CN101775386A - 一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，属于食品加工技术领域。本发明以壳聚糖为固定化载体，将壳聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相悬浮法制备壳聚糖微球，然后利用戊二醛为交联剂对壳聚糖微球进行交联活化，将交联活化后的壳聚糖微球与胰蛋白酶溶液混合进行固定化，制得固定化胰蛋白酶。胰蛋白酶是食品工业中蛋白质改性、水解最常用的酶制剂之一，本发明通过壳聚糖固定化胰蛋白酶，使胰蛋白酶可以重复使用，提高了胰蛋白酶的利用效率，降低了蛋白质水解过程中酶的用量和生产成本，可广泛应用于牛乳、肉类、水产等蛋白质的水解过程与改性。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖固定化酶的方法，特别是一种壳聚糖微球固定化胰蛋白方法，属于食品加工技术领域。
背景技术
胰蛋白酶是食品工业中常用的一种蛋白酶，如在牛乳蛋白的改性，鱼虾、动物蛋白的酶法水解回收蛋白中均有应用。但是酶制剂通常比较昂贵，且使用过程中酶容易失活且通常无法再回收利用，因此往往导致生产成本的提高；另外由于酶的不可回收性，也导致在食品中引入外来物质的风险。而固定化酶能够提高酶的稳定性，能够在较长的时间里保持活力，并且通过固定化以后能够实现回收利用，大大降低了酶的使用成本，因此固定化胰蛋白酶具有很重要的现实意义。壳聚糖(chitosan)是甲壳素脱乙酰基的产物，是一种碱性阳离子多糖，壳聚糖具有很好的成胶性质，易于形成膜、多孔微球、凝胶，可加工成粉、纳米粒子等多种形态，同时壳聚糖易于进行化学改性，引入新的功能团，如可发生酰基化、羧基化、醚化、Schiff反应、N-烷基化、酯化、氧化、卤化、接枝共聚等反应，从而制得各种系列衍生物，作为一种天然高分子生物材料。此外，壳聚糖具有良好的机械性能、耐热性、抗菌性以及生物相容性和生物降解性，安全可靠，对人类无害并且对环境无污染。因此，壳聚糖及其衍生物是一类性能优良的固定化酶载体。Krajewska研究了过去十年中壳聚糖在固定化酶方面的应用，以多种形态的壳聚糖作为载体，已经用于63种酶的固定化。国内已有很多关于壳聚糖固定化酶的报道，如公开号CN1285403A公布了一种壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的方法，公开号CN101113433的专利公开了一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺，公开号CN101285060A则公布了一种壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法。关于用壳聚糖固定化胰蛋白酶国内外已有报道，但固定化采用的方法各不相同，如采用壳聚糖吸附戊二醛交联的方法固定胰蛋白酶，还有采用采用交联-吸附法对胰蛋白酶的固定化。正如公开号CN101285060A专利中所提到的，先前的一些研究大多存在一些缺陷，如得到的产品杂质多、活力低等。有利于降低生产成本。壳聚糖是一种天然高分子生物材料，具有良好的生物相容性和生物降解性，安全可靠，对人类无害并且对环境无污染，用其固定化胰蛋白酶，无残留、安全性高。本发明提供了一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，使胰蛋白酶可以重复使用，提高了胰蛋白酶的利用效率，降低了蛋白质水解过程中酶的用量和生产成本，可广泛应用于牛乳、肉类、水产等蛋白质的水解过程与改性。
发明内容
本发明的目的：提供了一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，通过壳聚糖固定化胰蛋白酶，使胰蛋白酶可以重复使用，提高胰蛋白酶的利用效率，降低蛋白质水解过程中酶的用量和生产成本，同时增大壳聚糖的应用范围，为壳聚糖资源的推广应用提供依据。
本发明的技术方案：一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，是以壳聚糖为固定化载体，将壳聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相悬浮法制备壳聚糖微球，然后利用戊二醛为交联剂对壳聚糖微球进行交联活化，将交联活化后的壳聚糖微球与胰蛋白酶溶液混合进行固定化，制得固定化胰蛋白酶。具体制备方法如下：
(1)壳聚糖微球的制备及活化：称取一定量的壳聚糖溶于质量浓度1％-3％的醋酸溶液中，制得质量浓度为2％-4％的壳聚糖溶液。接着加入液体石蜡和span-80和致孔剂乙酸乙酯，高速搅拌的情况下缓慢加入壳聚糖溶液，保持高速搅拌40-100min，使壳聚糖液滴均匀分散，得到悬浮的乳状液，然后缓慢往乳状液中加入戊二醛溶液，使乳状液中戊二醛的质量浓度达到2％-6％，在4-45℃下交联活化1-10h，静置冷却后，将所得乳状液倒入等体积的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振荡，而后静置，弃去油层和水层，最后用去离子水反复洗涤抽滤至中性，得到活化的壳聚糖微球；
(2)固定化酶的制备：用pH6.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶/壳聚糖微球为0.5mg/g-4mg/g的比例将胰蛋白酶溶液与壳聚糖微球混合，搅拌均匀后于4℃冰箱中静置5-24h，用pH6.0-7.0的缓冲液抽洗至滤液中检测不到蛋白质存在即得到固定化胰蛋白酶。
所述的span-80用量为石蜡质量的0.1％-1％，致孔剂乙酸乙酯的用量为石蜡质量的0.01％-0.1％，壳聚糖溶液/石蜡质量比为1∶1.5-1∶3。
所述的NaOH/乙醇混合液为1-2mol/L的NaOH溶液与乙醇按照体积比1∶1混合而成的混合液。
本发明的有益效果：
壳聚糖(chitosan)是一种天然高分子生物材料，具有良好的生物相容性和生物降解性，安全可靠，用其固定化胰蛋白酶，安全性高，无残留，对人类无害并且对环境无污染
本发明提供了一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法。本发明通过壳聚糖固定化胰蛋白酶，使胰蛋白酶可以重复使用，提高了胰蛋白酶的利用效率，降低了蛋白质水解过程中酶的用量和生产成本，可广泛应用于牛乳、肉类、水产等蛋白质的水解过程与改性。
本发明得到的固定化胰蛋白酶活力高，酶活回收率高达到73.32％，操作稳定性好，连续操作7批，活力保持80％以上。
具体实施方式
实施例1
(1)壳聚糖微球的制备：称取一定量的壳聚糖溶于质量浓度1％的醋酸溶液中，制得质量浓度为2％的壳聚糖溶液。在容器中加入液体石蜡、span-80和致孔剂乙酸乙酯，span-80用量为石蜡质量的0.5％，致孔剂乙酸乙酯用量为石蜡质量的0.01％；高速搅拌的情况下缓慢加入壳聚糖溶液，壳聚糖溶液/石蜡质量比为1∶1.5，保持高速搅拌40min，使壳聚糖液滴均匀分散，得到悬浮的乳状液；然后在搅拌的情况下往乳状液中缓慢加入戊二醛溶液，使乳状液中戊二醛质量浓度达到1％，在45℃下反应1h。静置冷却后，将所得乳状液倒入等体积的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振荡，而后静置，弃去油层和水层，最后用去离子水反复洗涤抽滤至中性，得到活化的壳聚糖微球。所用NaOH/乙醇混合液为1mol/L的NaOH溶液与乙醇按照体积比1∶1混合而成的混合液。
(2)固定化酶的制备：用pH6.0的磷酸盐缓冲溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶/壳聚糖微球0.5mg/g的比例将胰蛋白酶溶液与壳聚糖微球混合，搅拌均匀后于4℃冰箱中静置5h，用pH6.0的缓冲液抽洗至滤液中检测不到蛋白质存在即得到固定化胰蛋白酶。
实施例2
(1)壳聚糖微球的制备：称取一定量的壳聚糖溶于质量浓度2％的醋酸溶液中，制得质量浓度为3％的壳聚糖溶液。在容器中加入液体石蜡、span-80和致孔剂乙酸乙酯，span-80用量为石蜡质量的0.1％，致孔剂乙酸乙酯用量为石蜡质量的0.05％；高速搅拌的情况下缓慢加入壳聚糖溶液，壳聚糖溶液/石蜡质量比为1∶2，保持高速搅拌60min，使壳聚糖液滴均匀分散，得到悬浮的乳状液；然后在搅拌的情况下往乳状液中缓慢加入戊二醛溶液，使乳状液中戊二醛质量浓度达到6％，在4℃下反应10h。静置冷却后，将所得乳状液倒入等体积的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振荡，而后静置，弃去油层和水层，最后用去离子水反复洗涤抽滤至中性，得到活化的壳聚糖微球。所用NaOH/乙醇混合液为2mol/L的NaOH溶液与乙醇按照体积比1∶1混合而成的混合液。
(2)固定化酶的制备：用pH7.0的磷酸盐缓冲溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶/壳聚糖微球2mg/g的比例将胰蛋白酶溶液与壳聚糖微球混合，搅拌均匀后于4℃冰箱中静置24h，用pH7.0的缓冲液抽洗至滤液中检测不到蛋白质存在即得到固定化胰蛋白酶。
实施例3
(1)壳聚糖微球的制备：称取一定量的壳聚糖溶于质量浓度3％的醋酸溶液中，制得质量浓度为4％的壳聚糖溶液。在容器中加入液体石蜡、span-80和致孔剂乙酸乙酯，span-80用量为石蜡质量的1％，致孔剂乙酸乙酯用量为石蜡质量的0.1％；高速搅拌的情况下缓慢加入壳聚糖溶液，壳聚糖溶液/石蜡质量比为1∶3，保持高速搅拌100min，使壳聚糖液滴均匀分散，得到悬浮的乳状液；然后在搅拌的情况下往乳状液中缓慢加入戊二醛溶液，使乳状液中戊二醛质量浓度达到3％，在30℃下反应4h。静置冷却后，将所得乳状液倒入等体积的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振荡，而后静置，弃去油层和水层，最后用去离子水反复洗涤抽滤至中性，得到活化的壳聚糖微球。所用NaOH/乙醇混合液为1.5mol/L的NaOH溶液与乙醇按照体积比1∶1混合而成的混合液。
(2)固定化酶的制备：用pH6.6的磷酸盐缓冲溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶/壳聚糖微球4mg/g的比例将胰蛋白酶溶液与壳聚糖微球混合，搅拌均匀后于4℃冰箱中静置10h，用pH6.6的缓冲液抽洗至滤液中检测不到蛋白质存在即得到固定化胰蛋白酶。
Claims (3)
1.一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，其特征是以壳聚糖为固定化载体，将壳聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相悬浮法制备壳聚糖微球，然后利用戊二醛为交联剂对壳聚糖微球进行交联活化，将交联活化后的壳聚糖微球与胰蛋白酶溶液混合进行固定化，制得固定化胰蛋白酶；
所述的壳聚糖微球的制备及活化：称取一定量的壳聚糖溶于质量浓度1％-3％的醋酸溶液中，制得质量浓度为2％-4％的壳聚糖溶液，在容器中加入液体石蜡和span-80和致孔剂乙酸乙酯，高速搅拌的情况下缓慢加入壳聚糖溶液，保持高速搅拌40-100min，使壳聚糖液滴均匀分散，得到悬浮的乳状液。然后缓慢往乳状液中加入戊二醛溶液，使乳状液中戊二醛的质量浓度达到2％-6％，在4-45℃下交联活化1-10h，静置冷却后，将所得乳状液倒入等体积的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振荡，而后静置，弃去油层和水层，最后用去离子水反复洗涤抽滤至中性，得到活化的壳聚糖微球；
所述的固定化酶的制备：用pH6.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶/壳聚糖微球为0.5mg/g-4mg/g的比例将胰蛋白酶溶液与壳聚糖微球混合，搅拌均匀后于4℃冰箱中静置5-24h，用pH6.0-7.0的缓冲液抽洗至滤液中检测不到蛋白质存在即得到固定化胰蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，其特征是所述的span-80用量为石蜡质量的0.1％-1％，致孔剂乙酸乙酯的用量为石蜡质量的0.01％-0.1％，壳聚糖溶液/石蜡质量比为1∶1.5-1∶3。
3.根据权利要求1所述的一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，其特征是所述的NaOH/乙醇混合液为1-2mol/L的NaOH溶液与乙醇按照体积比1∶1混合而成的混合液。
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