SU1615178A1 - Способ получени целлюлазы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, а именно к способам непрерывного культивировани  продуцентов целлюлолитических ферментов. С целью повышени  выхода целевого продукта и увеличени  продуктивности процесса непрерывное культивирование продуцентов TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM BKMF-367, T.VIRIDE BKMF-374, T.OUREOVIRIDE BKMF-2807 на I стадии накоплени  биомассы ведут на питательной среде, содержащей, мас.%: пшеничные отруби 0,3-0,4

хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4

биомассу гибберсиба 0,45-0,5

однозамещенный фосфорнокислый аммоний 0,25-0,30

сульфат кали  0,20-0,22

сульфат магни  0,025-0,030

воду водопроводную - остальное. На II стадии получени  культивирование провод т на гомогенизированной питательной среде, содержащей, мас.%: свекловичный жом 2,5-2,8

пшеничные отруби 0,3-0,4

хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4

нитрат натри  0,6-0,7

сульфат кали  0,25-0,30

ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ 0,2-0,25 - остальное. В процессе непрерывного культивировани  на I стадию получени  биомассы PH поддерживают на уровне 4,0-4,2, а на II стадии получени  целлюлазы PH 5,0-5,2. На I стадии непрерывного культивировани  питательную среду подают в виде гомогенизата или экстракта. Способ позвол ет повысить продуктивность процесса непрерывного культивировани  грибов рода TRICHODERMA в 3-5 раз. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Description

1

(21)4468135/30-13

(22)27.06.88

(46) 23.12.90. Бюп. № 47

(71)Московский технологический институт пищевой промышленности

(72)В.М.Кантере, М.В.Гернет, Л.П.Замотайлова, Т.В.Калинникова и А.П.Калинников

(53)577.15 (088.8)

(56)Ross А. , Schilgerl К. and Schei- ding W. Celltilase Produchion by Tri- chuderma reesei Fur J.Appl, Microbiol Biotechnol.j 1983, p. 29-37.

Gautam Mitra and Charles R. Wilke. Continuons celluiase production. - Biotechnology and Bioengineering, 1975, 17, p. 1-13.

(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ

(57)Изобретение относитс  к микробио - логической промьшшенности, а именно

к способам непрерьшного культивировани  npoflynieHToB целлюлолитических ферментов . С целью повьшени  выхода левого продукта и увеличени  продук- тивности процесса непрерывное культивирование продуцентов Trichoderma lungibrachiatum BKMF-367, T.viride BKMF-374, T.oureoviride BKMF-2807

на I стадии накоплени  биомассы ведут на питательном среде, содержащей, мас.%: пшеничные отруби О,3-0,4;хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4} биомассу гибберсиба 0,45-0,5} одноза- мещенный фосфорнокислый аммоний 0,25- 0,30i сульфат кали  0,20-0,22; сульфат магни  0,025-0,030, воду водопроводную - остальное. На II стадии получени  культивирование провод т на гомогенизированной питательной среде, содержащей, мас.%: свекловичный жом 2,5-2,8; пшеничные отруби 0,3-0,4 хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4; нитрат натри  0,6- 0,7; сульфат кали  0,25-0,30, фермен- толизат каныги с содержанием редуци- веществ 0,2-0,25 - остальное. В процессе непрерывного культивировани  на I стадии получени  биомассы рН поддерживают на ypoZiHe 4,0-4,2, а на II стадии получени  целлюпазы рН 5,0-5,2, На I стадии непрерывного культивировани  питательную среду подают в виде гомогенизата или экстракта . Способ позвол ет повысить продуктивность процесса непрерывного культивировани  грибов рода Trichoderma в 3-5 раз. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

W

с

О5

:л

СХ)

Изобретение относитс  .к миробио- логической промьшшенности, а именно к способам непрерывного культивиро- вайи  продуцентов целлюполитических ферментов.

Цель изобретени  - повышение выхода целевого продукта целлюлазы и увеличение продуктивности процесса.

Непрерывное культивирование продуцентов целлюлазы-грибов рода TriC hoderma ведут в две стадии, причем на I стадии накоплени  биомассы культивирование осуществл ют на питатель Н ой среде, состо щей из пшеничных отрубей, хлопкового гидролизованного Шрота, биомассы гибберсиба, одноза- 1 ещенного фосфорнокислого аммони , сульфата кали  и сульфата магни , а на II стадии синтез целлюлазы прово- длт на гомогенизированной питательной среде, состо щей из свекловичного жома, пшеничных отрубей, хлопко- Bjoro гидролизованного шрота, нитрата а|ммони , сульфата кали  и ферменто- ; изата каныги, при этом в продессе непрерывного культивировани  на I стадии получени  биомассы рН поддер-  ивают на уровне 4,0-4,2, а на II стадии получени  деллюлазы рН 5,0 - ,2. Кроме того, на I стадию непрерывного культивировани  питательную среду подают в виде гомогенизата или |кстракта.

: Биохимический состав исходной ка- - отхода м сомолочной промьш - енности, используемой в питательной фреде на II стадии культивировани ,% Клетчатка 47,9-48; лигнин 30,47-31) белок 6,7-6,9; жир 6,44-6,8} зола ,46-8,8.

Содержание аминокислот представ- jiieHo в таблице,

Дп  повышени  питательной цен- ности и ее усво емости каныгу обрабатывают ферментом целлюлазы. Полученный ферментолизат каныги обогащают аминокислотами, особенно стимул тора биосинтеза целлюлазы - ас- парагиновой и глутаминовой аминокислотами , содержание редуцирующих веществ достигает 0,6%.

Поддержание рН на I стадии культивировани  на уровне 4,0-4,2 позвол ет получить качественный посевной материал с выходом по биомассе 99% без наличи  посторонней микрофлоры , обеспечива  активный синтез целлюлазы . Значение рН 5,0-5,2, которое поддерживают на II стадии культивировани , соответствует максимальному биосинтезу целлюлазы. Отклонение от предлагаемых значений рН в сторону увеличени  или уменьшени  как дл  биомассы, так и дл  целлюлазы отрицательно сказываетс  на продуктивности непрерывного процесса на 10-11% относительно оптимальных значений.

Изменение состава среды по представленным концентраци м, изучение зпредельных значений показывает, что нарушение сбалансированной питательной среды по азоту, фосфору, углероду приводит к значительной потере прс дуктивности непрерывного процес- са, составл ющей 27-31% относительно оптимальных значений.

Способ непрерывного культивировани  осуществл ют следующим образом.

Установка дл  непрерывного культивировани  грибов рода Trichuderma состоит из двух ферментеров: первого ферментера объемом 2л и второго ферментера объемом 10 л, при коэффициенте заполнени  0,5. Питательна  среда дл  первого ферментера содержи мас.%: пшеничные отруби 0,3-0,4 J хлоковый гидролизованный шрот О,3-0,4i биомасса гибберсиба 0,45-0,5j одно- замещенный фосфорнокислый аммоний 0,25-0,3 сульфат кали  0,2-0,22; сульфат магни  0,025-0,03J водопроводна  вода остальное, дл  II стади непрерывного культивировани  питательна  среда содержит, мас.% свекловичный жом 2,5-2,8 пшеничные отруби 0,3-0,4 хлопковый гидролизованный шрот 0,3-0,4 нитрат аммони  0,6 - 0,7; сульфат кали  0,25-0,3, ферментолизат каныги с содержанием редуци- рующих веществ 0,2-0,25 остальное.

16151 786

Культивировацие начинают сначалапитательную среду дл  непрерывного

во втором ферментере на гомогенизи-культивировани  Гьп8 ЬгасЬ арованной среде при 29-30« с с числом-- i. lungibrachia

оборотов мешалки 320 об/мин, аэрации

1 объем воздуха на 1 объем среды, После 4 сут с момента начала биосинтеза целлкшазы включают первый ферментер дл  наработки биомассы на гомогенизированной среде или ее экстракта при 29-30 С и аэрации 1 объем воздуха на 1 объем питательной среды Через 24 ч роста гриба и максималь- кого накоплени  биомассы в первом ферментере включают проток из первого ферментера во второй с одновременной подачей питательной среды в первый и второй ферментеры. При этом рН в первом ферментере поддерживают на уровне 4,0-4,2, во втором ферментере 5,0-5,2 аммиачной водой.

Подпитку гомогенизированной питательной среды в обоих ферментерах осуществл ют при F 0,05 л/ч, при этом дл  первого ферментера D

0,05 ч, а дл  второго ферментера D 0,02

При данном способе непрерывного процесса получени  цеплюлазы получают высокопродуктивный процесс составл ющий 100-110 ед.. л/ч.

Пример 1, Непрер ывное культивирование гриба Т. longibrachiatum BKMF-367 начинают с периодического культивировани  сначала во втором Ферментере при 29-40«С, аэрации 1 объем воздуха на 1 объем среды п 320 об/мин с объемом питательной среды 5 л, содержащей, мас.%: свекловичный жом 2,5 пшеничные отруби 0,3, хлопковый гидролизованный жом 0,3i , 0,6, ,25j фер- ментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ 0,2 остальное.

Ферментолизат каныги готов т следующим образом. 1 г каныги обрабатывают 1%-ным NaOH при 1 атм, 1 ч при гидромодуле 1:20, после этого проtum . Через 4 сут, когда во втором ферментере начинаетс  биосинтез цел- люлазы, включают первый ферментер на гомогенизированной среде следующего состава, мас.%: пшеничные отруби 0,3{ хпопковый гидролизованный пфот О 3 10 биомасса гибберсиба 0,45; (NH4)2HP04 0.25; 0,2; MgS04 0,025; водопроводна  вода остальное.

Гидролизат хлопкового шрота готов т следующим образом. Шрот в ко- t5 личестве 4% заливают водой, довод т рН раствора 1 г NaOH до 12, нагревают до 100 С и кип т т 1 ч, после этого расчетное количество (0,3%) гидролизата ввод т в состав пита- 20 тельной среды. Биомасса гибберсиба - отход производства гибберсибалино- вой кислоты - стимул тора роста клеток .

Через 24 ч культивировани  в пер- 25 вом ферментере при достижении биомассы максимального значени  включают проток при D 0,05 дл  первого ферментера и D 0,02 второго ферментера при одновременной подпитке гомогенизированной питательной среды в первый-и второй ферментеры .с расходом среды 0,05 л/ч.

В услови х непрерывного процесса и установ-ившегос  режима (который наступает через 45-50 ч от момента включени  протока) дл  первого ферментера рН поддерживают на уровне 4,0, а дл  второго ферментёра рН - 5,0 (аммиачной водой).

В услови х установившегос  режима среда имеет следующий биохимический состав, мг/л: дл  первого ферментера - бш1ок.(по Лоури) 1,7; фосфор (общий) 4,0} азот (общий) 0,5/ дл  второго 45 ферментера - белок (по Лоури) 6 О

фосфор (общий) 2,1; азот (об.ий) 1.1.

При этом продуктивность непрерывного процесса составл ет 100 ед /ч по АФБ (активность по фильтровальной

30

35

40

мывают водой до рН 6,0, затем довод т cfl бумаге) гидромодуль цо 1:40 цитратным буферомп

с РН 5,0 и добавл ют препарат целло°.и  Р и м е р 2. Непрерывное кульбранин в количестве 0,2 г при 50 С™«ирование осуществл ют, по примеру

в течение 30 ч проходит рментолиз °Г ° питательной срезатем отдел ют жидкую фракцию Т ° ьзуют следующий состав, масЛ: ментолизат с содержа ием ре д цирую х рубТГз - ФеРментера - пшеничные веществ 0,6%. полученный ферментоГ ньй от оЧ бГ ™ДР° изованзат каныги разбавл ют водой до со-О 5 (т Tf гибберсиба

держани  РВ 0,2% и готов т на нейMgSO. °

MgbU(.u,93, дл  второго ферментера культивировани  Гьп8 ЬгасЬ а-- i. lungibrachia

tum. Через 4 сут, когда во втором ферментере начинаетс  биосинтез цел- люлазы, включают первый ферментер на гомогенизированной среде следующего состава, мас.%: пшеничные отруби 0,3{ хпопковый гидролизованный пфот О 3 10 биомасса гибберсиба 0,45; (NH4)2HP04 0.25; 0,2; MgS04 0,025; водопроводна  вода остальное.

Гидролизат хлопкового шрота готов т следующим образом. Шрот в ко- t5 личестве 4% заливают водой, довод т рН раствора 1 г NaOH до 12, нагревают до 100 С и кип т т 1 ч, после этого расчетное количество (0,3%) гидролизата ввод т в состав пита- 20 тельной среды. Биомасса гибберсиба - отход производства гибберсибалино- вой кислоты - стимул тора роста клеток .

Через 24 ч культивировани  в пер- 25 вом ферментере при достижении биомассы максимального значени  включают проток при D 0,05 дл  первого ферментера и D 0,02 второго ферментера при одновременной подпитке гомогенизированной питательной среды в первый-и второй ферментеры .с расходом среды 0,05 л/ч.

В услови х непрерывного процесса и установ-ившегос  режима (который наступает через 45-50 ч от момента включени  протока) дл  первого ферментера рН поддерживают на уровне 4,0, а дл  второго ферментёра рН - 5,0 (аммиачной водой).

В услови х установившегос  режима среда имеет следующий биохимический состав, мг/л: дл  первого ферментера - бш1ок.(по Лоури) 1,7; фосфор (общий) 4,0} азот (общий) 0,5/ дл  второго 5 ферментера - белок (по Лоури) 6 О

фосфор (общий) 2,1; азот (об.ий) 1.1.

При этом продуктивность непрерывного процесса составл ет 100 ед /ч по АФБ (активность по фильтровальной

30

35

0

бумаге) п

свекловичный жом 2,8; пшеничные отруби 0,4, хлопковый гидролизованный шрот 0,4; ,,- 0,3 фер ментолизат каныги с содержанием ре- дуцирую1цих веществ 0,25 остальное.

В установившемс  режиме в первом .ферментере рН поддерживают на уровне 3,2, а во втором ферментере - на уровне 5,2, Продуктивность непрерывного процесса 110 ед/л/ ч.

Пример 3, Аналогично пример 1, но на стадии получени  биомассы в первом ферментере используют экстрак питательной среды, а не гомогенизат, :при этом продуктивность непрерывного процесса составл ет 94 ед,«л/ч. ; П р и м ,е р 4, Непрерывное куль- |тивирование осуществл ют по примеру 1, только в качестве питательной среды используют следующий состав, мас.%: дл  первого ферментера - пше- |ничные отруби. 0,35; хлопковый гидро- пизованный uipoT 0,35; биомасса гиб- 1берсиба 0,48; (NH). 0,28 Ю,21 MgSP4 0,28J дл  второго ферментера - свекловичный жом 2,65| ;пшеничные отруби 0,35, хлопковый гид :ролизованный шрот 0,35 з 0,65; . 0,28, ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ 6522 остальное. Продуктивность непре рывного процесса составл ет 100 ед. Л/ :по АФБ.:

П р .н м е р 5, Аналогично примеру 15 но в качестве продуцента используют штамм Т, vi ride. BKMF-374. Продуктивность непрерывного процесса по АФБ составл ет 130 ед. Л/ч, i Пример 6, Аналогично приме- |ру 1, но в качестве продуцента испол зуют штамм Т, longibracViiatum BKMF- :367 и T,oureoviride BKMF-2807. Продуктивность непрерывного процесса по АФБ составл ет 104 ед,Л/ч,

Предлагаемый способ получени  цел люлазы позвол ет повысить продуктивность процесса непрерывного культивировани  продуцентов-грибов рода Trichoderma в 3-5 раз по сравнению, с известным способом.

Claims (2)

1. Способ получени  целлюлазы, предусматривающий непрерывное двух- стадийное культивирование продуцентов-грибов Trichoderma на питательной среде, содержащей на I стадии

0

5

0

5

0

5

0

накоплени  биомассы источник углерода и воду, а на II стадии - источник целлюлазы и воду до максимального накоплени  ферментов, о г- личающийс  тем, -что, с целью повышени  выхода целевого продукта и увеличени  продуктивности процесса, непрерывное культивирование на I стадии накоплени  биомассы ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода пшеничные отруби и дополнительно гидролизованный хлопковый шрот, биомассу гибберсиба, однозамещенный фосфорнокислый аммоний, сульфат кали , сульфат магни  при следующем соотношении компонентов, мас.%: Пшеничные отруби Хлопковый гидролизованный шрот

Биомасса гибберсиба

Однозамещенный фосфорнокислый аммоний Сульфат кали  Сульфат магни  Вода водопроводна 

при этом поддерживают рН на уровне 4,0 - 4,2, а на II стадии синтез целлюлазы ведут на гомогенизированной питательной среде, содержащей в качестве источника целлюлазы свекловичный жом и ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ 0,20-0,25, а также дополнительно пшеничные отруби, хлопковый гидролизованный шрот азотнокислый аммоний при следующем соотношении компонентов , мас.%:

0,3-0,4

0,3-0,4 0,45-0,50

0,25-0,30

0,20-0,22

0,025-0,030

Остальное

5

0

Свекловичньй жом Пшеничные отруби Хлопковый гидролизованный шрот

Азотнокислый аммоний Сульфат кали  Ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ

Вода водопроводна 

2,5-2,8 0,3-0,4

0,3-0,4

0,6-0,7 0,25-0,30

0,20-0,25

Остальное

при этом рН поддерживают на уровнеду подают на I стадию непрерывного

культивировани  в виде гомогенизата

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю-или экстракта, щ и и с   тем, что питательную сре