SU732382A1 - Способ получени очищенного протеолитического фермента - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к способам получени  микробиологических препаратов и может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленност медицине, микробиологии. Наиболее близким по технической сущ ности к предлагаемому  вл етс  способ получени  протеолитических ферментов, предусматривающий аэробное кулнгивирование пррдуцируйщего его с юрмента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и кганеральных солей, осаждение и отделение клеток от культуральной жидкости с последующим диализом и лиофильной сушкой И Недостатками способа  вл ютс  невозможность получени  индиввдуаль1 1Ъго целевого продукта, а также нестабильнос последнего. Цель изобретени  - обеспечение стабильности фермента и увеличение его выхода . Цель достигаетс  тем, что в качестве продуцента протеолитического фермента используют BQcie tus , vos tinHirnvjs , при этом культивирование провод т глубинным способом 3 течение 36-48 ч при 28-32 С, а осаждение ведут сульфатом аммони  при насыщении 0,8-О,9 с последующим диалиаом и очист кой целевого продукта на сефадексе, продуцент культивируют на cpeдv, следующего состава, вес. %: глицерин 0,5-1,5; О,О1О ,05; MnSQ4-5H2O О,ООЗ-О,008; CaCBg О,ОО5-О,О1; ZneO4-7H2O О.ОООЗО ,ОО07; CuSO -5H2O О,ОООЗ-ОгООО7; reSO4 7Hj,O 0,00002-0,00008; КаНРО 0,03-0,07; (NH)2S04 ОД0 ,3; N а лимоннокислый трехзамещенный 0,1-0,3; вода дистил1фованна  - остальное . Выход целевого продукта составл ет 2О98 усл.ед./мл фибринолитической активности при культивировании продуцента на синтетической среде и за 3 ч инкубации фйбриновой пластинки при концентрации белка 100 мкг/мЛс Цепе1юй продукт бой индивидуальный фермент.

штамма

Активность

Стабильность фибринолитическа , усл. едЛ1л Bocit U5 -ttiuring-ien- 2О98 St5 чаг- sили 839 Xctwom ces -tVie moN t csris Высока  фибринолитическа  активност целевого продукта наблюдаетс  при выра щава ии продуцента на обеих приведенных средах. Целевой продукт, офаауемый предлагаемым шта ммом-продуиентом - одни фермент, не требующий дальнейшей очист ки и какой-либо обработки, отличаювшйс  также от известного высокой стабильностью . Причем, он сохран ет свою актив ность при значительном нахревании и гфи длительном хранении в лиофи нзова иом состо нии, не требу  ори этом, например иммобилизации. Штамм Bcjcittus tViuringrJews s NQr- iimtftnvjs был «сделен в Канаде в 1Й58 году и хранитса в кшшекшш ВНИИ Прикладной мавробнологии. Штамм tlwHn irtsie -WW.ti niiimus имеет следующие морфологические и физиолого-диохи11« ческиё хфактеристики . М орфологи)Ч еские свойства. Клетки односуточной культуры палочковидные, удлиненные, с тупыми кра ми, часто соединены в цепочки . Размер клетсж 7-1о мкм, длина 1,5, ширина 3f мкм. Культура образует крупные овальные споры и округлые, мелкие параспоральны кристаллы, соединенные со спорами. Кле ки неподвижны. Гра«положительные. Культуральные свой ств а . Культура Bcsc fcCus ttiuring ensi Nor. образует беловатую пленку на м со-пептошюм бульоне и

Экономичность

Степень способа лчистки Стабилен He стаби лен 37323824 предсташг ет соО5еспичо)ио нсстабилыилггн фермеит.ч и стабильныйи уво.игчение его выхода предславлено в- таблице. ОдинВьфащивание профермент дуцента на дешевой синтетическойсреде или на сложной среде , идущей в отходы производства Комплекс Выращивание различных продуцента на ферментов среде, содержащей крахмал, растворимый среде с сахарозой. На м со-пептонном и молочном агаре штрих обильный, беловатого цвета, в зкой консистенции. Колонии на м со-пептонком агаре через 3 сут. имеют правильную округлую форму беловато .шсерого цвета, плоские, непрозрачвые , со слегка волнистым краем, однородные . Физиолого-биохимические свойства. Культура itiuHngfiensis Nar. Eiviiti us разжижает жепативу, гидропизует альбумин , казеин, фибрин, фибриноген. BaciEEus -tVvuHttg ensie Nar.iniMn u9 еаофъп, оптимальна  температура дл  его развити  28i-30 C, диапазон значений рН 7-8-8, оптимальное значение рН 7,. 8. Отношение к углеводам: f использует глюкозу с образованием ацетилметилкар;6инола , сахарозу, целлобиозу, не исполь- эует крахмал, маннозу. ОгНСййение к спиртам: усваивает сорЗит , глицерин. Отношение к органическим кислотам ; усваивает сукцинат, лактат, цитрат. Огнслпение к источникам азота: ассимилируетг аммоний сернокислый и другие аммонийные соли, усваивает глютамат, глютамин, аспартат, аспарагин, глицин, валин, пролин, аргшшн, орнитин. В синтетическую среду состава, г/%; глицерин 1%; MgSO47H2O 0,03%; MnSO45H2O О,О05%, СаСЕг О,ОО8%; f ZnSO4-7H2O 0,0005%, СиБОлЗНгО O,OOO5%;FeSO47H,2,O О,ОООО5%; К,НРОд 0,05%; (Nli,;),.,504 О,2%. На ;,имоннокис ый трехзамешенный О, 57 ( рН среды. 7,2) пскзле стерилизации внос т 5% по объему 1-2-с точного посевного материала BaciKus -itiuring -iensis jc -ini-two6, выращенного на этой же среде после смыва с 2-суточных кос ко молочного агара. Культивирование осуществп вот глубинным способом в колбах на 25О мл с 50 мл среды на качалке, например фирмы Gab&enVap, Англи  при 28-32С в течение 2 сут. Из культуральной жидкости (клетки отдел ют при бООО обА1ин в течение 1О мин) выдел ют Препарат протеазы пу тем высаливани  сернокислым аммонием до насьпцени  0,9, оставл   его дл  более полного высаливани  на 24 ч ггрн Выпавший осадок, содержащий протеолитический фермент, очищают от ионов суль фата аммони  на колонке фирмы Фармаци  (ЗОлбОО см) с сефадексом Gr-25 (wedium). Диалибованный препарат фибрйнолнтическую активность 2О98 усл. ед/мл при концентрации белка 1ОО мкг/м за 3 ч инкубации фибриновой пластинки. Преимущества предлагаемого способа по сравнению с известными заключаютс  в получении гомогенного стабильного очищенного фибринолитического фермента в повьшении экономичности способа, в увели чении выхода целевого продукт а, а также в возможности использовани  дл  получени  целевого продукта среды, идущей в отходы микробиологического производства . Фор м у л а изобретени  1. Способ получени  очищенного проуеолитнческого фермента, предусматривающий аэробное культивирование проду .цирующего его фермента на питательной 2 среде, содержащей источники углерода, азота н кшнерал-ьиых солей, осаждение и отделение клеток от культуральной жидкости , с последующим диализом и л офильной сушкой полученного фермента, отличающийс  тем, что, с целью обеспечени  стабильности фермежга и увеличени  его выхода, в качестве продуцента используют штамм BacitEus -t uringriensisNar-finit-imus, при этом культивирование провод т глубинным способом в течение 36-48 ч при 2832 С, осаждение ведут сульфатом аммони  при насыщении 0,8-О,9 с последующим диал зом и очисткой целевого продукта на сефадексе. 2. Способ ПОП.1, отличающийс  тем, что продуцент культивируют на среде следующего состава, вес.%: Глицерин О,5-1,5 0,О1-О,О5 с.ооз-о.ооа NMiSO.-SH О сасе; 0,005-О О1 Zn 304-1 2.0 О,ОООЗ-О,ООО7 О,ОООЗ-Ор007 СоЗОд5Н О О,ОООО2-0,О0008 peso -тн О К ПРО. 0,03-О,О7 ( 0,1-О,3 Т4а лимоннокислый трехзамещенный 0,1-О,3 Вода днстшшрованна Остальное Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Выборных С. Н., Егоров К. С. зучение препарата протеолитич;ескнх ерментов термофильного актиномицета ctinomvices -LtiermoNuKgaH штамма -54. Прикладна  биохими  и микробиоло- й , 1975, т. XI, вып. 6, с. 82933 (прототип).

Claims (1)

1. Фор мул а изобретения получения очищенного про—

   1. Способ неолитического фермента, предусматривающий аэробное культивирование ироду— •пирующего его фермента на питательной

   Остальное Источники информации, принятые во внимание при экспертизе