SU661006A1 - Способ получени биомассы,обогащенной полинуклеотидфосфорилазой - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к способу получени  микробильны.х биомасс, обогашенных биологически активными веществами.

Известны методы получени  биомасс с полинуклеотидфосфорилазной активностью из родов .Azotobacter, Micrococcus, Pseudomonas , Aerobacter, Proteus, Bacillus, Serratia , Xanthomonas, Achromobacter, Escherichia .

Известен способ получени  биомасс из Escherichia coli с полинуклеотидфосфорилазной активностью, предусматривающий использование Escherichia coli с активностью ,jj 1 ед/мг белка 1 .

Наиболее близким по технической cyni.ности и достигаемому результату  вл етс  способ гюлучени  биомассы, обогащенной полииуклеотид()зосфорилазой, предусматривающий культивирование бактерий Escherichia coli на питательной среде, содержаплей

пептон 2%, глюкозу - 0,2о/о, КНгРОл 0 ,1 тМ .а2НРО4 - 0,1 тМ (NHd)2 SO. - 0,2%, MgSO., -- 0,01%. EeSO, -- 5 мг/л. Услови  культивировани : рН питательной среды - 7,4, температура - 37.

Результаты культивировани : выход биомассы (по сухому весу) - Зг/л, aKTiiiiHOCTb фермента - 0,88/.|МР/мг белка 2.

Недостатками известного процесса  вл етс  недостаточно высокий выход биомассы , так как не обеспечиваетс  в полной мере питание органическим азотом, и недостаточно высока  активность по,чинуклеотидфосфорилазы в биомассе; что обусловлено низкой продуктивностью щтамма и тем, что гп1тательна  среда не обеспечивает достаточного углеводного питани , не обладает стабилизированной буферной системой и содер ит нон аммони , который нодавл ет накопление фермента в биомассе.

Це, предлагаемого изобретени   вл етс  увеличенне выхода биомассы с повыщенной по,пинуклеотидфосфорн,1азной активностью .

Поставленна  иел1) достигаетс  тем, что из штаммов Escherichia coli исно.чьзуют ипамм MRE- 600. а в состав питате,1ьной среды дополн11те,1ьно ввод т лимонную кислоту , гидролизат казеина и дрожжевой экстракт , при утом глюкозу, пептон и фосфаты берут в соотношении 1:0,02:1,66, а ко личество лимонной кислоты устанавливают раврл м 0.025% от объема среды. Предлагаемое техническое решение обеспечивает увеличение выхода биомассы, обогащенной гюлинуклеотидфосфорилазой до 4,5-5 1-/Л, и повышение активности фермента до 20-25ед/мг белка. Использованный в качестве продуцента штамм E.coli MRE-600  вл етс  мутантом, не способным синтезировать Г НК-азу I и обладает повышенной способностью синтезировать ПНФ-азу. Штамм Escherichia coli MRE-600 получг н из коллекции музейных культур Гос. контрольного института и.м. А. А. Тарасевича в 1972 г.и имеет следующую характеристику. Морфологи : палочки с раз.мерами (1,5-2 ,5) X (0,3-0,6)jfl, грамотрицате.;1ьны, споры не образуют, подвижны. Физиолого-биохимические свойства: факультативный анаэроб , желат  у не разжижает, культура растет на синтетических средах, преимундествень:о используют аммиачный а:,от, также растет на средах с пептоном, дрожжевым автолизатом , ги;Чролизатом казеина, свободный азот не фиксирует. Отношение к источникам углерода: сбраживает :vioHo-, .аи- и полисахариды, спирты и органические кислоты. Из последних слабо использус { умаровую и винокаменную кислоту , не использует лимонную и  блочную кислоты. В процессе роста нлтамм образует аммиак , сороиодоро.ч, 11дол, восстана ливает нитраты до нитритов. Культура |)астет при рН 5-9, оптимум рН роста 6-7, температура роста 30-37°С, имеет дезами11ирую1иие и декарбоксилирую|цпе способности. Нар ду с использованием нового штамма согласно предлагаемому изобретению в состав питательной среды ввод т лимонную кислоту как индуктор нолинуклеотидфосфо рилазы и стабилизатор буферной системы. Присутствие лимонной кислоты в нита-тельной ереде вли ет на реакции цикла трикарбоновых кислот клетки, таким образом сдвига  окислительные процессы клетки, косвенно вызыва  усиление биосинтеза ПНФазы . Лимонна  кислота в питательной среде повышает растворимость солей магни  и солей других двухвалентных металлов и тем самым стабилизирует фосфатно-буферную систему питательной среды, преп тству  образованию нерастворимых фосфатов и выпадению их в осадок. Таким образом, ионы магни  и фосфатов станов тс  более доступными дл  питани  клеток, что способствует приросту биомассы. Стабилизированна  буферна  система предотвращает преждевременное подкисление питательной среды во врем  роста культуры и обеспечивает повышенный выход биомассы . Введение в питательную среду глюкозы, пептона и фосфатов в cooTHonjeHHH 1:0,02: : 1,66 оказывает значительное воздействие на дыхательную функцию, вызыва  дисбаланс в синтезе макроэргических соединений фосфора и синтеза РНК. Выращивание клеток мри низшей точке оптимальных температурных пределов роста , т.е. при 28-30°С, также уменьшает дыхательную активность клеток. Снижение дыхательной активности вызывает повышение концентрации ортофосфатов в клетке и дегарадацию РНК в ней, что способствует биосинтезу и накоплению полинуклеотидфосфорилазы . В питательную среду дл  обеспечени  разнообрази  органического азота добавл ют также гидролизат казеина и дрожжевой экстракт. Таким образом способ заключаетс  в следующем: в качестве продуцента ПНФ-азы используют штамм E.scherich,a соИ MRE-600. Дл  получени  биомассы, обогашенной полинуклеотидфосфорилазой , культуру выращивают на синтетической питательной среде следующего состава: Пептон0,1% Гидролизат казеина1-2% Дрожжевой экстракт0,1-0,2% Р(НгРО 25-30 тМ NaiHPO425-ЗОтМ MgSO40,025% Лимонна  кислота0,025°/о Глюкозу в количестве 4-5% ввод т в питательную среду в виде стерильного раствора . Макси.мум биосинтеза иолинуклеотидфосфорилазы достигаетс  к 6-ому час культивировани . Результаты культивировани . Выход биомассы4,5-5,0 г/л, Активность ПНФ-азы 20 ед/мг белка. После ферментации биомассу отдел ют сепарацией и замораживают. В таком виде ПНФ-азна  активность сохран етс  до 6 мес цев без потерь. Пример 1. В качестве продуцента ПНФ-азы используют культуру E.coli MRE-600. Питательна  среда содержит: Пептон0,1% Гидролизат казеина1% Дрожжевой экстракт0,1 % КН5РО430 тМ Na2HPO430 тМ MgSO40,025% Лимонную кислоту0,025% 1% глюкозы ввод т в питательную среду в виде стерильного раствора в начале ферментации, остальные 4% - к 4-му час ферментации, рН питательной среды поддерживают на уровне 7,5-7,6 при помощи 50%-ного раствора КОН.

Выращивание микробной биомассы Е. соН MRE-600. Культура Е. соИ MRE-600 поддерживаетс  на столбиках МПА под вазелиновым маслом, пересеваетс  1 раз в год. I. Выращивание посевного материала. Культуру пересевают на кос ки и выращивают 24 час, после чего культуру пересевают в колбу со 100 мл питательной среды, инкубируют стационарно 10-12 час. Инокул т готов т, пересева  10-12 час культуру на 800 мл свежей среды из расчета 1:10 и выращивают на качалке при 37°С, 100 об/мин 3 час. 2. Ферментаци  культуры E.coli MRE-600 производитс  после добавлени  инокул та из расчета 40мл культуры на 1л питательной среды. Ферментацию ведут при температуре 29-31°С в услови х принудительной аэрации (2л возду.ха/л питательной среды).

Во врем  фер.ментации контролируют однородность культуры, прирост биомассы, рН. Выход бид.массы - 4,5 г/л. Активность ПНФ-азы - 25 ед/мг белка.

Пример 2. Состав питательной среды:

Пептон

0,

Гидролизат казеина

Дрожжевой экстракт 0,20/0

KHjPO. 25 тМ

МагНРОч 25 п;М 0,25%

MgS04

Лимонна  кислота 0,25%

Глюкозу в виде стерильного ввод т по 1% через О, 1,2,3,4 чавировани . Остальные операции осют как в примере 1.

Выход биомассы - 5 г/л

Активность полинуклеотидфосфорилазы 20ед/.мг белка.

Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает выход биомассы - 4,5- 5 г/л и активность полинуклеотидфосфорилазы 20--25 ед/мг белка.

Claims (2)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  биомассы, обогащенной иолинуклеотидфосфорилазой, предусматриваюо ий культивирование Escherichia соИ на питательной среде, содержащей глюкозу , пептон, сернокислый магний и фосфаты , отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода биомассы и интенсификации накоплени  полинуклеотидфосфорилазы, из щтаммов Escherichia coli используют щтамм MRE-600, а в состав питательной среды дополнительно ввод т лимонную кислоту, гидролизат казеина и дрожжевой экстракт, при этом глюкозу, пептон и фосфаты берут в соотношении 1:0,02:1,66.
2. 2. Способ по п. 1. отличающийс  тем, что лимонную кислоту ввод т в количестве 0,025% от объема питательной среды.

   Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

   1.Авторское свидетельство СССР № 401667, кл. С 07 Н 22/03, 1973.

   2.J. R. Williams, М. Grunberg-Manago. Polinujleotide phosphorilase hautement purificL a partu de E.coli. - «Biochem Biohys , 89, p. 66.