DE2003652C3

DE2003652C3 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von CelluJase

Info

Publication number: DE2003652C3
Application number: DE2003652A
Authority: DE
Inventors: Masanobu Tokio Kawai
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-02-03
Filing date: 1970-01-28
Publication date: 1974-08-15
Also published as: US3677899A; FR2037059A1; DE2003652B2; DE2003652A1; GB1278195A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel- nicht aus einem einzigen Enzym, sondern aus einem

lung von Cellulase durch aerobes Züchten eines Mi- Komplex verschiedener Enzyme besteht. Nach

kroorganismus in einem hierfür geeigneten Nährme- Reeds (E. T. Reeds: Applied Microbiology, 1956,

dium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert- Bd. 4, S. 39) kann das durch folgende Gleichung ge-

Verhältnissen. Man hat behauptet, daß Cellulase 15 zeigt werden:

Natürl. CeHuose -^ίΓ?^!⁷¹^ n-Glucan (gebunden in ß-l, 4-Stellung)

C_t-Enzym (CMC-ase)

Cellobiose Cellobiase,
/i-Glukosidase

Glukose

Das Cj-Enzym der Cellulose ist jedoch das praktisch allein wirksame, so daß man sie zur teilweisen Zersetzung der Cellulosestruktur verwendet. So wird Cellulase beispielsweise eingesetzt, um die Oberfläche bzw. Umhüllung von Bohnen und Getreidekörnern, die als Futtermittel verwendet werden, zu zerstören, um die Verdaulichkeit zu verbessern, oder auch um Stärke aus Sojabohnen oder Mais extrahieren zu können. Je. höher die C_rAktivität der Cellulase ist, um so besser ist sie für die genannten Zwecke geeignet.

Für die Herstellung von Cellulase nach dem eingangs genannten Verfahren ist der Einsatz folgender Mikroorganismen bekannt: Fomitopsis (Fomes) annosa (vgl. »Chemical Abstractss Vol. 66, 1967, Ref. 9937 v); Fomitopsis (Fomes) pinicola (vgl. »Chemical Abstracts«, Vol.66, 1967, Ref. 9938c); Oxyporus populinus (Schum. ex Fr.) Donk (vgl. deutsche Auslegeschrift 1243618); Trichoderma viride (vgl. deutsche Auslegeschrift 1233 358); Aspergillus niger TPR-3801 (vgl. schweizerische Patentschrift 444 097); Trametes sanguinea ATCC 14622 und Trametes cinnabarina ATCC 14623 (vgl. britische Patentschrift 1 084 265); Trichoderma viride ATCC 16 325 und Penicillium variable ATCC 16 340 (vgl. USA.-Patentschrift 3 398 055); Trametes suaveolens (vgl. USA.-Patentschrift S 310 476); Trichoderma koningii IMI 73 022 (vgl. »Biochemical Journal«, Vol. 109, 1968, S. 217 bis 227).

Demgegenüber besteht die Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung- von Cellulase der eingangs genannten Art, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 einsetzt.

Dieser Stamm kann in einem festen oder flüssigen Nährmedium gezüchtet werden, letzteres ist jedoch vorzuziehen. In dem Nährmedium können als C-Quelle Saccharose, Glukose, Maltose, Laktose, Stärke, Dextrin, Melasse, Cellulosepulver, aufsaugende Baumwolle u. dgl. sowie als N-Quelle anorganische und organische stickstoffhaltige Materialien, wie Ammoniumsalze, Nitrate, Peptone, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Sojabohneneiweiß, Weizenmehl, Hefezellen, lösliche Destillate, Harnstoff u. dgl. verwendet werden. Falls erwünscht, können auch anorganische Substanzen und Metallsalze, wie Phos-

phate, Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Eisensalze, Zinksalze u. dgl. verwendet werden. Ferner können Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren u. dgl. zugesetzt werden. Vorzugsweise beträgt die Zuchttemperatur 20 bis 35° C und liegt derpH-Wert desNähr-

mediums zwischen 4 und 7. Die Anhäufung an Cellulase erreicht ihr Maximum nach fünf- bis zehntägigem Züchten. Die beim Züchten erhaltene Cellulase kann gewonnen werden durch Zufügen von 50 bis 65 Volumprozent eines organischen Lösungsmittels,

wie Aceton, Alkohol od. dgl., oder 40 bis 70 Volumprozent eines Fällungsmittels, wie Ammoniumsulfat, Calciumchlorid od. dgl., und zwar im Falle der Züchtung auf einem festen Nährmedium zu einem wäßrigen Extrakt der Kultur und im Falle der Flüssig-

keitszüchtung zu einem Filtrat der Zuchtbrühe. Das Konzentrat kann leicht durch bekannte Methoden, wie Adsorption an einem Ionenaustauscherharz und Eluierung, gereinigt werden. Die auf diese Weise gewonnene Cellulase ist im Wasser löslich und hat nicht nur eine starke C_rAktivität, sondern auch eine starke CMC-ase-Aktivität. Ferner ist das pH-Optimum niedriger als das irgendeiner der bekannten Cellulasen. Die günstigste Temperatur für die Cellulase-Aktivität ist 40 bis 50° C.

Im folgenden werden die Erfindung und der durch sie erzielte Fortschritt weiter erläutert, wobei die angegebenen Werte für die C_rAktivität und die CMC-ase-Aktivität auf nachfolgende Weise bestimmt wurden:

Zur Bestimmung der Cj-Aktivität wurden zwei Filterpapiere von je 1 · 1 cm bei einer Temperatur von 40° C mit einer Mischung aus 1 ml der Enzymlösung, deren C,-Aktivität zu bestimmen war, und aus 4 ml einer Zitronensäure-Pufferlösung, deren pH auf ein für das jeweilige Enzym optimalen Wert eingestellt wurde, zur Reaktion gebracht. Die ^-Aktivität ist die Zeit, innerhalb der die Filterpapiere vollständig zersetzt werden.

Die CMC-ase-Aktivität wurde entweder durch Ermittlung der Aktivität infolge Verflüssigung von CMC-Gel oder durch Ermittlung der CMC-Zersetzungsaktivität (Gj-Aktivität) bestimmt. Zur Bestimmung der Aktivität infolge Verflüssigung von CMC-

Gel wurden in ein Teströhrchen etwa 10 ml eines CMC-Gels eingebracht, welches aus einer 4% Na-CMC enthaltenden Zitronensäure-Pufferlösung bestand, deren pH auf ein für das jeweilige Enzym optimalen Wert eingestellt wurde. Die Abmessungen des Teströhrchens waren so gewählt, daß das CMC-Gel eine Säule von 58 mm Höhe bildete. Auf die CMC-Gelsäule wurde 1 ml der zu untersuchenden Enzymlösung aufgegeben, worauf man die Enzymlösung bei 30° C 24 Stunden lang mit dem CMC-Gel reagieren ließ. Die CMC-ase-Aktivität ist in diesem Fall die Länge der verflüssigten CMC-Gelschicht. Zur Bestimmung der C_x-Aktivität wurden 4 ml einer 0,62 % Na-CMC enthaltenden Zitronensäure-Pufferlösung, deren pH auf ein für das jeweilige Enzym optimalen Wert eingestellt wurde, und 1 ml der zu untersuchenden Enzymlösung bei 45° C für 1 Stunde miteinander zur Reaktion gebracht. Die Menge des dabei gebildetta Zuckers (Glukose), welche nach der sogenannten Nelson-Somogi-Methode (vgl. »J. Biol. ao Chem.«, Vol. 160/1945, S. 61 bis 68 sowie Vol. 195/ 1952, S. 19 bis 23) ermittelt wurde, ist ein Maß für die C_t-Aktivität.

Der durch das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber den aus der schweizerischen Patentschrift 444 097 und USA.-Patentschrift 3 310 476 bekannten Verfahren erreichte Vorteil besteht darin, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren die Gewinnung der Cellulase durch Ausfällung aus der filtrierten Gärbrühe möglich ist, während bei den beiden obengenannten bekannten Verfahren die Cellulase erst nach Extraktion aus den Zellen ausgefällt werden kann.

Gemäß Beispiel 3 der deutschen Auslegeschrift 1 243 618 werden 500 mg Filterpapier durch das auf das Fünffache des ursprünglichen Volumens konzentrierte Kulturnitrat von Oxyporus populinus (Schum. ex Fr) Donk in 48 Stunden nur zu 41,4 % abgebaut, während das Kulturfiltrat des Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 gemäß dem vorliegenden Beispiel ohne Konzentrierung das eingesetzte Filterpapier bereits in nur 105 Minuten vollständig löst. Obgleich zwar die eingesetzten Filterpapiere nicht identisch sein dürften, so spricht doch die obige Gegenüberstellung deutlich zugunsten des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1

	Ci	CMC-ase
ATCC 20 195	105	50
ATCC 20 194	180	35
ATCC 20 036	180	50

45

30 ml eines Nährmediums aus 2 % Saccharose, l°/o Cellulosepulver, 3 Vo löslichen Destillaten, 0,3% Hefeextrakt, 0,5% KH₂PO₄ und 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O wurden auf ein pH von 5,5 eingestellt, in einen 250-ml-Kolben eingefüllt und sterilisiert. Teile dieses Nährmediums wurden getrennt mit Lampteromyces japonicus ATCC 20 195, Fomitopsis annosa ATCC 20194 und Fomitopsis pinicola ATCC 20 036 beimpft. Danach wurde 7 Tage lang unter Schütteln bei 30° C gezüchtet. Die C_rAktivitäten (in Minuten) und die durch Verflüssigung von CMC-Gel bestimmten CMC-ase-Aktivitäten (in mm) pro ml der nitrierten Zuchtbrühen sind in der folgenden Übersicht angegeben:

65 Diese Ergebnisse zeigen unmittelbar, daß die erfindungsgemäß hergestellte Cellulase besser ist als die Cellulase, welche nach »Chemical Abstracts«, Vol. 66, 1967, Ref. 9937ν und 9938c, gewonnen werden hann, wo der Einsatz eines beliebigen Stammes von Fomitopsis (Fomes) annosa und Fomitopsis (Fomes) pinicola zum Erfolg führen soll.

Beispiel 2

Weizenkleie, Reiskleie, Sojabohnenmehl und lösliche Destillate wurden im Verhältnis 10:1:1:1 vermischt, gut mit Wasser angefeuchtet und sterilisiert, um ein festes Nährmedium zu erhalten, welches mit dem zuvor in flüssigem Medium gezüchteten Lampteromyces japonicus ATCC 20195 beimpft und dann 10 Tage lang bei 25° C gezüchtet wurde. Nach dem Züchten wurde das Kulturmedium fein zerteilt und 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur mit der fünffachen Volumenmenge Wasser extrahiert. Die C₁-Aktivität betrug pro ml des Extraktes 150 Minuten.

Beispiel 3

3000 ml eines Nährmediums aus 2°/o Saccharose, 1 % Sojpbohnenmehl, 3% löslichen Destillaten, 0,3% Hefeextrakt, 0,5 % KH₂PO₄ und 0,05 % MgSO₄ · 7 H₂O wurden auf ein pH von 5,5 eingestellt. Das Nährmedium wurde mit Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 beimpft. Danach wurde 5 Tage lang unter Rühren aerob bei 30" C gezüchtet. Das Filtrat der Gärbrühe wurde auf 0° C abgekühlt, worauf 65 Volumprozent Aceton zugefügt wurde, welches vorher auf — 20° C heruntergekühlt worden war. Der erhaltene Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet; es ergaben sich 27 g eines kräftigbraunen Pulvers. Die ^-Aktivität betrug pro g des Pulvers 95 Minuten.

Vergleichsversuch I

Jeweils 30 ml eines auf ein pH von 4,5 eingestellten Nährmediums I aus 2% Saccharose, 1% Sojabohnenmehl, 3% löslichen Destillaten, 0,3% Hefeextrakt, 0,1% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄-7 H₂O und eines Nährmediums II, wie es im Beispiel 1 der deutschen Auslegeschrift 1 233 358 angegeben ist, wurden jeweils getrennt in einen Erlenmeyerkolben eingegeben und sterilisiert. Jedes der beiden Nährmedien wurde jeweils getrennt mit Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 und Trichoderma viride ATCC 16 325 geimpft. Anschließend erfolgte fünftägige Züchtung bei 30° C in einem Drehschüttler (250 U/min). Nach der Züchtung wurden die mikrowellen Teile aus der Zuchtbrühe abgefiltert. Die C,-Aktivität pro ml des jeweiligen Filtrats ist in der nachfolgenden Übersicht in Minuten wiedergegeben, während das Symbol + einen 25prozentigen Zerfall nach 5 Stunden Reaktionszeit angibt:

ATCC 20 195
ATCC 16 325

90

II

110

Das Ergebnis dieses Vergleichsversuches zeigt die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem aus der deutschen Auslegeschrift 1 233 358 (Beispiel 1) bekannten Verfahren.

Vergleichsversuch II

Nährmedien und Mikroorganismen der nachstehend aufgeführten Art wurden in der Weise verwendet, daß 30 ml jedes Nährmediums auf ein für den eingeimpften Stamm geeignetes pH eingestellt, das Nährmedium dann in einen 250 ml Erlenineyerkolben eingebracht und sterilisiert, der Stamm eingeimpft und anschließend durch Schütteln mittels eines Drehschüttlers (250 U/min) bei 28° C gezüchtet wurde.

Verwendete Mikroorganismen: Lampteromyces japonicus ATCC 20 195, Trametes sangiunea ATCC 14 622, Trametes cinnabarina ATCC 14 623, Trichoderma viride ATCC 16 325, Penicillium variable ATCC 16340, Trichoderma koningii IMI 73022.

Verwendete Nährmedien: Nährmedium A gemäß dem vorstehenden Beispiel 1, bestehend aus 2 % Saccharose, 1 % Sojabohnenmehl, 3 % lösliche Destillate, 0,3% Hefeextrakt, 0,1 °/o KH₂PO₄, 0,02 % MgSO₄-7H₂O.

Nährmedium B gemäß britische Patentschrift 1 084 265, Beispiel 1, bestehend aus 4°/o Saccharose, 2°/o Glukose, 3°/o Sojabohnenmehl, 1 % Maiswasser, 0,2 o/o (NHJ₂SO₄, 0,2% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄-7H₂O, 0,05% CuSO₄ · 5H₂O.

Nährmedium C in etwa gemäß USA.-Patentschrift 3 398 055, bestehend aus 0,1 % Laktose, 1% kristalline Cellulose, 1,5% Maishülsen, 0,03% Harnstoff (getrennt sterilisiert), 0,4% (NH₄)_OHPO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,03 % MgSO₄ · 7 H₂O.

Der pH-Wert des Nährmediums wurde für ATCC 20 195 auf 4,5, für ATCC 14 622 und ATCC 14 623 auf 6,0, für ATCC 16 325, ATCC 16 340 und IMI 73 022 auf 5,0 eingestellt.

Nach einer Zuchtdauer von 3,4 bzw. 5 Tagen wurden die mikrobiellen Teile durch Filtration von der Züchtbrühe abgetrennt. Für jedes der so erhaltenen Filtrate wurde dann die Cj-Aktivität und die C^-Aktivität bestimmt, letztere jeweils unter Verwendung von 1 ml des um das Zehnfache verdünnten Filtrats. In Tabelle 1 sind die pH-Werte der Reaktionslösungen angegeben. Tabelle 2 gibt die C₁-Aktivitäten wieder, wobei die Zahlenwerte die Zeit in Minuten, in welcher die Filterpapiere zersetzt wurden, und bei unvollständiger Zersetzung die Symbole +, + +, + + + angeben, ob die Filterpapiere nach jeweils fünfstündiger Reaktion zu ¹A bzw. Vz bzw. ³Λ zersetzt waren. Tabelle 3 gibt die Ergebnisse für die C_x-Aktivitäten wieder. Die Werte der Tabellen 2 und 3 geben jeweils den günstigsten Wert wieder, der für einen Mikroorganismus aus den nach 3,4 oder 5 Tagen gezüchteten Zuchtbrühen gewonnen wurde.

Tabelle 1
pH-Wert der Reaktionslösungen

ATCC 20 195
ATCC 14 622
ATCC 14 623
ATCC 16 325
ATCC 16 340
IMI 73 022 ..

2,5 4.0 4,0 5,0 5,0 5,0

Tabelle 2
Cj-Aktivität

25

30

Tabelle 3

Cj-Aktivität

3,0 4,5 4,5 5,0 5,0 5,0

Nährmedium	A	90	B	C
ATCC 20 195	+ + +	240	+ + +
ATCC 14 622	+ +	-f- -f	120
ATCC 14 623	-f	-f-	130
ATCC 16 325	+	4- -(-	180
ATCC 16 340	+		-f -j-
IMI 73 022	+ +	+ +

Nährmedium	A	B	C
ATCC 20 195	1060 800	210 2600	1200 2450
ATCC 14 622	1270	1100	4120
ATCC 14 623	200 350 150	110 230 140	2165 500 125
ATCC 16 325 . .
ATCC 16 340 .
IMI 73 022

Wie die vorstehend genannten Ergebnisse zeigen, ist das erfindungsgemäße Verfahren den aus der britischen Patentschrift 1 084 265, USA.-Patentschrifl 3 398 055 sowie aus »Biochemical Journal«, Vol. 109, 1968, S. 217 bis 227, bekannten Verfahren weit überlegen, da die durch Verwendung von Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 erhaltene Cellulase die stärkste Cj-Aktivität besitzt.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Cellulase durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem hierfür geeigneten Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 einsetzt.