CN103289984A

CN103289984A - 壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法

Info

Publication number: CN103289984A
Application number: CN2013101964476A
Authority: CN
Inventors: 孙谧; 盛军; 徐甲坤; 刘均忠; 王跃军; 郝建华; 段晓晨
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2013-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明涉及壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法，包括下列步骤：乙酸溶解壳聚糖配置壳聚糖溶液，加入到NaOH中形成壳聚糖凝胶球，加入脂肪酶，用戊二醛溶液交联。该方法酶活稳定性提升效果显著,酶活力保留率高,得到的固定化酶重复利用性好，机械强度高，经过长时间贮藏仍然能够保持较高的脂肪酶活性，是一种理想的固定化脂肪酶方法,因此,在工业、医药、生化分析等方面拥有更广泛的应用。

Description

壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法

技术领域

本发明涉及海洋微生物酶领域，特别是涉及壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法。

背景技术

脂肪酶（EC3.1.1.3），是一类主要催化细胞内外甘油和长链脂肪酸水解、酯合成反应的羧基水解酶，是一种通过反应将底物降解形成游离脂肪酸和甘油的界面酶。它属于一类水解酶（E.C.3），作用于羧酸酯（E.C.3.1）的酯键(E.C.3.1.1)上，能够水解甘油三酯，甘油二酯和甘油单酯，并称为三酰甘油酰基水解酶（E.C.3.1.1.3）。脂肪酶的催化反应范围广泛，能够催化进行包括水解，酯交换，醇解，酸解，酯化和氨解在内的多种生物化学反应。脂肪酶对多种底物都能够起到区域选择性合成、对映体催化的作用。

海洋环境中嗜冷的脂解微生物所产生的脂肪酶，在低温下能够高效的进行催化水解反应，而普通的嗜温微生物在低温条件下仅能表现出很少的活性。这些脂肪酶在结构功能上具备更高的灵活性，特别是其活性位点的特殊性赋予了低温脂肪酶低活化焓，高底物亲和力和低温下的高比活性。海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶是一种低温海洋脂肪酶。该脂肪酶对于中长链的酯类底物有较强的水解作用，在低温环境中能够保持较好的脂肪酶活性，同时作用pH和温度范围较广，显示出良好的酶学特性。

游离酶催化反应是在溶液中进行的，一般来说稳定性差，容易失活、不溶于有机溶剂，易受环境等因素的影响。固定化酶是通过适当的方法将酶固定在一定的空间内，在保持其自身特性的同时能够实现回收和重复利用。固定化酶的出现解决了游离酶实际应用中的诸多局限。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在诸多不足，经发明人长期开发研究海洋微生物及其酶产物和生产实践,开发提供一种固定化体系稳定，酶活率保留高的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法。

本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法,包括下列步骤：

1）壳聚糖凝胶球的制备

将0.5-2.5wt%,优选为0.5—1wt%的乙酸溶解壳聚糖配置1-4wt%,优选为2wt%浓度的壳聚糖溶液，将配置的壳聚糖溶液逐滴加入到NaOH浓度为5-40wt%,优选为浓度10wt%NaOH的凝结液，形成壳聚糖凝胶球（或称微球），置于室温硬化0.5-1小时候待凝胶球具有较好的强度，再用去离子水反复冲洗壳聚糖凝胶球至中性。

2）戊二醛交联

用0.25-3wt%,优选为1wt%的戊二醛溶液交联步骤1的壳聚糖凝胶球2-6小时，优选为3小时,后取出洗净，得壳聚糖凝胶球戊二醛交联产物（戊二醛交联产物,或称载体）。

3）海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶吸附固定化

在步骤2）的戊二醛交联产物中加入200uU/mL游离海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶进行吸附固定化，其中海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶/戊二醛交联产物（相对量比例）为120—960U/mL优选为600—755U/mL,得固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶。

本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物BohaiSea-9145脂肪酶的制备方法中,所述海洋微生物BohaiSea-9145脂肪酶是从渤海海域海泥中分离获得的高产低温碱性脂肪酶的海洋微生物BohaiSea-9145（低温碱性脂肪酶的编号以区别其它低温碱性脂肪酶,或下文简称脂肪酶）的适冷性海洋酵母菌株，根据第四版《The Yeasts,A Taxonmic study》，（Kurtzman & Fell,1998）确定为适冷性海洋解脂耶罗氏酵母菌株（Yarrowia lipolytica strain）一个新的亚种，该适冷性海洋酵母（Yarrowia lipolytica Bohai Sea-9145）菌株于2003年11月26日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCCNO：M203095。

产酶菌株的发酵培养

将适冷性海洋菌株BohaiSea-9145在生化培养箱中平板上于25℃培养24小时，培养基（wt%）为蛋白胨3%，牛肉浸膏2%，KH₂PO₄0.2%、MgSO₄0.05%，橄榄油0.5%，以Na₂HPO₄调节pH为6.5-7.0得到菌落奶酪状、奶白色，不反光，边缘波浪状，有树根状突起。并在工业摇床上于pH5.0，接种量6%，种龄21h，250ml三角摇瓶装量10ml，培养基的碳氮组成为4wt%豆饼粉，4wt%花生粕，4wt%米糠和0.5wt%粗制花生油，MgSO₄0.05wt%、KH₂PO₄0.2wt%，pH5.0于26±1℃接种培养23小时，得发酵液，将发酵上清液，加入三氯甲烷（VCH₃CL:V上清液=5：100）进行充分搅拌，于4℃静置30分，以4000rpm离心40分钟，去除杂蛋白并收集上清液，此脂肪酶比活最高为15828u/g，纯度提高1.2倍。取萃取上清液经100KDa中空纤维柱进行超滤，再以10KDa中空纤维柱浓缩，脂肪酶比活为41288u/g，提高3.3倍。并以CM Sepharose FF阳离子交换层析柱进行层析，分步收集洗脱液,测定其低温碱性脂肪酶比活为206224u/g，纯度提高5.0倍（脂肪酶活性的测定:采用中华人民共和国行业标准(中华人民共和国轻工业部1993)。脂肪酶的水解活力单位定义为:以脂肪酶水解油脂，每分钟产生1μmol脂肪酸的酶量，定义为一个脂肪酶活力单位）。

由上述产酶菌株的发酵培养得到海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶，其经CM Sepharose纯化得到电泳纯的低温碱性脂肪酶以SDS-PAGE按Laemmli法进行分析为单一蛋白条带,分子量为38Kda；最适反应温度35℃，最适pH为8.5；稳定温度低于35℃，稳定pH范围为4.0-9.0；与常规金属离子配伍性：

Zn²⁺离子对该低温碱性脂肪酶具有可逆抑制特性（以上详见中国专利ZL200410096668.7）。

本发明提供的适冷性海洋酵母菌株Y.lipolytica BohaiSea-9145是具有良好商业应用前景的低温碱性脂肪酶高产菌株，发酵周期短，产酶温度稳定，原料来源广泛，生产成本低廉，有利于进一步开拓海洋微生物资源的应用领域。

本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法中的海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶由黄海水产研究所酶工程室自行发酵培养，酶活力为4000U/mL。

本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法中,对壳聚糖吸附交联法进行深入研究,实验发现，将酶和壳聚糖先吸附再与戊二醛交联，可能由于戊二醛和酶的过度交联导致酶的构象发生改变从而丧失活性，经测定酶活力回收率为0。实验又发现将壳聚糖先与戊二醛交联后再与游离酶进行交联和吸附，能够对酶起到较好的固定化效果，故本发明选取壳聚糖先与戊二醛交联后再与游离酶进行吸附此种方法。

在本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法中,所述壳聚糖浓度,对海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶固定化产生一定的影响,实验中发现，当壳聚糖浓度小于1wt%时，与NaOH(凝结液)形成的凝胶微球强度较差，易破裂。当浓度大于4wt%时，由于粘度较大不易溶解同时也影响到凝胶成球效果。实验发现，低浓度下，随着壳聚糖浓度增高酶活力回收率也随之提高，当壳聚糖浓度达到2wt%时有最高的酶活力回收率为64.84%。当壳聚糖浓度继续增高，酶活力回收率会有所下降。所以优选为2wt%

戊二醛的浓度对交联的影响。实验发现，使用低浓度的戊二醛对提高固定化效果作用明显，当戊二醛浓度≥2wt%时，固定化酶活力回收率可以保持在40%以上，但是当戊二醛浓度降低到1wt%以下时，固定化酶活力回收率上升显著，当加入的戊二醛浓度为0.25wt%时，固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶活力回收率最大能够达到73.41%。这是因为相对高浓度的戊二醛在与酶蛋白上的氨基交联反应时太过剧烈，改变了酶本身的构象造成酶活力的部分丧失。使用低浓度戊二醛能够使体系在交联过程中达到一个较好的平衡，即能够大量交联游离酶蛋白又不至于损失酶活，所以优选为0.25wt%。

所述乙酸浓度,对海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶固定化的影响，实验发现，改变乙酸使用的浓度对最终固定化脂肪酶活力的回收率影响较小，几个条件下得到酶活力回收率，极差仅为10.11%。使用1wt%乙酸浓度溶解壳聚糖得到的最终固定化酶活力回收率最高，为74.32%，优选为1wt%。

所述.NaOH(凝结液)浓度对海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶固定化效果的影响,壳聚糖在碱性条件下会迅速形成凝胶，但使用过高浓度NaOH会有一定的危险性同时造成污染。在NaOH凝结壳聚糖制备微球用于固定化实验中发现，当使用较低浓度NaOH制备壳聚糖凝胶微球时，最终得到的酶活力回收率比使用高浓度NaOH制备微球得到的酶活力回收率要高。当NaOH浓度为10wt%时，固定化酶活力回收率能够达到79.74%。所以优选为10wt%。

所述交联时间对海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶固定化的影响。在上述制备壳聚糖微球中，测定不同交联时间对海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶固定化的影响实验中发现，随着交联时间的延长，酶的固定化效率也是随之增长，交联时间3小时时，固定化效率会达到最大值，此时的固定化酶活力回收率为81.96%。当交联时间继续增加，酶活力回收率略有下降，这可能是在所处环境下游离酶自身活力降低的结果。所以优选为3小时。

所述海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶壳聚糖凝胶球戊二醛交联产物（戊二醛交联产物，或称载体）对海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶固定化的影响按照360、480、600、720、840、960、1080、1200、1320U/mL壳聚糖的相对量向微球中添加游离酶，充分吸附交联后测定酶活力及酶活回收率。结果表明，随着加酶量的不断提高，壳聚糖固定化酶活力也是不断上升的，但酶活力回收率却逐渐降低。在较低酶量范围内，酶活力回收率都保持在相当高的水平，加酶量为720U/mL时，固定化酶活力为626.8U/g，酶活力回收率能够达到87.06%。当加酶量达到960U/mL时，继续提高加酶量对固定化酶活力提升不再明显，固定化酶活力约为755U/g时基本趋于稳定，载酶量达到最高酶活力回收率为78.68%,所以优选为600--755U/mL。

本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法中,在壳聚糖吸附交联法中优选固定化条件为壳聚糖浓度2wt%，戊二醛浓度0.25wt%，乙酸浓度1wt%，NaOH浓度10wt%，交联3h，每克载体添加720U/mL海洋微生物Bohaisea-9145脂肪酶时得到最大固定化酶活力回收率87.06%。将壳聚糖先和戊二醛交联后对游离脂肪酶进行处理，通过吸附和交联的方式固定了目的蛋白，最终得到较高的酶活力回收率。固定化得到的壳聚糖微球硬化所需时间短，数小时即可完成整个过程的操作。通过此种方法本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物BohaiSea-9145脂肪酶的制备方法得到的固定化酶重复利用性好，机械强度高，经过长时间贮藏仍然能够保持较高的脂肪酶活性，是一种理想的固定化酶方法。

本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法中，在天然的游离酶经过固定化处理，稳定性通常都会得到显著的提高，一般在自身性质，包括适用温度、pH和底物亲和度上都会发生一定的改变。通过对壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的性质和最适反应条件进行实验研究，与游离脂肪酶进行比较，可以对这种固定化脂肪酶的应用有一个更为深入和确切的认识。此种方法得到的固定化酶重复利用性好，机械强度高，经过长时间贮藏仍然能够保持较高的脂肪酶活性，是一种理想的固定化酶方法。因此在工业、医药、生化分析等方面拥有更广泛的应用空间

固定化酶贮藏稳定性和操作稳定性

以对硝基苯基月桂酸酯为底物，通过重复利用固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶对其进行水解测定固定化脂肪酶的操作稳定性。重复使用固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶催化底物水解10次后，按照半衰期计算公式计算固定化酶的贮藏半衰期。分别将壳聚糖固定化酶和游离态的酶置25℃环境中保存，每5d测定一次脂肪酶活力，30d内测定固定化脂肪酶的贮藏稳定性。按照半衰期计算公式计算固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的操作稳定性。

t_1／2=0.693t／2.303lg(E₀／E)

t_1／2：固定化酶半衰期；

t：贮藏时间；

E₀：初始酶活力；

E：贮藏时间t后酶活力。

以对硝基苯基月桂酸酯为底物，通过重复利用固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶对其进行水解测定固定化脂肪酶的操作稳定性。按照半衰期计算公式，在重复使用10次后，固定化脂肪酶活力能够保持60.9%。按照半衰期计算公式计算得到固定化酶操作半衰期为14次。实验发现，固定化脂肪酶贮藏30天后仍能保持 76.7%的活性，游离脂肪酶贮藏30天后可以保持58.7%的活性。按照半衰期计算公式可知，固定化脂肪酶贮藏半衰期为78天，游离脂肪酶贮藏半衰期为39天。

固定化酶最适pH和pH稳定性

按脂肪酶活力测定方法，在pH为5-9的缓冲液反应体系中测定脂肪酶的水解活性。以测定样品酶活力最高的一组数据设为标准组，酶活力保留率100%，将不同pH条件下测得酶活与标准组比较得到酶活力保留率。

酶活力保留率（%）=（酶活力/标准组酶活力）×100%

将固定化酶置于pH5-9的缓冲液中1h，取出并测定脂肪酶水解活性。以测定样品酶活最高的一组设置为标准组100%，其他组测定结果通过与标准组的比较得到相对酶活力保留率。

酶活力保留率（%）=（酶活力/标准组酶活力）×100%

分别在pH为5-9的条件下测定海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶和游离海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶活性，比较它们的最适pH和pH稳定性。实验发现，反应体系在pH≥10时会对底物显色产生影响，故pH最大选取到9。最适pH实验中将测定酶活力最高的一组数据设为标准，酶活力保留率100%，将不同pH条件下测得酶活与标准组比较得到酶活力保留率。结果表明，游离脂肪酶在pH为8时活性最高，而固定化脂肪酶活性最高点出现在7.5，当pH降低后，固定化脂肪酶的酶活保留率要高于游离酶，说明经过固定化的脂肪酶对于pH变化有着更高的适用性。

在pH稳定性实验中，分别将壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶和游离海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶在pH5-9的磷酸盐缓冲液中保温1h，以贮藏后样品酶活最高的一组设置为标准组100%，其他组测定结果通过与标准组的比较得到相对酶活力保留率。结果表明，经长时间保存后，游离的海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶和固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶都在pH为8时稳定性最高。在不同pH点上固定化酶的耐受性上都比游离酶好。固定化脂肪酶在pH7-9的范围内脂肪酶活力能够稳定在80%以上，游离脂肪酶在pH7.5-9的范围内脂肪酶活力能够稳定在80%以上。在低pH范围内固定化酶的pH稳定性表现的要比游离脂肪酶更好，在pH为5时酶活稳定性提高了27.4%，

固定化酶最适温度和温度稳定性

按脂肪酶活力测定方法，在温度为20-60℃的反应温度中测定脂肪酶的水解活性。以测定样品酶活力最高的一组数据设为标准组，酶活力保留率100%，将不同pH条件下测得酶活与标准组比较得到酶活力保留率。

酶活力保留率（%）=（酶活力/标准组酶活力）×100%

将固定化酶置于4-60℃的环境中保存1h，取出并测定脂肪酶水解活性。以测定样品酶活最高的一组设置为标准组100%，其他组测定结果通过与标准组的比较得到相对酶活力保留率。

酶活力保留率（%）=（酶活力/标准组酶活力）×100%

在20、30、35、40、45、50、55℃的环境条件下测定并比较固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶和游离海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的最适作用温度和温度稳定性，确定固定化酶的最适温度。试验中发现，当温度过高时，也会使脂肪酶测活体系发生颜色反应影响结果的测定，故将温度试验的最高温度设定为55℃。最适温度试验中将测定酶活力最高的一组数据设为标准，酶活力保留率100%，将不同温度条件下测得酶活与标准组比较得到酶活力保留率。通过最适温度试验发现，游离海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的最适温度为35℃，而固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的最适温度为40℃，当温度上升或下降时，酶活力下降明显，最适温度的改变可能是由于酶经载体固定后，借助载体和自身的结构特征的变化在对温度的适用性上发生了变化。

温度稳定性试验中，通过将固定化酶和游离酶置于不同温度条件下保存1h后测定酶活确定其温度稳定性。实验中，以贮藏后样品酶活最高的一组设置为标准组100%，其他组测定结果通过与标准组的比较得到相对酶活力保留率。实验发现，固定化脂肪酶的温度稳定性表现比游离脂肪酶好，不同温度条件下固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的稳定性都比游离态脂肪酶高10%左右。

固定化酶催化动力学研究

由于酶浓度能够限制酶促反应中间络合物的合成，所以在底物浓度较低时，酶促催化反应速率会随着其浓度增加而变大；当底物浓度达到一定限度后，再增加其浓度，反应速度不会继续增加。Michaelis和Menten推导了出底物浓度和酶促反应速度的关系式，即米氏方程为V=Vmax[s]/(Km+[s])。通过米氏方程，可以近似的反映出酶和反应底物亲和的能力大小。Km值与酶和底物亲和力所呈现的是一种负相关关系。实验使用双倒数法计算脂肪酶米氏常数（Lineweaver-Burk）。选取米氏方程的倒数式1/V=(Km/Vmax)(1/[S])+1/Vmax，以1/v对1/[S]做图可得一直线，其斜率为Km/V，截距为1/V，将直线延长与横轴相交，该交点在数值上等于-1/Km。脂肪酶活力测定是以对硝基苯基月桂酸酯（4-Nitrophenyl dodecanoate）为底物。故按脂肪酶活力测定方法，分别配置浓度为0.25，0.33，0.4，0.5，1，2μmol/L的pNP-laurate与固定化脂肪酶反应，即可计算分别得到固定化酶对p-nitrophenyl dodecanoate的酶促反应动力学常数Km和Vm。

通过分别对游离脂肪酶和固定化脂肪酶做双倒数图得到结果所示。通过得到的回归方程计算可知游离酶的Km和Vm分别为0.1153μM和76.89μmol.min^-1mg^-1；固定化酶的Km和Vm分别为0.1043μM和30.67μmol.min^-1mg^-1。从结果可以发现，固定化后的脂肪酶在对底物的亲和力上相比游离酶有所下降，这可能是由于固定化过程中酶蛋白与载体结合后，对酶的结构和活性中心产生了部分影响，在空间上形成了一定的位阻，从而使底物向酶活性中心的扩散产生了一定的阻碍，使酶和底物结合速度出现降低的情况。海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶时得到最大固定化酶活力回收率87.06%

由上述实验可见游离脂肪酶的最适反应温度为35℃，最适反应pH为8.0。经壳聚糖固定化处理后，固定化脂肪酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH为7.5。分别将壳聚糖固定化脂肪酶和游离脂肪酶在pH 5-9的磷酸盐缓冲液中保温1h，结果表明：固定化脂肪酶在pH 7-9的范围内脂肪酶活力能够稳定在80%以上，游离脂肪酶在pH 7.5-9的范围内脂肪酶活力能够稳定在80%以上。在低pH范围内固定化酶的pH稳定性表现的要比游离脂肪酶更好，在pH为5时酶活稳定性提高了27.4%，提升效果显著。将壳聚糖固定化脂肪酶和保存在pH 8.0磷酸盐缓冲液中的游离脂肪酶分别在10-60℃的条件下保温1h，结果表明：固定化脂肪酶的温度稳定性表现比游离脂肪酶好，不同温度条件下固定化脂肪酶的稳定性都比游离态脂肪酶高10%左右。分别将固定化脂肪酶和游离脂肪酶在25℃条件下贮藏，结果表明：固定化脂肪酶贮藏30天后能够保持76.7%的活力，游离脂肪酶贮藏30天后能够保持58.7%的活力，固定化脂肪酶的贮藏半衰期为78天，游离脂肪酶为39天。固定化脂肪酶重复使用10次仍能保持60.9%的活性，固定化脂肪酶操作半衰期为14次。脂肪酶经固定化后Km值从游离酶的0.2mM/L增加至0.235mM/L，Vm从76.92μmol.min^-1ml^-1下降到30.67μmol.min^-1ml^-1。

本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法特点为：

①本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法得到的固定化酶重复利用性好，机械强度高，经过长时间贮藏仍然能够保持较高的脂肪酶活性，是一种理想的固定化酶方法。②海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶固定化后得到最大固定化酶活力回收率87.06%。③游离脂肪酶的最适反应温度为35℃，最适反应pH为8.0。经壳聚糖固定化处理后，固定化脂肪酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH为7.5。固定化酶活力为626.83,酶活力回收率为87.06%

固定化脂肪酶在pH7-9的范围内脂肪酶活力能够稳定在80%以上，游离脂肪酶在pH7.5-9的范围内脂肪酶活力能够稳定在80%以上。在低pH范围内固定化酶的pH稳定性表现的要比游离脂肪酶更好，在pH为5时酶活稳定性提高了27.4%，提升效果显著。将壳聚糖固定化脂肪酶和保存在pH 8.0磷酸盐缓冲液中的游离脂肪酶分别在10-60℃的条件下保温1h表明：固定化脂肪酶的温度稳定性表现比游离脂肪酶好，不同温度条件下固定化脂肪酶的稳定性都比游离态脂肪酶高10%左右。

分别将固定化脂肪酶和游离脂肪酶在25℃条件下贮藏，结果表明：固定化脂肪酶贮藏30天后能够保持76.7%的活力，游离脂肪酶贮藏30天后能够保持58.7%的活力，固定化脂肪酶的贮藏半衰期为78天，游离脂肪酶为39天。固定化脂肪酶重复使用10次仍能保持60.9%的活性，固定化脂肪酶操作半衰期为14次。脂肪酶经固定化后Km值从游离酶的0.2mM/L增加至0.235mM/L，Vm从76.92μmol.min^-1ml^-1下降到30.67μmol.min^-1ml^-1。

本发明提供的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法得到的固定化酶重复利用性好，机械强度高，经过长时间贮藏仍然能够保持较高的脂肪酶活性，是一种理想的固定化酶方法。因此在工业、医药、生化分析等方面拥有更广泛的应用空间

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

将2wt%浓度的乙酸溶解壳聚糖配置1wt%的壳聚糖溶液，将配置的壳聚糖溶液逐滴加入到浓度为40wt%NaOH凝结液中，形成壳聚糖凝胶球，置于室温硬化1小时候待微球具有较好的强度，再用去离子水反复冲洗凝胶球至中性；再用0.25wt%的戊二醛溶液壳聚糖凝胶球6小时候,后取出洗净，得戊二醛交联产物;在戊二醛交联产物中加入200uL游离海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶进行吸附固定化,得固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶,其中海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶/戊二醛交联产物比例为600U/g。固定化酶活力为481U/g,酶活力回收率为66.9%.

实施例2

将1wt%,浓度的乙酸溶解壳聚糖配置2wt%的壳聚糖溶液，将配置的壳聚糖溶液逐滴加入到浓度为10wt%NaOH凝结液中，形成壳聚糖凝胶球，置于室温硬化1小时候待微球具有较好的强度，再用去离子水反复冲洗凝胶球至中性;再用0.25wt%的戊二醛溶液壳聚糖凝胶球3小时候,后取出洗净，得戊二醛交联产物;在戊二醛交联产物中加入200uL游离海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶进行吸附固定化,得固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶,其中海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶/戊二醛交联产物相对量为755U/g。固定化酶活力为626.8U/g,酶活力回收率为87.06%

实施例3

将1wt%,浓度的乙酸溶解壳聚糖配置2wt%的壳聚糖溶液，将配置的壳聚糖溶液逐滴加入到浓度为10wt%NaOH凝结液中，形成壳聚糖凝胶球，置于室温硬化1小时候待微球具有较好的强度，再用去离子水反复冲洗凝胶球至中性;再用0.25wt%的戊二醛溶液壳聚糖凝胶球3小时候,后取出洗净，得戊二醛交联产物;在戊二醛交联产物中加入200uL游离海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶进行吸附固定化,得固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶,其中海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶/戊二醛交联产物比960U/g。固定化酶活力为754U/g,酶活力回收率为78.68%

（脂肪酶/戊二醛交联产物相对量单位U/g，固定化酶活力单位U/g。）

Claims

1.一种壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法，包括下列步骤：

1）壳聚糖凝胶球的制备

将0.5-2.5wt%浓度的乙酸溶解壳聚糖，配置1-4wt%的壳聚糖溶液，将配置的壳聚糖溶液逐滴加入到浓度为5-40wt%NaOH凝结液中，形成壳聚糖凝胶球，置于室温硬化0.5-1小时，微球具有了较好的强度，再用去离子水反复冲洗凝胶球至中性;

2）戊二醛交联

用0.25-3wt%的戊二醛溶液交联步骤1的壳聚糖凝胶球2-6小时，取出洗净，得戊二醛交联产物;

3）海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶吸附固定化

在步骤2）的戊二醛交联产物中加入200uL游离海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶进行吸附固定化，得固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶，其中海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶/戊二醛交联产物为120-960U/g。

2.根据权利要求1的壳聚糖固定化海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶的制备方法，其特征在于所述乙酸浓度为1wt%，所述壳聚糖浓度为2wt%，所述戊二醛浓度为0.25wt%，所述NaOH浓度为10wt%，所述交联时间为3小时候，所述海洋微生物Bohaisea-9145脂肪酶/戊二醛交联产物比例为600-755U/g。