CN103642772A - 一种海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体及其制备方法 - Google Patents

一种海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新型海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体及其制备方法。该晶体为短棱柱状形貌,其空间结构为精细三维结构,结构中含有371个氨基酸，含有8个α螺旋结构和9个β折叠结构;结构中具有
Figure DDA0000433277200000011
，

Description

一种海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体及其制备方法
技术领域
本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及一种新型海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体及其制备方法。 
背景技术
脂肪酶作为一个具有上百年历史的古老酶种，近年来随着细胞工程、基因工程、蛋白质工程等技术的兴起，其在生物能源、食品加工及医学工程等领域的应用范围不断扩大、重新焕发出新的活力。目前在美国国立生物信息中心（NCBI）中报道的脂肪酶基因已达4000余个（包括假单胞菌、酵母菌、葡萄球菌、链霉菌和枯草杆菌等众多微生物来源的脂肪酶基因），晶体结构约200个，而且仍在迅猛增加。 
脂肪酶的开发与应用依赖于酶本身的底物特异性，而脂肪酶的底物特异性取决于酶的分子结构，特别是酶活性中心的三维结构。蛋白质的三维结构对于了解其生物功能、设计药物以及蛋白质药物的基因工程等方面具有非常重要的作用。目前，X-射线单晶衍射方法是通过蛋白质单晶获得其三维结构的最重要的研究方法之一。对于X-射线单晶衍射方法，蛋白质单晶必须达到足够大的尺寸和完善程度。然而，由于溶液中蛋白质分子之间的相互作用位点较少，相互作用力比较弱，蛋白质晶体中往往含有很大比重的水，因此，内部结构比较规整的蛋白质晶体仍旧很难获得。获得高质量的蛋白质晶体仍旧是蛋白质结构解析的瓶颈问题。 
海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145是一类重要的生物催化剂，具有低温催化活力高、在碱性条件下性质稳定、与金属离子及表面活性剂配伍性好等一系列优点，可以被广泛应用于日化、食品加工及医药等低温催化领域，具有极大的市场前景与应用潜力。然而该酶对中、短链（C≤12）的底物有较好的水解能力，对大分子底物的催化效果并不理想。因此，对海洋酵母脂肪酶Bohai Sea-9145开展晶体培养及结构解析，对确定其活性中心、底物结合模式、深入研究其催化机制以及小分子抑制剂的设计具有重要的理论指导意义和医学应用价值。经文献检索，未发现与本发明的海洋脂肪酶Bohai Sea-9145晶体结构相同的公开文献报道。 
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足,发明人在长期从事海洋微生物的开发、生产及应用实践过程中，采用现代科学技术，在已筛选得到的适冷性海 洋酵母Bohai Sea-9145的低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145及其基因序列的前期专利基础上,开发提供一种新型海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体及其制备方法。 
本发明的新型海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体的制备方法,包括下列步骤： 
1）结晶（生长）缓冲液的配制 
结晶缓冲液由沉淀剂硫酸铵和pH值缓冲液组成，所述沉淀剂硫酸铵使所述蛋白质从水溶液中沉淀出来的中性盐，质量百分含量为20-30%;所述pH值缓冲液为乙酸钠溶液，缓冲液的摩尔浓度为0.1-0.3M,pH值4.0-5.2;优选为：摩尔浓度为0.1M、pH为4.6的乙酸钠缓冲液，其中含沉淀剂硫酸铵质量百分含量为20%; 
2）海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液的配制 
将酶活力为4000U/mL的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145配制成浓度为10-20毫克/毫升的水溶液；优选为：将酶活力为4000U/mL海洋低温碱性脂肪酶BohaiSea-9145配制为10mg/ml水溶液。 
3）结晶液的配制： 
将步骤2）的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液按体积比1：1进行接种到步骤1）的晶体缓冲溶液中；采用悬滴法将所述结晶液置于培养箱中，15-25℃培养3-5天得到海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体。优选为：由上述步骤配制的1μL结晶缓冲液、1μL20mg/ml的海洋低温碱性脂肪酶水溶液；利用悬滴法，将上述结晶液置于塑料盖玻片上，然后将该结晶液滴倒扣于24孔结晶板上，中间缝隙用凡士林密封，至于20℃的生物培养箱进行晶体培养，三天后置于偏光显微镜下采集晶体照片，如图1所示，所得晶体为短棱柱状形貌。 
本发明提供的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体进行X射线衍射,X射线衍射数据收集步骤如下：首先使用的尼龙晶体环（如Hampton Research公司的），从晶体浸泡液中获取适宜X射线衍射的晶体，并迅速使用冷却系统（如Oxford Cryosystem公司的）产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180℃；使X射线通过晶体，利用旋进法收集X射线衍射数据。收集到晶体的X射线衍射数据后，按照下述步骤进行相应的数据处理：首先使用HKL2000等软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser、Molrep等软件，利用分子置换（MR，Molecular Replacement）方法，以解脂耶氏酵母脂肪酶（PDBid：3O0D）、嗜热（腐质霉）腐植脂肪酶(PDBid：1DT3)和真菌脂肪酶（PDBid：1TIA）为搜索模型，得到海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145的精细三维结构。 
海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体为短棱柱状形貌,其空间结构为精细三维结构,结构中具有
Figure BDA0000433277180000031
，，α=β=γ=90°晶包元;所述晶体的蛋白空间群为I4，其盖子域的位置为丝氨酸（S112）-苯丙氨酸（F122）。丝氨酸（S195），天冬氨酸（A258）和组氨酸（H318）构成其“催化三联体”，酪氨酸（T110）与亮氨酸（L193）组成其氧负离子空洞区（图2、3）。 
本发明提供的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体及其制备方法中,所述海洋微生物(酵母)Bohai Sea-9145低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145是从渤海海域海泥中分离获得的高产低温碱性脂肪酶的海洋微生物Bohai Sea-9145（低温碱性脂肪酶的编号以区别其它低温碱性脂肪酶,或下文简称脂肪酶）的适冷性海洋酵母菌株，根据第四版《The Yeasts,A Taxonmic study》，（Kurtzman&Fell,1998）确定为适冷性海洋解脂耶罗氏酵母菌株（Yarrowia lipolytica Bohai Sea-9145）一个新的亚种（本文称适冷性海洋酵母菌株BohaiSea-9145），该适冷性海洋酵母菌株于2003年11月26日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCCNO：M203095。 
产酶菌株的发酵培养 
将适冷性海洋酵母菌株BohaiSea-9145在生化培养箱中平板上于25℃培养24小时，培养基（wt%）为蛋白胨3%，牛肉浸膏2%，KH2PO40.2%、MgSO40.05%，橄榄油0.5%，以Na2HPO4调节pH为6.5-7.0得到菌落奶酪状、奶白色，不反光，边缘波浪状，有树根状突起。并在工业摇床上于pH5.0，接种量6%，种龄21h，250ml三角摇瓶装量10ml，培养基的碳氮组成为4wt%豆饼粉，4wt%花生粕，4wt%米糠和0.5wt%粗制花生油，MgSO40.05wt%、KH2PO40.2wt%，pH5.0于26±1℃接种培养23小时，得发酵液，将发酵上清液，加入三氯甲烷（VCH3CL:V上清液=5：100）进行充分搅拌，于4℃静置30分，以4000rpm离心40分钟，去除杂蛋白并收集上清液，此脂肪酶比活最高为15828u/g，纯度提高1.2倍。取萃取上清液经100KDa中空纤维柱进行超滤，再以10KDa中空纤维柱浓缩，脂肪酶比活为41288u/g，提高3.3倍。并以CM Sepharose FF阳离子交换层析柱进行层析，分步收集洗脱液,测定其低温碱性脂肪酶比活为206224u/g，纯度提高5.0倍（脂肪酶活性的测定:采用中华人民共和国行业标准(中华人民共和国轻工业部1993)。脂肪酶的水解活力单位定义为:以脂肪酶水解油脂，每分钟产生1μmol脂肪酸的酶量，定义为一个脂肪酶活力单位）。 
由上述产酶菌株的发酵培养得到海洋微生物Bohai Sea-9145脂肪酶，其经CM Sepharose纯化得到电泳纯的低温碱性脂肪酶以SDS-PAGE按Laemmli法进行分析 为单一蛋白条带,分子量为38Kda；最适反应温度35℃，最适pH为8.5；稳定温度低于35℃，稳定pH范围为4.0-9.0；与常规金属离子配伍性： 
Zn2+离子对该低温碱性脂肪酶具有可逆抑制特性。（以上详见中国专利ZL200410096668.7） 
本发明提供的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145由黄海水产研究所酶工程室按所述方法自行发酵培养制备，海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145酶活力为4000U/mL。 
本发明提供的适冷性海洋酵母Y.lipolytica菌株BohaiSea-9145是具有良好商业应用前景的低温碱性脂肪酶高产菌株，发酵周期短，产酶温度稳定，原料来源广泛，生产成本低廉，有利于进一步开拓海洋微生物资源的应用领域。 
本发明提供的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体既具有海洋酵母低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145的特有特性,又具有海洋酵母低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体的特性,是一种重要的生物催化剂，具有低温催化活力高、在碱性条件下性质稳定、与金属离子及表面活性剂配伍性好等一系列优点，可以被广泛应用于日化、食品加工及医药等低温催化领域，具有极大的市场前景与应用潜力。 
附图说明
图1海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体偏光显微镜照片 
图2海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体X射线衍射图谱 
图3海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体空间结构解析 
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。 
实施例1——海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体的制备 
1）结晶（生长）缓冲液的配制：配制0.1M、pH为4.6的乙酸钠缓冲液，其中含沉淀剂硫酸铵质量百分含量为20%。 
2）海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液的配制 
将酶活力为4000U/mL海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145配制为10mg/ml水溶液。 
3）结晶液的配制： 
由上述步骤1配制的1μL结晶缓冲液、1μL20mg/ml的海洋酵母低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液；利用悬滴法，将上述结晶液置于塑料盖玻片上，然后将该结晶液滴倒扣于24孔结晶板上，中间缝隙用凡士林密封，至于20℃的生物培养箱进行晶体培养，三天后置于偏光显微镜下采集晶体照片，如图1所示，所得晶体为短棱柱状形貌。 
实施例2、3—海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体的制备 
实施例2、3的制备步骤与实施例1相同,不同是:其中分别配制0.2M、0.3M,pH为4.6的乙酸钠缓冲液，含沉淀剂硫酸铵质量百分含量分别为25%30%;配制的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液分别为15、20mg/ml。 
实施例4——海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体的结构解析 
首先使用HKL2000等软件对海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体进行X射线衍射,收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser、Molrep等软件，利用分子置换（MR，Molecular Replacement）方法，以解脂耶氏酵母脂肪酶（PDBid：3O0D）、嗜热（腐质霉）腐植脂肪酶(PDBid：1DT3)和真菌脂肪酶（PDBid：1TIA）为搜索模型，得到海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145的精细三维结构（图2、3）。 

Claims (3)

1.一种海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体，其特征在于该脂肪酶晶体为短棱柱状形貌,其空间结构为精细三维结构,结构中含有371个氨基酸，含有8个α螺旋结构和9个β折叠结构;晶体结构中具有
Figure FDA0000433277170000011
，
Figure FDA0000433277170000012
，α=β=γ=90°晶包元,晶体的蛋白空间群为I4，其盖子域的位置为丝氨酸（S112）-苯丙氨酸（F122）,丝氨酸（S195），天冬氨酸（A258）和组氨酸（H318）构成其“催化三联体”，酪氨酸（T110）与亮氨酸（L193）组成其氧负离子空洞区。
2.一种权利要求1的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体的制备方法,包括下列步骤：
1）结晶缓冲液配制
结晶缓冲液由沉淀剂硫酸铵和pH值缓冲液组成，所述沉淀剂硫酸铵使所述蛋白质从水溶液中沉淀出来的中性盐，质量百分含量为20-30%;所述pH值缓冲液为乙酸钠溶液，缓冲液的摩尔浓度为0.1-0.3M,pH值4.0-5.2;
2)海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液的配制
将酶活力为4000U/mL的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145配制成浓度为10-20毫克/毫升的水溶液；
3）结晶培养
将步骤2的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145水溶液按体积比1：1接种到步骤1所述的晶体缓冲溶液中；采用悬滴法将所述结晶液置于培养箱中，15-25℃培养3-5天得到海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体。
3.根椐权利要求2的海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145晶体的制备方法,其特征在于所述pH值缓冲液的摩尔浓度为0.1M、pH为4.6的乙酸钠缓冲液，其中含沉淀剂硫酸铵质量百分含量为20%;所述将酶活力为4000U/mL海洋低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145配制为10mg/ml水溶液。
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