DE1442230A1

DE1442230A1 - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Erzeugnissen mit hohem Proteingehalt

Info

Publication number: DE1442230A1
Application number: DE19651442230
Authority: DE
Inventors: Douros Jun John D
Original assignee: Exxon Research and Engineering Co
Current assignee: ExxonMobil Technology and Engineering Co
Priority date: 1964-11-10
Filing date: 1965-11-05
Publication date: 1969-03-06
Also published as: OA01852A; CH492020A; GB1106646A; US3308035A; NL6514591A; SE327380B; DE1442230B2; JPS5337433B1; DE1442230C3; BE672087A; ES319455A1; FR1460155A; BR6574722D0

Description

-S.Hov.1365

Bi to Reeearoh and tog* Co.

BSSO BJäSSASOH AiTD MÖlHEERiiiÖ 0OMPAlIY, , New Jereey, Y.St»A«

aur afifcrobiolögiseheh Beaestelltittg von Kraeugnlesen hohoa Ptotoingehalt

füff diese Anaeidimg viffd die Priorität vom 10· Hovember 1964 aus der u0A*-¥atetttiuti9el&ifti£ Serial Ho* 410 299 la Anspruch ge-

nosnoen»

Me Irfindune betrifft ein Verfahren mm Züchten iron acht Mitaroorgaaieiien» die eine ungewöhnlich vorteilhafte yob Slgeneohftften aufweleen, tür Herstellung von

die einen oder aehrer· dieser Mikroorganieaen in lebeneimfiOilgeis tuetande enthAlten «ad iloh beeondere ale Br-

«α Yiehftttttr, Heine auf !Proteinbaeie, Heb*

etoffe lUHf« eignen·

91· *öht Mikröoreealeoeni die erfindungflgenjfioe verwendet iiiid »«ohetehend alt ihren A»t.O.O.-RegiBtrierungeBahlen

SOfifi 10/038? " ¹ ^m BADORIGINAL

angegeben» die sie bei der Hiederlegung von Proten bei der American Type Culture Collection in Washington, D.C, 7.StX, erhalten haben«

Harne des Mikroorganismus A.T.C.C.-Hummer Paeudomonas llgustri 15522 Paeudooonae pseudomallel 15523 Peeudeiaonaß orvilla 15524 Aleallgenes sp» 15525 Oellumonae galba 15526 Brevibacterium inseotlphilium 15528 Corynebaoterium ep. 15529 Oorynebaoterium pourometabolum 15530

Die bakteriologischen Kennzeichen dieser Mikroorganismen, die nach den nachstehend angegebenen Testverfahren bestimmt worden sind und zu der obigen Nomenklatur geführt haben» sind die folgenden«

. " * 2 90 981 0 /0,3 8 7 original inspects? ,

O UJ OO

A.T.C.C.-Nuffltntr Morphologie

Beweglichkeit (JraBt-Beaktion Horp&ologle der AKlt

155*2

Kahlehydrat-Sermentation

Pigaentiertmg

aelatine-Verflüasigung Wachs-trumeteiaperatur, Wachs tum a-pH-wert Harnstoff -Hydrolyse

Sulfidereeugung

KatalaaeerEeugung

Nitratreduktion Saueretoff Quell· Fundort

:t!5523

15584

15521"

kleines grara-

negatiToe

Stäbchen

-(negativ)

Bchillernd, deaförmlg, _ lenf örinige Oberfläche, gerippt, rhiaoid

+ auf Stärke und Glucose

grün auf iryp*· tose» braun auf Nähragar» weise auf Kartoffelstärke, igelartige Auebildung

30^o(37°»42°) 5,5-7,5

aerob

Boden

Boden-

Kohlenwaeser-

etoffe

^rail-negatives StSEbohen

/.erhabener ganger Rand, rauhe ^Oberfläche,

dünnes kleines Tlünires

;g%
ibutjrös

,+ nur auf Glycose

weias auf Kar-, toffelßtärke, Hähragar und Iryptoee, auf Dextrose (erzeugt grünes Pigment)

3O°(37°,42^O) 5,5*8

aerob

Boden

Boden-

Kohlenvaeeer-

etoffe

erhaben, rauh,
kreisförmig,
wellig undurohsiohtig, viskos

+ nur auf
Glucose

weiss auf allen Nährmedien,
fadenförmig

30°(37°)
5,5-9

aerob
Boden
Boden-Kohlenwasserstoffe

kleines gramnegatireö .„ Stäbchen" -'. -(unbeweglich)

.·*■·■■ ; λ '4 rauh, kreisfSrmig, etwas erhabener tyel!jLl— fer Band, unurunsichtig, membranftSrmig

+ auf Glucose - auf Stärke, Lactose, Saccharose, Mannit weiss auf Kartoffelstärke, grün auf Iryptose

30°(37°) 4,0-9

aerob
Boden
Boden- * Kohlenwasserstoffe

Hoaeniaaturprtlfungen

	S	Morphologie	15526	15528	15529	rahnf arbig auf	15530
	O		kleines dünnes	kleines gram-	langer Stab,	Kartoffelstär	pleonorphes
co	INA!		grais—positives	positives	etwas abgebo	ke, Sextrose»	gram-positive«
O			Stäbchen	Stäbchen	gen	Trypton	Stäbchen, et
co on		Beweglichkeit					was gebogen
VJL*		Gra»-£eaktion	+	-(unbeweglich)	-	32°	- . .
O		Morphologie der λ in· 4 a	+(positiv)	+(positiv)	+	4-9	+
"^		Agar-Kultüren	gelappt, flach,	hellgrünlich,	erhaben bu-		ganzer Rand
O t Λ			glatt undurch—	erhaben, glatt	tyro*s undurch	—	rahmartig
00		slehtig, mew-	undurchsichtig	sichtig	*
	Kbhlehydrat-fer-	branfönoig			aerob
		- auf Glucose,	+ auf Glucose,	-(fermentiert	Boden
		Lactose» Saccha	- auf lactose,	nicht)	Boden
		rose, Stärke	Saccharose,
■	flgaentlerufig	und Mannit	Stärke und Mannit
1		weiss auf Nähr-	weiss auf Dex	weiss auf 3)ex- "
		agar, gelb auf	trose, grünlieh	trose, rahm
I		krypton, weiss	auf Sr^pton	farbig auf Kar
		auf Kartoffel		toffelstärke
	Gelatine-Verflüssigung	stärke		und Trypton
	Waohstune-^S-wert	5o°	+(positiv)	32°
Hsametoff-Hydrolyae	5· 5-8	6-7,8	4-9
SuIfiderseitguiig	+(bei 48 SttU)
Vltratreimktiaa	-	-(negativ;
Saneretoff	WB
Quelle	aerob	aerob	aerob .^
Fundort	Boden	Boden	Boden j>.
	Boden-Kohlen-	Boden	Boden rv>
wasserstoffe		!230

U42230

Jeder dieser acht Mikroorganismen besitzt eine wertvolle Kombination von Eigenschaften, nämlich einen hohen Proteingehalt von »ehr als 50 %, einen hohen Index an lebenswichtigen Aminosäuren von sehr als 45 und eine ausgezeichnete Aminosäureverteilung, wie es sieh aus den nachstehenden Ausführungen ergibt. Ferner sind diese Mikroorganismen nioht-toxisoh und können daher in Futterergänsungsstoffen für Tiere verwendet werden. Bas Protein kann aus diesen Mikroorganismen naoh bekannten Verfahren extrahiert und der Proteinextrakt dann als Leim oder Klebstoff verwendet werden. Ein geeignetes Verfahren mim Extrahieren des Proteine besteht in dem aufeinanderfolgenden Iy β leren» a.B. mit Aceton oder anderen geeigneten organischen Lysierungsaitteln, basischer oder saurer Extraktion und isoelektrisoher Fällung. Aus den Mikroorganiemenzellen und bzw. oder des FermentationBoedium können intrazelluläre und bzw. oder extrazelluiäre Aminosäuren isoliert werden· In dieser Besiehung kann das erfindungsgenässe Verfahren al» kombiniertes Verfahren zur mikrobiologischen Synthese von Zellon und Chemikalien aufgefasst werden.

Das erfindungsgenässe Verfahren wird durchgeführt, indes ■an irgendeinen der oben genannten Mikroorganismen auf aliphatisohen Kohlenwasserstoffen» wie geradkettigen O₁- bis CU₀-Paraffinkohlenwaaeeratoffen, als Nährsubstrat in einem wässrigen Nährmediuo süoatet (fermentiert), welohos verfügbaren Sauerstoff und andere wesentliche Zellennährstoffe für diese Mikroorganismen enthält« Hierbei veraehren eioh dieito Mikroorganismen und

-J-

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sammeln sieh an« worauf die Kikroorganiamenzellen isoliert werden· Wenn diese Zellen als Bestandteil von Futtermitteln verwendet werden sollen, werden sie gewöhnlich vor ihrer Verwendung lebensunfähig gemacht.

Sie gegenwärtige Veitknappheit an Proteinen ist bekannt. Vm diesen Proteinmangel au beheben,- hat man in neuerer Zelt mikrobiologische Syntheseverfahren entwickelt, bei denen Protein durch Züchten von Bakterien auf verschiedenen kohlenstoffhaltigen Hährsubstraten erzeugt wird· Ein bekanntes Verfahren zur mikrobiologischen Synthese, von Protein besteht in der Züchtung von Hefe auf Kohlehydraten· Auseer den kostspieligen Kohlehydraten erfordern die meisten mikrobiologischen Syntheseverfahren auch nooh kostspielige Vitamine und bzw. oder andere Wuchsstoffe, um das gewünaohte Zellenwachstum zu erzielen«

Bin anderes, in neuerer Zeit entwickeltes Verfahren zur biologischen Proteinsynthese * welches aber nur sehr geringe Ausbeuten liefert, ist die Züchtung von Mikroorganismen auf Erdöl als Nährsubstrat unter Bildung von Estern und Chemikalien als Hauptprodukt und Mikrobenzellen als Nebenprodukt in sehr geringen Mengen. Bei diesem letzteren Proteinsyntheseverfahren verwendet man weniger kostspielige kohlenstoffhaltige Hährstoffe, ZcB. Kohlenwasserstoffe anstelle von Kohlehydraten} das Verfahren hat sich aber infolge der Schwierigkeit, Mlkrobenaellen mit hinreichend hohe» Proteingehalt und gleichzeitig hin-

reichend hohem Index an lebenawiohtigen Aminosäuren au gewinnen, nioht einführen können. Weitere Schwierigkeiten, die sich häu-

. - 6 909810/0387

fig bei der mikrobiologischen Synthese unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen ale Nährstoffen ergeben, sind die geringe Zellenwaohstuasgesohwindigkeit (äusserst lange Verweilseiten) land die Unfähigkeit der Mikrobenzellen, Kohlenwasserstoffe in wirksamer Weise für ihr Wachstum und ihre Vermehrung auasunutaen·

Das erfindungsgemäsae Verfahren bedeutet einen erheblichen Porteonritt auf des Gebiete der mikrobiologieohen Proteinayntheee, indes es das produktive Wachstum der oben genannten Mikroorganismen mit einer wertvollen Kombination von Eigeneohaften in guter Ausbeute bei hohen Wachstumsgeschwindigkeiten unter Verwendung von verhältnismässig wohlfeilen aliphatischen O₁- bis {^-Kohlenwasserstoffen, z.B. geradkettigen Cj- bis O-Q-Paraffinen, Og- bis C«Q-01efinen usw., für das Mikrobenwaohatun ermöglicht. Perner lassen sich die hier angegebenen Mikroorganismen leicht von der FermentationaflUseigkeit, in der iie gesüchtet werden, abtrennen, wodurch der wirtschaftliche Wert der Erfindung noch weiter erhöht wird*

für das Kulturmedium, in dem die oben genannten Zellen Bit de» hohen Proteingehalt und dem hohen Index an lebenswichtigen Aminosäuren sich vermehren und ansammeln, können als Hauptquellt für Kohlenstoff und Wasserstoff für das Zellenwaohstuii geradkettig· aliphatieche Kohlenwasserstoffe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen im Molekül verwendet werden· Gewöhnlich besteht die Kohlenstoff quelle aus geradkettigen Og- bis C-g-Paraffi^n, B.B, leiohten C₆- bis 0^-Benzinen, d.h. niedrigsiedenden Kohlen-

- 7 909810/0387

wasserstoff ölen der Reihe O_nH_2n+2 mit Siedepunkten «wischen 95 und etwa 150° 0 und diese enthaltenden Erdölfraktionen sowie O₁₁- bis O~₀-Gasölen mit einem Siedebereioh von etwa 190 bis 320° C und diese enthaltenden Erdölfraktionen« Die ale Nähretoffe für die Mikroben bevorzugten geradkettigen Paraffine sind geradkettige O₁₁- bis C»₀-Paraffine· Alle oben genannten Nährstoffe können ausserdem geradkettige Olefine» E.B* Og- bis Oj₀-Hono- und Polyolefine, in wechselnden Mengen» s«B· von 0,05 bis 30,0 öew,~# (bezogen .auf die Gesamtmenge der Kohlenwasserstoffe in dem Hährmedium) enthalten«

Mehrkernige aromatische Verbindungen sollen im allgemeinen in dem Nähraedium nicht «enthalten sein, weil eie als Bögliohe Xrebserreger gelten und die geernteten Zellen verunreinigen können»

Obwohl die Anwesenheit von versweigtkettlgen aliphatischen Kohlenwasserstoffen (sowohl Olefinen als auch Alkanen) in Konsentrationen bis 30 Gew.-ffc des Kohlenwasserstoff-irahretoffe· suläaaig ist, werden Konsentrationen an nioht-gera&kettlgen all« phatisohen Kohlenwasserstoffen von mehr als 10 5ew.-£ gewöhnlich vermieden» weil die oben genannten Mikroorganismen für gercdkettige aliphatisohe Kohlenwasserstoffe» besonders für geradkettige ftliphatisohe O₁₁- bis S^-Kohlenwasserstoffe» sind·

Sauerstoff kann dem Kulturmedium in jeder $©sa werden» in d®r er von dem Xapfaikroorganismus leicht ?tssi*iliert wird, mA auch sauerstoffhaltig@ Verbindungen könnt» verwendet

- a - ■

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UA223Ö

werden» soweit sie dee Zellenwaohatua des Mikroorganieaue und die Umwandlung der Kohlenwasserstoffe in Mikroorganiemeneellen nicht beeinträchtigen. Zweokmässig wird der Sauerstoff in for« eines eaueretoffhaltigen Gases» wie luft, «!geführt, welches 19 bis 22 Gew.-Jt Sauerstoff enthält. Obwohl man voraugeweiee Luft verwendet, kann auoh an Sauerstoff angereicherte Luft r·*- windet werden» die mehr als 22 Oew.-J* Sauerstoff enthält.

8tlokstoff 1st ebenfalls für die mikrobiologische Syntheee wesentlich. Als Stickstoffquelle kann man- alle organischen oder anorganischen Stickstoffverbindungen verwenden» die Stickstoff in' einer für den Metabolismus des au erntenden MikroorganisBue nutsbaren form abgeben. Zu den verwendbaren organischen Verbindungen gehuren beispielsweise Proteine» Bit Säure hydrolysiert· Proteine» alt Enzymen aufgeschlossene Proteine» Aminosäuren» He ft extrakt, Asparagin» Harnstoff usw.i diese Stoffe können auoh gleioheeitig als Kohlenatoffquellen dienen. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit verwendet nan jedoch gewöhnlich voreugsweise anorganische Verbindungen, wie Ammoniak, Ammoniunhydroxyd oder Salse desselben» wie AmaBoniunoitrat» Anmoniumaulfat, ABaooniumphosphat» saures Amexmiuaphosphat usw. Bin sehr geeignetes und ■ufriedenetellendee Verfahren sub Zuführen von Stickstoff besteht in der Verwendung von Aunnoniumphoephat oder saures ή mm η niuBphosphat» we lohe e ale Sals sugesetst oder in den wässrigen Permentationaeedium selbst erzeugt werden kann» indes nan nach vorherigem Zusats von Ihosphorsäure duroh das Ternentationeme dium nassierenden Stlokstoff hlndurohleitet» so dass sioh saures

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Amnoniumphoephat bildet»

Ausser der Energiequelle und der Stiokstoffquelle müssen noch die erforderliohen Mengen an mineralischen Hänrstoffen sugesetat werden» um das richtige Wachstum der Mikroorganismen au gewährleisten und die Selektivität, d.h. die Umwandlung τοη Kohlenwasserstoffen in Mikroorganismenaellen, auf eine» Höchstwert su halten. Das wässrige Nähmnedium enthält daher ausserdeo Ka-IiUBf Satrium» Eisen» Magnesium» Calcium, Mangan» Phosphor und andere Xähretoffe. Biese notwendigen Stoffe werden in Form ihrer Salse» und zwar vorsugsweiee ihrer wasserlöslichen Sals·» zugesetzt. Kalium kann z.B. als Kaliumchlorid» Kaliumphosphat, Kaliumsulfat» Kaliumoitrat» Kaliumaoetat» Kaliumnitrat usw« su» gesetst werden· Eisen und Phosphor können in Form von Sulfaten bBw. Phosphaten, z.B. Eisensulfat oder Bisenphosphat» sugesetat werden. Oewöhnlioh wird der grosste Seil des Phosphors in form von Ammoniumphosphat zugesetzt. Wenn Amaoniumphosphat öder saures Ammoniumphosphat verwendet wird» kann es gleichzeitig als Quelle für Stickstoff und Phosphor (Phosphationen) für das Wachstum der Mikroorganismenaellen dienen« Die allgemeine Zusammensetaung des Fermentationsmediums ergibt sich aus der folgenden Übersiohti

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Konzentration, g/l

Bestandteile

Allgeaeiner Üblicher Seven Bereich Bereioh tar Bereioh

ueradkettige aliphati« sohe O₁₁- bis C₅₀-

KJohlenwaseeretoffe

K₂HPO₊
()

Ia₂SO₊
IeSO₊*7 HgO MgSO₊«7 H₂O AiBO₄ »4 H₂O HaOl
Wasser

4-120

0,5-15 5-15

0,1-1,0 0,002-0,05

0,1-0,7 0,002-0,05 0,002-0,05

5-80 1-10 7-13 0,2-0,9 0,005-0,04

0,2-0,6 0,005-0,04 0,005-0,04

—Aufgefüllt auf

Andere äineralieohe Hähretoffe, die gegebenenfalls la ßpuremengen sugee?tst werden können, sind die folgenden!

Konientration, ng/1

	Allgeaeiner	Üblicher	Beroraug-
Bestandteile	Bereioh	Bereioh	ter Bereioh
ZnSO₊*HgO	0-0,4	0-0,5	0-0,2
Ha₂MoO₊. 2 H₂O	0-0,06	0-0,05	0-0,04
QoOl₂	0-1,2	0-1,1	0-1,2
H₃BO₅	0-0,08	0-0,07	0-0_c06
GNtSO₊* 5 H₂O	0-0,3	0-0,25	0-0,2
GaOl₂*6 H₂O	0-0,14	0-0,13	0-0,12
IiOl₂.6 H₂O	0-0,01	0-0,008	0-0,006
Die wesentlichen und die sesebm	lenfalls an«	rendbaven SIIIu

stoffe kOnnen naturlioh auch in Jörn anderer Salse als der oben angegebenen sugesetst werden.

Die Temperatur der Kultur bei der aikrobiologisohez^ Synthese kann je naoh dea besonderen, su Buchtenden Mikroorganieaui

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in Bereioh von etwa 20 bis 55° 0 schwanken, liegt aber gewöhnlich im Bereich ron etwa 20 bis 45° 0. forzugsweise wird die Fermentation bei Temperaturen von etwa 25 bis 40° 0 durohge* führt. Srfindungsgemäss führt nan die Fermentation in des oben beeohriebenen Medium in Submerskultur duroh, indem man ein Impfgut des eu erntenden Mikroorganismus au des Ferfflentationemedlum zusetzt, welches geradkettig« aliphatisch* Kohlenwasserstoffe ale Nährstoffe enthaltt den pH-Wert zwischen etwa 6 und θ und die Temperatur auf dem für das richtige Wachstum erforderlichen Wert hält und das Medium unter gleichzeitiger Belüftung schüttelt oder rührt· Wenn der pH-Wert für das günstigste Wachstum des Mikroorganismus zu hoch wird, kann er durch Zusatz einer geeigneten Säure» z.B. Salzsäure« zu dem feraentationsmedlum herabgesetzt werden. Wird der pH-Wert au niedrig» «o kann er

duroh Zusatz einer Base, wie Ammoniak oder Araaoniuianydroxyd, erhöht werden«

Zu Beginn der fermentation wird das Medium ait dem zu erntenden Mikroorganismus beimpft, z.B. indem man ein Xmpfgut verwendet, welches zuvor, wie oben beschrieben, in dem gXeiohen Mtdium, in welchem es gezüchtet werden soll, gewonnen worden ist* Bit Alifangekonzentration an Impfgut kann innerhalb weiter grenzen» auB. von 0,0005 bis §0,0 g Je 1 des gesamtes *er*entationsmediumsf sohwsnken· Man Isann auch «ädert Iep£^erfahren «a« wenden, s.B« die Anwendung eines Xmpfgutes des Äkroorganiemus, welohts in finem anderen Mtdiuu als in deaieniftn, la um 41· sachfolgesd· fermentation durchgeführt werden soll»

BAD ORIGINAL - 12 - ·

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Η4223Ό

worden let, und welches em Zwecke der Beiapfung denn In das fermentationsgefäes bsw. die fermentationsgefässe übergeführt wird.

Ap Ende der fermentation werden die Zellen von den Versentationsmedium, »·Β. durch. Dekantieren» filtrieren (mit oder ohne filterhilfsmittel), Zentrifugieren usw·» getrennt» Si· abfiltrierten Zellen können dann entwässert werden» s.B. Bit Hilfe Ton rotierenden Trommeltrooknern, Zerstäubungstrockner!! usw. ι dies ist jedoch nicht unbedingt erforderlioh« Die Zellen werden gewöhnlich tot ihrer Verwendung durch 2 bis 30 Sekunden lange Zerstäubungstrocknung bei 190 bis 185° 0 lebensunfähig gemacht. Bei der fasteurisierung soll sorgfältig darauf geachtet werden, dass extreme Temperaturen für längere Zeiten rermieden werden» wenn die geernteten Zellen als Proteinergänsungsstoff verwendet werden sollen (damit das Protein nioat sersetat wird).

Wenn die Zellen dagegen sur Herstellung τοη leim, Klebstoffen usw. verwendet werden sollen» brauchen sie nicht lebensunfähig gemaoht au werden» da in diesen falle die Extraktion des Proteins genügt. Das gleiche gilt, wenn die Hikroorganismeneellen iweoks Gewinnung ihres Gehaltes an lntraaellulären Chemikalien, wie Aminosäuren, gesüohtet und geerntet werden.

Beispiel 1

Be wird ein FeraentatlonssedlUB der folgenden Zuaaaaensetsung hergestellt t

Bestandteile Kongentration, a/l

n-Sexadeoan* 2O₉O

5»0 10,0

₄ 0,5

HgSO₄»7 H₂O 0,4

fe80₄-7 H₂O 0,02

MttS0₄°4 H₂O 0,02

VaOl 0,02

Wasser aufgefüllt auf 100 ml

* Seohnleohes n-Hexadecan Bit einem Gehalt an geradkettigea 0_i6-Monoolefin von weniger als 1 Gew,-jf«

Vaoh Einstellung des pH-Wertes auf 7,2 bis 7,7 wird dieses Medina in 900 nl-Brlenaeyerkolbeii duroh 19 Hinuten langes Brhitsen auf 121° 0 sterilisiert. Dann wird das Ptmentationenediua ait 0,001 g BrevibaoteriuB inseotlphlliu» (A.I,0,0. . Vr* 19928) je 1 beiapft, welohes euvor 48 Stunden bei 30° 0 in einen Medium der gleichen Zueaannenaetssung gesüohtet worden ist« Sie VerBentatiön wird unter Schütteln bei 30° 0 in Terlaufe τοη 48 Stunden unter Innehaltung eines pH-Werte» von 6 bis 7,5 durchgeführt.

Vaoh 48 Stunden beträgt die Sellenkonsentration 6,2 gA» und 40 Gew.-J* des n-Hexadeeans sind τοη des MikroorganieBus Terbrauoht worden (die Zellenausbeute betrügt 77,9 0» be sogen auf den verbrauchten aliphatischen Eohlenwaeeeretoff). Vaoh Beendi-

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/IS 1U2230

ging der Fereentation wird das Mediua aentrifugiert, und dl· Zellen werden 4 Seinanden in elnea Zerstäubungstrockner bei 180° 0 sterilisiert.

Beispiel 2

Oorynebaoteriu» ep« (A.T.O.G. Hr. 19929) wird 48 Stund·» bei 30° 0 unter den Bedingungen dee Beispiels 1 Bit de« Unterschied fermentiert, dass die Konsentration an n-Hexadeoan 10 g/1 betrfigt. Haoh 48 Stunden beträgt das Zellenwaohstue 9»5 β/1» und 100 Jt des n-Hexadeoans sind verbraucht worden (Seilenausbeute 99 jt» belogen auf den verbrauchten aliphatieohea Kohlenwasserstoff)·

Beispiel 3

OorynebaoteriuM pourosetabolua (Λ·Χ·Ο·Ο· Hr. 15530) wird 48 Stunden bei 30° 0 und eines pH-Wert τοη 6 bis 7 genäse Beispiel 1, jedoch bei einer Konzentration an n-Hexadeoan τοη 17 g/l» geeüohtet. Naoh 48 Stunden beträgt das Zellenwaohstua 12|8 g/l, und der geradkettig« aliphatisohe Kohlenwasserstoff ist au 100> rerbrauoht worden (Sellenausbeute .75 ^* belog·» mat das Terbrauohte n-Hexadeoan).

jBsispisl 4

PseudOMonas ligustri (Α.ϊ.Ο.σ. Ir. 15922) wird 48 Stunden bei 30° 0 und ein·« pH-Wert τοη etwa 7,8 naoh Beispiel 1, Jedooh bei ein« Xonientration an n-Hexadeoan τοη 17 g/l, geiüohtet· laoh 48 Stunden beträgt das Zellenwaohstuii 9 g/l, und das n-Hexadeoan ist su 99,9 + duroh dan Mikroorganisaus rerbrauoht worden (Bellenauebeute etwa 51 +% beeogen auf das verbraucht· n^exadeoan).

309810/0387 ~ ¹⁵ " ' ⁽

Beispiel 5 , _τ ,. ,

Fseudoaronas pseudonallei (A,T,C.C. Kr. 15523) wird 48 Stunden bei 30° 0 und eines pH-Wert von 7 bis 8 genäse Beispiel 1, jedoch bei einer n~Hezadeeankonsentration von 17 g/lt gesiiohtet. Haoh 48 Stunden beträgt das Zellenwaohstua 6 g/1» ^aA 52 H des n-Hexadeoans sind verbraucht worden (Zellenausbeute 70,7 Jt, belogen auf die verbrauchte Menge des geradkettigen aliphatieohtn Konlenvasseretoffe)·

• BeJBPiel 6

Peeudooonae orvilla (Α»Φ·Ο«Ο· Hr. 15524) wird 48 Stunden bei 30° 0 genäse Beispiel 1» jedoch bei einer Konsentration an n-Hexadeoen von 17 gA» gesuchtet. Haoh 48 Stunden beträgt das Zellenwaohstua 5» 5 g/l» und 52 j( des n-Hexadeoans sind verbraucht worden (Zellenausbeute 62,5 #» besogen auf das verbrauohte n-Hexadeoan).

Beispiel 7

Aloaligenes ep. (A.E.0.0, Hr. 15525) wird 48 Stunden bei 30° 0 genäse Beispiel 1» jedoch bei einer Konsentration an n-Heacadeoan von 17 g/l» gesüohtet. Haoh 48 Stunden werden die Zellen in einer «enge von 5 g/l geerntet, und 80 £ des n-Hexadeoans sind verbraucht worden (Zellenausbeute 22 £, besogen auf das verbrauchte n~Heyadeöan).

■ ■- - , Beispiel 8 .-....■ ^r^

Otlluooßae galba (A.T.0.0. Mr. 15526) wird 48 Stunden bei ' 50° 0 geoäss Beispiel 1, jtdooh bei einer Konaentration an n.Htxadeoan von 17 g/l ι g· Buchtet. Haoh 48 Stunden beträgt das

•909810/0387 -16- badoriginal

1U2230

Zellenwaohatini 6»3 g/l# rad $1 ^ dee geradkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffs sind verbraucht «orden (Zellenauabeute 77 %» !»•sogMi auf die von dea Mikroorganismus verbrauchte Menge an n-Hexadeoan)·

Beispiel 9

In d«n naoh Beispiel 1 fels 8 geattohteten und geernteten acht ÄLkroorganiMwn werden der Proteingehalt, der Index an Iebenaviehtlgen Aainoeäuren und die Aainoeäureverteilmig nach liekannten analytieohen Terfahren und Berechnungen beetiaet.

Der Proteingehalt (in Prosent) wird aus des duroh KJeldahl-Analyee beetimeten Stiokatoffgehalt (in Oewiohtaprosent) der Zellen durch Noltiplieieren Bit 6,29 ermittelt·

Der Index an lebenswichtigen Aminosäuren in den geernteten Zellen wird nach der bekannten Methode unter Verwendung τοη Bi ale Yergleiohaetoff beatinrt« Bi wird ale vollkosoenee Protein ■it eines Index an lebenawiohtlgen Aeinoeauren von 10O₉O betrachtet ·

Die ABfiererteilung in den geernteten Zellen wird - sit Auenahae τοη Tryptophan, welohee duroh sikrobiologisohe Analyee beetieat wird - duroh ohroaatographieohe Analyee ereittelt.

Der Proteingehalt und der Index an lebenewiohtigen Aalnoeauren (I..A.B.-Index) für die geernteten Zellen sind in label-Ie I, die Asdnosäurererteilungen in Tabelle II angegeben·

- 17 909810/0387

ΛΙ

Beiapiel

Tab·!!· I

Geerntete Zellen

Brevibacterium ineeotiphilium (A.T.0.0. Nr. 15528)

Oorynebaoterium ep.

.Ο.Ο. Wv. 15529)

Oorynebaoteriun pouronetabolum (A.T.O.O. Hr. 15530)

Pseudomonas liguetri (A.Ϊ,0.0. Hr. 15522)

PeeudoBonae peeudoaallei (A.T.0.0. Hr. 15523)

Peeudononae orvilla (A.T.O.Oo Hr. 15524)

Aloaligenes ep·

(A.T.O.O. Hr. 15525)

Oellumonae galba

(A.X.O.O. Hr. 15526)

Protein- gehalt, i»	Ü.A.S.- Index
53,6	60
69,0	58
59,6	63,3
60,9	46,8
56,8	58,2
62,0	63,0
70,0	74,1
51,4	65,9

-18 -

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1U2230

Tabelle II (AsjLnos&ttrsverteilvffift)

, , (Jew.-^ AininoBäure in den geernteten Zellen

LebenewichtigeΙΛ: gesäss Beispiel Aminosäuren 1 2 3 456 78

Arginin 2,72 2,6 3,0 2,4 2,9 3,1 4,1 3,0

Glycin 2,0 3»0 2,4 2,0 2,1 2,1 3,0 2,6

Ieoleuoin 2,3 3,0 2,4 1,1 1»9 2»* 3,8 2,5

leucin 3,5 4,2 3,7 3,3 3,4 3,4 4,8 3,0

Methionin 0,72 0,83 0,75 0,6 0,76 0,9 1,2 0,75

HienylalaBin 1,5 1,9 1,7 1,5 1,6 1,7 1,8 1,7

▼elin 2,5 3,2 2,6 2,1 2,3 2,7 3,8 2,7

Tryptophan n.b,* n.fc,* n.b.* 1,6 0,68 1,12 1,0 1,2

2,4 2,8 2,3 1,5 2,4 2,6 5,0 0,93

♦ n.b· = nicht bestisst·

Wie die obigen Werte «eigen, besitsen alle geaass der Erfindung geerntete Hikroorganiesen eine wertvolle Eosbinatlon von hohes Proteingehalt von sehr als 50 Jt, hohes Index an lebenswichtigen Aminosäuren von sehr als 45 £ und nahrungeeittelteohniech wertvoller Asinosäureverteilung· Hieraus ergibt sich, dass die Erfindung die Gewinnung von technisch verwertbares Protein unter Verwendung dieser aoht Mikroorganismen in äusmsrst wirtschaftlicher Weise eraöglioht. Die Erfindung ist daher besondere wertvoll für die Herstellung von fisrfuttsr-Xrgäniungsstoffen sit bedeutendes Proteingehalt und Geeantnahrwert. Wenn die geernteten Xikroorganisssnsellen als proteinhaltigs fcuttsrsvgänsungsstoffe verwendet werden, können die lebensunfähigen

909810/0387' . " ¹⁹ "

ίο

U42230

Zellen von ssweien oder mehreren der oben genannten acht Mikroorganismen miteinander oder mit anderen Proteinergäneungsstoffen ssu einem vollständigen Frotein-Hähretoff gemischt werden, wie sioh aus dem folgenden Beispiel ergibt.

Beispiel 10

Die geernteten Zellen der nachstehend angegebenen Mikroorganismen werden in den angegebenen Gewichtsverhültnissen miteinander gemischt· Dann werden die Gemische gemäse Beispiel 9 auf ihren Sticketoffgehalt, ihren Proteingehalt (in i» Protein)» ihren L.A.S.-Index und ihre Aminoeäureverteilung untersucht. Die hierbei erhaltenen Werte sind in den nachstehenden Tabellen angegeben. Tabelle XII zeigt die Zusammensetzung der Gemisohe (Gewiohtβverhältnis) sowie den Stickstoff- und Proteingehalt und den L.A,S.-Index, während in Tabelle IY die Aminosäureverteilung fur jedes Gemisch angegeben ist.

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ΗΑ2230

Tabelle III

Stickstoff- Protein-

Ge- Zueaaneneeteung und gehalt, gehalt» I.A.S.-nJBoh GewlchtBverhältnifl _ Gew.-^ Gew.-£ Index

A Beiep. 4 und Beiep· (IsD

B Beisp. 4 und Beiep. (2*1)

0 Beiep· 4 und Beiep. (1:3)

D BeiBp. 4 und Beiep. (1*1)

S Beiep. 1 und Beisp. (112)

f Beiep· 2 und Beiep. (1*1)

d Beiep; 2 und Beiep. (1*2)

H Beiep. 3 und Beiep. (1*3)

9,42	58,9	49,3
9,53	59,6	50,7
8,61	53,8	58,0
9,84	61,5	50,4
9,47	59,2	56,5
9,62	60,12	57,7
10,2	63,6	48,3
9,7	60,6	47,1

- 2t -

so** ft tos/· α seiet..

	Tabelle	W (Aminoeäiarever teilung)	·$ Aminosäure in	D	JL	den	1442230	α	H
		Gew.·	0	2,9	3,0			2,9	2,9
Lebenswichtige Aminosäuren	Λ	B	3,1	3,3	3,4	3		3,6	3,4
Threonin	2₉8	2,7	4,4	3,9	4,4	4	Gemisch	3,8	3,6
Glyoln	3,4	3,4	4,7	1,2	1,4	4	P	1,0	1,0
Valin	3,7	3,6	1,3	2,9	4,2	1	,3	2,6	2,2
Methionin	1*1	1,0	3,9	5,4	5,7	4	,5	5,6	5,5
Ieoleuoin	2,5	2,2	5,7	2,0	1,9	5	,8	1,9	2,0
leucin	5,6	5,5	1,8	2,5	2,7	1	,3	2,5	2,5
Tyrosin	2,1	2,1	2,9	3,3	4,2	2	,5	3,0	2,7
Phenylalanin	2,6	2,5	4,3	1,6	1,5	4	,9	1,6	1f7
lysin	3,2	2,9	1,8	4,5	5,0	1	,7	3,9	4,2
Histidin	1,6	1,7	5,2	4	,9
Arginin	4,5	4,3	,5
		,5
	,6

Ferner eignet sioh die Erfindung zur mikrobiologischen Synthese von intrazellulären und extrazellulären Chemikalien. !Durch weitere Fermentationsversuche mit den Mikroorganismen gemäSB Beispiel 7 (A.T,C.C. Nr. 15525) bzw. Beispiel 8 (A.T.CC. Nr. 15526) in Fermentationsmedien mit Konzentrationen an n-Hexadeoan von 4 bis 16 £ wurden Gemisohe von extrazellulären Aminosäuren in Mengen von 1,109 g/l bzw«, 0,326 g/l gewonnen. Diese ffermentationsversuohe wurden bei 30° C unter Schütteln im Verlaufe von 72 bis 144 Stunden in zwei Stufen durchgeführt, wobei in der ersten Stufe im Verlaufe von 24 bis 48 Stünden die Zellen der Mikroorganismen in Mengen von 0,8 bis 9,4 g/L mit

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einen geradkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoff als Nährstoff gebuchtet wurden, während in der zweiten Stufe in Verlaufe von 24 Die 96 Stunden unter den gleichen Bedingungen versohiedene Hangen im Bereich von 6 bis 10 £ n-Anylbenzol zugeeetst wurden· Die Zellen und die Aminosäuren wurden nach den ZueatB des n-AUylbenzols bzw« der n-Alkylbenzole oder Qenisohe derselben geerntet·

In den obigen Beispielen wird zwar durchweg nit einer 7ernentationsdauer von 48 Stunden gearbeitet} die Fermentationszeit kann jedoch innerhalb weiter Grenzen von etwa 50 Minuten bis zu kontinuierlichen Betrieb variieren. Das absatzweise geführte lernentationsverfahren wird gewöhnlich zur Erzielung der höchsten Zellenausbeute und Innehaltung eines wirtschaftlich vorteilhaften Zellenwaohstuns in Verläufe von 1 bis 5 lagen* vorzugsweise von 36 bis 96 Stunden» durchgeführt·

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Claims

Eeso Resβaroh and Engo Go. Patentansprüche Patentansprüche

1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Erzeugnissen mit hohem Proteingehalt von mehr als 50 $> und einem Index an lebenswichtigen Aminosäuren von mehr als 45* dadurch gekennzeiohnet, dass der Mikroorganismus

Pseudomonas ligustri (A₀T.C,G. Nr₀ 15522)» Pseudomonas pseudomallei (A.T»0.G_e Nr. 15525), Peeudomonas orvilla (A»T.C.C. Nr. 15524}» Aloaligenes sp. (Α.Ι,Ο.Ο. Kr. 15525)* Cellumonäs galba (A^T.0.0. Nr. 15526), Brevibacterium inseotiphiliura (A.T.CcC= Nr. 15528)» Oorynebaoterium ep. (A.T.C,C. Nr. 15529) oder Corynebaoterium pourometabolum (A.E.G.O. Nr. 15550)

in «ittea wäeerigen Pennentationemediua, welches Sauerstoff und •ader· wesentliche Zellennähretoffe enthält, unter Verwendung von geradkettigen aliphatischen Kohlenwaseeretoffen als Nähretoff bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 55° C geaüoh-

& 0 9 § 10/03

BAD ORIGtNAL

tet wird und die Mikroorganismenzellen geerntet werden.

2ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als geradkettige aliphatische Kohlenwasserstoffe geradkettige aliphatische C-- bis C~Q-Kohlenwasserstoffe verwendet werden.

3β Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die geradkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffe in Konzentrationen von 4 bis 120 g/l angewandt werden·

4-· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation absatzweise im Verlaufe von etwa 24 bis 120 Stunden durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die geernteten Zellen durch Erhitzen auf etwa 150 bis 185° 0 lebensunfähig gemacht werden.

6β Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Nährnedius verwendet wird, welches die folgenden Bestandteile in den folgenden Konzentrationen enthältt

Bestandteil Konzentration, g/l

geradkettiger aliphatisoher Kohlenwasserstoff

(BH₄J₂HPO₄
Va₂SO₄
PeSO₄*7 HgO MgSO₄.7 H₂O WaSO₄-4 H₂O IaOl

-X-

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4-120 0,5-15 5-15 0,1-10 0 ,002-0,05 0,1-0,7 0 ,002-0,05 0 ,002-0,05

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass geradkettige aliphatische Kohlenwasserstoffe verwendet werden» die vorwiegend aus geradkettigen C₁₁- bis C,Q-Paraffinen bestehen«.

8· Erzeugnis von hohem Proteingehalt /on mehr als 50 # und einem Index an lebenswichtigen Aminosäuren von mehr als 45» dadurch gekennzeichnet, dass es aus eiriom Gemisch von mindestens zwei lebensunfähigen Mikroorganismen d&i* Gattungen

Pseudomonas ligustri (A.TcC₀Cc Nr. 15522)» Pseudomonas pseudomallei (A.I.CO. Nr· 15523)» Pseudomonas orvilla (A.T.C.C. Nr. 15524)» AIcaligenes sp. (A₀T.C.C, Nr. 15525)» Cellumonas galba (A.T.CC. Nr. 15536), Brevibaeterium insectiphilium (A₀T.C.C. Nr, 15528)» Corynebaoterium sp. (A.1.CoC₀ Nr* 15529) und Corynebaoterium pourometabolum (Ac^f'?.C₀Co Nr. 15530)

besteht. *■ --

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