸缓冲液，特别是0.1mol/L，pH 6～9的磷酸缓冲液。
浸泡的时间为3～5h；恒温震荡的温度为20～30℃，恒温震荡的时间为2～5h，转速为150～200r/min。所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球与脂肪酶的质量比为0.1g：(6～12)mg。
采用该方法制得的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球对脂肪酶的固定具有较好的效果。
本发明的有益效果是：
(1)本发明所用原料来源广泛，可再生，可降解，生物相容性好；
(2)本发明依据离子液体中的阳离子与硫酸盐基团之间的静电相互作用、阴离子与羟基形成氢键促进了网络的形成，从而提高了壳聚糖和纤维素硫酸酯在离子液中的溶解度，对壳聚糖和纤维素硫酸酯溶解度高，解决了壳聚糖遇酸溶解、机械强度低以及纤维素溶解度差、吸附能力有限的问题；而且本申请的离子液体对环境无污染，可循环利用；
(3)本发明的方法简单，反应条件温和，乳化剂用量少以及不使用有毒的化学交联剂，环保。
(4)本发明所制备的微米级壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球，具有丰富的孔隙、较大的比表面积以及较多的活性位点，既可生物降解又可重复利用，对脂肪酶的固定具有较好的效果。为固定化酶的应用研究提供理论基础，同时拓宽壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的应用领域。
附图说明
图1为实施例1制备的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的X射线能谱图；
图2为实施例1和2制备的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的微球尺寸分布图；a对应实施例2，b对应实施例1；
图3为实施例3制备的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球固定化脂肪酶的理化性质图；(a)为固定化脂肪酶在不同pH下酶活曲线，(b)为固定化脂肪酶在不同温度下酶活曲线；(c)为固定化脂肪酶在不同保温时间下酶活曲线；(d)为固定化脂肪酶在不同回收次数下酶活曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
同时将壳聚糖和纤维素硫酸酯以1:2的质量比(0.1g壳聚糖和0.2g纤维素)加入到10mL的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([Emim]Ac)中，在80℃油浴条件下，以250r/min的转速磁力搅拌溶解1h，配成浓度为3％(g/mL)的壳聚糖-纤维素硫酸酯-[Emim]Ac混合溶液；随后，将纳米Fe3O4粒子加入混合溶液中，纳米Fe3O4与混合溶液的质量体积比为0.2g：1mL，以500r/min的转速磁力搅拌30min使其分散均匀得到磁性悬浮液；然后，将磁性悬浮液(水相)分散于体积比为1:1:1的由液体石蜡、司盘-80以及硫酸钠水溶液(水溶液的浓度为0.1g/mL)组成的乳化体系(油相)中，水油比(水相与油相的体积比)为1:2，以1000r/min的转速在90℃油浴中磁力搅拌1h；随后加入两倍体积的无水乙醇，以5℃/10min的速率缓慢降至室温，停止搅拌；用磁铁将复合微球与溶液进行分离，并用无水乙醇和去离子水洗涤3次，真空冷冻干燥，得到磁性多孔壳聚糖-纤维素硫酸酯复合微球。
固定化酶的制备：将0.1g的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球加入到10mL的0.1mol/L，pH＝6.0的磷酸缓冲液中，浸泡溶胀3h后分离，将复合微球装入锥形瓶，向锥形瓶中加入6mg的脂肪酶，在25℃下以180r/min的转速恒温震荡2h后，用磁铁将固定化酶取出，用0.1mol/L，pH＝8.0的磷酸缓冲液洗涤3次，采用橄榄油乳化法测定磁性固定化酶的酶活力，并计算相对酶活。
本实施例所制得的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性复合微球的平均粒径为9.4μm，平均孔径为17nm，孔隙度为38％。固定化脂肪酶的酶载率为63％，酶活性回收率为58％，脂肪酶经固定化后pH稳定性和热稳定性明显优于游离脂肪酶，对温度的敏感性降低且具有良好的操作稳定性。
实施例2
同时将壳聚糖和纤维素硫酸酯以1:1的质量比加入到10mL的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([Emim]Ac)中，在90℃油浴条件下，以250r/min的转速磁力搅拌溶解2h，配成浓度为2％的壳聚糖-纤维素硫酸酯-[Emim]Ac混合溶液；随后，将纳米Fe3O4粒子加入混合溶液中，纳米Fe3O4与混合溶液的质量体积比为0.2g：1mL，以500r/min的转速磁力搅拌1h使其分散均匀得到磁性悬浮液。然后，将磁性悬浮液(水相)分散于体积比为1:1:1的由液体石蜡、司盘-80以及硫酸钠水溶液(水溶液的浓度为0.2g/mL)组成的乳化体系(油相)中，水油比为1:4，以1000r/min的转速在90℃油浴中磁力搅拌1h；随后将两倍体积的无水乙醇加入到乳化液中，以5℃/10min的速率缓慢降至室温，停止搅拌；用磁铁将复合微球与溶液进行分离，并用无水乙醇和去离子水洗涤3次，真空冷冻干燥，得到磁性多孔壳聚糖-纤维素硫酸酯复合微球。
将0.1g的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球加入到0.1mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液中，浸泡溶胀3h后分离，将复合微球装入锥形瓶，向锥形瓶中加入8mg的脂肪酶，在25℃下以180r/min的转速恒温震荡3h后，用磁铁将固定化酶取出，用0.1mol/L，pH＝8.0的磷酸缓冲液洗涤3次，采用橄榄油乳化法测定磁性固定化酶的酶活力，并计算相对酶活。
本实施例所制得的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性复合微球的平均粒径为17.8μm，平均孔径为20nm，孔隙度为42％。固定化脂肪酶的酶载率为68％，酶活性回收率为55％，脂肪酶经固定化后pH稳定性和热稳定性明显优于游离脂肪酶，对温度的敏感性降低且具有良好的操作稳定性。
实施例3
同时将壳聚糖和纤维素硫酸酯以4:1的质量比加入到10mL的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([Emim]Ac)中，在100℃油浴条件下，以250r/min的转速磁力搅拌溶解3h，配成浓度为5％的壳聚糖-纤维素硫酸酯-[Emim]Ac混合溶液；随后，将纳米Fe3O4粒子加入混合溶液中，纳米Fe3O4与混合溶液的质量体积比为0.2g：1mL，以500r/min的转速磁力搅拌3h使其分散均匀得到磁性悬浮液；然后，将磁性悬浮液(水相)分散于体积比为1:1:1的由液体石蜡、司盘-80以及硫酸钠水溶液(水溶液的浓度为0.3g/mL)组成的乳化体系(油相)中，水油比为1:6，以1000r/min的转速在90℃油浴中磁力搅拌1h；随后将两倍体积的无水乙醇加入到乳化液中，以5℃/10min的速率缓慢降至室温，停止搅拌；用磁铁将复合微球与溶液进行分离，并用无水乙醇和去离子水洗涤3次，真空冷冻干燥得到磁性多孔壳聚糖-纤维素硫酸酯复合微球。
将0.1g的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球加入到0.1mol/L，pH＝8.0的磷酸缓冲液中，浸泡溶胀3h后分离，将复合微球装入锥形瓶，向锥形瓶中加入10mg的脂肪酶，在25℃下以180r/min的转速恒温震荡4h后，用磁铁将固定化酶取出，用0.1mol/L，pH＝8.0的磷酸缓冲液洗涤3次，采用橄榄油乳化法测定磁性固定化酶的酶活力，并计算相对酶活。
本实施例所制得的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性复合微球的平均粒径为17.2μm，平均孔径为20nm，孔隙度为45％。固定化脂肪酶的酶载率为70％，酶活性回收率为56％，脂肪酶经固定化后pH稳定性和热稳定性明显优于游离脂肪酶，对温度的敏感性降低且具有良好的操作稳定性。
实施例4
同时将壳聚糖和纤维素硫酸酯以8:1的质量比加入到15mL的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([Emim]Ac)中，在100℃油浴条件下，以250r/min的转速磁力搅拌溶解4h，配成浓度为6％(壳聚糖和纤维素硫酸酯的总质量与离子液体的体积比)的壳聚糖-纤维素硫酸酯-[Emim]Ac混合溶液。随后，将纳米Fe3O4粒子加入混合溶液中，纳米Fe3O4与混合溶液的质量体积比为0.2g：1mL，以500r/min的转速磁力搅拌4h使其分散均匀得到磁性悬浮液。然后，将磁性悬浮液(水相)分散于体积比为1:1:1的由液体石蜡、司盘-80以及硫酸钠水溶液(水溶液的浓度为0.4g/mL)组成的乳化体系(油相)中，水油比为1:8，以1000r/min的转速在90℃油浴中磁力搅拌1h；随后将两倍体积的无水乙醇加入到乳化液中，以5℃/10min的速率缓慢降至室温，停止搅拌；用磁铁将复合微球与溶液进行分离，并用无水乙醇和去离子水洗涤3次，真空冷冻干燥得到磁性多孔壳聚糖-纤维素硫酸酯复合微球。
将0.1g的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球加入到5mL的0.1mol/L，pH＝9.0的磷酸缓冲液中，浸泡溶胀5h后分离，将复合微球装入锥形瓶，向锥形瓶中加入10mg的脂肪酶，在25℃下以180r/min的转速恒温震荡5h后，用磁铁将固定化酶取出，用0.1mol/L，pH＝8.0的磷酸缓冲液洗涤3次，采用橄榄油乳化法测定磁性固定化酶的酶活力，并计算相对酶活。
本实施例所制得的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性复合微球的平均粒径为18.2μm，平均孔径为21nm，孔隙度为40％。固定化脂肪酶的酶载率为65％，酶活性回收率为51％，脂肪酶经固定化后pH稳定性和热稳定性明显优于游离脂肪酶，对温度的敏感性降低且具有良好的操作稳定性。
图1为实施例1制备的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的X射线能谱图；
图2为实施例1和2制备的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的微球尺寸分布图；(a)对应实施例2，(b)对应实施例1；
图3为实施例3制备的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球固定化脂肪酶的理化性质图；(a)为固定化脂肪酶在不同pH下酶活曲线，(b)为固定化脂肪酶在不同温度下酶活曲线；(c)为固定化脂肪酶在不同保温时间下酶活曲线；(d)为固定化脂肪酶在不同回收次数下酶活曲线。
测试条件：
(1)固定化脂肪酶在不同pH下酶活测试：将10mg实施例3制备的固定化脂肪酶、游离脂肪酶分别与5mL的0.1mol/L不同pH的磷酸缓冲溶液(pH6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，10)混合，在35℃恒温震荡150min，测定相对酶活性。
(2)固定化脂肪酶在不同温度下酶活测试：
将10mg实施例3制备的固定化脂肪酶、游离脂肪酶分别与5mL的0.1mol/L、pH7.0的磷酸缓冲溶液混合，分别在不同温度下(30、35、40、45、50、55、60、65℃)恒温震荡150min，测定相对酶活性。
(3)固定化脂肪酶在不同保温时间下酶活测试
将10mg实施例3制备的固定化脂肪酶、游离脂肪酶分别与5mL的0.1mol/L、pH7.0的磷酸缓冲溶液混合，在37℃分别恒温震荡不同时间(30、60、90、120、150、180、210min)，测定相对酶活性。
(4)固定化脂肪酶在不同回收次数下酶活测试
将0.1g实施例3制备的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球加入到5mL的0.1mol/L，pH＝9.0的磷酸缓冲液中，浸泡溶胀3h后分离，将复合微球装入锥形瓶，向锥形瓶中加入10mg的脂肪酶，在35℃下以180r/min的转速恒温震荡5h后，用磁铁将固定化酶取出，用0.1mol/L，pH＝8.0的磷酸缓冲液洗涤3次，采用橄榄油乳化法测定磁性固定化酶的酶活力，并计算相对酶活，将经过催化水解橄榄油乳化液后的固定化酶抽滤，再重复同样的步骤，测定其酶活力并计算相对酶活。
通过本发明方法制备的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的平均粒径为8-20μm，孔径为17-22nm，孔隙度为35-50％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将壳聚糖、纤维素硫酸酯溶于离子液体中，获得混合溶液；
2)将磁性粒子分散于混合溶液中，得到磁性悬浮液；将油相、乳化剂和致孔剂混合，获得乳化体系；
3)将磁性悬浮液分散于乳化体系中，在加热的条件下乳化，醇沉，降温，后续处理，获得壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球。
2.根据权利要求1所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的制备方法，其特征在于：
所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑硫氰酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸盐中的一种以上；
所述壳聚糖和纤维素硫酸酯的质量比为(1～8)：(2～1)；
所述壳聚糖和纤维素硫酸酯的质量与离子液体的体积比为(0.02～0.05)g:1mL；
所述磁性悬浮液与乳化体系的体积比为1：(2～8)。
3.根据权利要求1所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的制备方法，其特征在于：所述纤维素硫酸酯的聚合度为290～340，取代度为0.30～0.42；
所述壳聚糖脱乙酰度大于95％，分子量为150～300kDa；
所述磁性粒子为纳米Fe3O4。
4.根据权利要求1所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的制备方法，其特征在于：所述油相为液体石蜡、真空汞油、花生油、矿物油中一种以上；
所述乳化剂为司盘-80、吐温-80中一种以上；
所述致孔剂为硫酸钠、乙二醇、甲醇、聚乙二醇中一种以上。
5.根据权利要求1所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的制备方法，其特征在于：所述磁性粒子与混合溶液的质量体积比为(0.15～0.4)g：1mL；
所述油相：乳化剂：致孔剂的体积比为(1～3)：(1～2)：1。
6.根据权利要求1所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的制备方法，其特征在于：
步骤3)中所述加热的温度为80～100℃，乳化的时间为1～6h；
步骤3)中所述降温的速率为1～10℃/10min，所述降温是指降至室温。
7.根据权利要求1所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述醇沉是指乳化完的体系在乙醇中进行沉淀；
步骤2)中所述分散为搅拌0.5～4h；所述搅拌的转速为500～1000rpm；
步骤3)中所述乳化的转速为800-1500r/min；
步骤3)中所述后续处理是指采用磁铁分离出微球，采用乙醇和水分别进行洗涤，干燥，获得壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球。
8.一种由权利要求1～7任一项所述制备方法得到的壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球。
9.根据权利要求8所述壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球在酶固定、蛋白质吸附分离、蛋白药物传递中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述酶固定是指固定化脂肪酶。
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