DE2003652B2

DE2003652B2 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Cellulase

Info

Publication number: DE2003652B2
Application number: DE2003652A
Authority: DE
Inventors: Masanobu Tokio Kawai
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-02-03
Filing date: 1970-01-28
Publication date: 1974-01-24
Also published as: DE2003652C3; US3677899A; FR2037059A1; GB1278195A; DE2003652A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel- nicht aus einem einzigen Enzym, sondern ais einem

lung von Cellulase durch aerobes Züchten eines Ma- Komplex verschiedener Enzyme besteht. Nach

kroorganismus in einem hierfür geeigneten Nährme- Reeds (E. T. Reeds: Applied Microbiology, 1956,

dium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wen- Bd. 4, S. 39) kann das durch folgende Gleichung ge-

Verhälinissen. Man hat behauptet, daß Cellulase 15 zeigt werden:

Natürl. Celluose -^A'^?.™ + u-Glucan (gebunden in ß-1, 4-Stellung)

Cr-Enzym (CMC-ase)

Cellobiose Cellobiase,
/i-GIukosidase

Glukose

Das Cj-Enzym der Cellulose ist jedoch das praktisch allein wirksame, so daß man sie zur teilweisen Zersetzung der Cellulosestruktur verwendet. So wird Cellulase beispielsweise eingesetzt, um die Oberfläche bzw. Umhüllung von Bohnen und Getreidekörnern, die als Futtermittel verwendet werden, zu zerstören, um die Verdaulichkeit zu verbessern, oder auch um Stärke aus Sojabohnen oder Mais extrahieren zu können. Je höher die ^-Aktivität der Cellulase ist, um so bessei ist sie für die genannten Zwecke geeignet.

Für die Herstellung von Cellulase nach dem eingangs genannten Verfahren ist der Einsatz folgender Mikroorganismen bekannt: Fomitopsis (Fomes) annosa (vgl. »Chemical Abstracts«, Vol. 66, 1967, Ref. 9937 v); Fomitopsis (Fomes) pinicola (vgl. »Chemical Abstracts«, Vol.66, 1967, Ref. 9938c); Oxyporus populinus (Schum. ex Fr.) Donk (vgl. deutsche Auslegeschrift 1243618); Trichoderma viride (vgl. deutsche Auslegeschrift 1233 358); Aspergillus niger TPR-3801 (vgl. schweizerische Patentschrift 444 097); Trametes sanguinea ATCC 14622 und Trametes cinnabaüna ATCC 14623 (vgl. britische Patentschrift 1 084 265); Trichoderma viride ATCC 16325 und Penicillium variable ATCC 16340 (vgl. USA.-Patentschrift 3 398 055); Trametes suaveolens (vgl. USA.-Patentschrift 3 310 476); Trichoderma koningii IMI 73 022 (vgl. »Biochemical Journal«, Vol. 109,1968, S. 217 bis 227).

Demgegenüber besteht die Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung von Cellulase der eingangs genannten Art, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 einsetzt.

Dieser Stamm kann in einem festen oder flüssigen Nährmedium gezüchtet werden, letzteres ist jedoch vorzuziehen. In dem Nährmedium können als C-Quelle Saccharose, Glukose, Maltose, Laktose, Stärke, Dextrin, Melasse, Cellulosepulver, aufsaugende Baumwolle u. dgl. sowie als N-Quelle anorganische und organische stickstoffhaltige Materialien, wie Ammoniumsalze, Nitrate, Peptone, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Sojabohneneiweiß, Weizenmehl, Hefezellen, lösliche Destillate, Harnstoff u. dgl. verwendet werden. Falls erwünscht, können auch anorganische Substanzen und Metallsalze, wie Phosphate, Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Eisensalze, Zinksalze u. dgl. verwendet werden. Ferner können Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren u. dgl. zugesetzt werden. Vorzugsweise beträgt die Zuchttemperatur 20 bis 35° C und liegt derpH-Wert desNährmediums zwischen 4 und 7. Die Anhäufung an Cellulase erreicht ihr Maximum nach fünf- bis zehntägigem Züchten. Die beim Züchten erhaltene Cellulase kann gewonnen werden durch Zufügen von 50 bis 65 Volumprozent eines organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Alkohol od. dgl., oder 40 bis 70 Volumprozent eines Fällungsmittels, wie Ammoniumsulfat, Calciumchlorid od. dgl., und zwar im Falle der Züchtung auf einem festen Nährmsdium zu einem wäßrigen Extrakt der Kultur und im Falle der Flüssigkeitszüchtung zu einem Filtrat der Zuchtbrühe. Das Konzentrat kann leicht durch bekannte Methoden, wie Adsorption an einem Ionenaustauscherharz und Eluierung, gereinigt werden. Die auf diese Weise gewonnene Cellulase ist im Wasser löslich und hat nicht nur eine starke Cj-Aktivität, sondern auch eine starke CMC-ase-Aktivität. Ferner ist das pH-Optimum niedriger als das irgendeiner der bekannten Cellulasen. Die günstigste Temperatur für die Cellulase-Aktivität ist 40 bis 50° C.

Im folgenden werden die Erfindung und der durch sie erzielte Fortschritt weiter erläutert, wobei die angegebenen Werte für die ^-Aktivität und die CMC-ase-Aktivität auf nachfolgende Weise bestimmt wurden:

Zur Bestimmung der Cj-Aktivität wurden zwei Filterpapiere von je 1 · 1 cm bei einer Temperatur von 40° C mit einer Mischung aus 1 ml der Enzymlösung, deren Cj-Aktivität zu bestimmen war, und aus 4 ml einer Zitronensäure-Pufferlösung, deren pH auf ein für das jeweilige Enzym optimalen Wert eingestellt wurde, zur Reaktion gebracht. Die C₁-AkU-vität ist die Zeit, innerhalb der die Filterpapiere vollständig zersetzt werden.

Die CMC-ase-Aktivität wurde entweder durch Ermittlung der Aktivität infolge Verflüssigung von CMC-Gel oder durch Ermittlung der CMC-Zersetzungsaktivität (C_x-Aktivität) bestimmt. Zur Bestimmung der Aktivität infolge Verflüssigung von CMC-

Gel wurden in ein Teströhrchen etwa 10 ml eines CNiC-GeIs eingebracht, welches aus einer 4% Na-CMC enthaltenden Zitronensäure-Pufferlösung bestand, deren pH auf ein für das jeweilige Eiuym optimalen Wert eingestellt wurde. Die Abmessungen des Teströhrchens waren so gewählt, daß das CMC-Gel eine Säule von 58 mm Höhe bildete. Auf die CMC-GeMuIe wurde 1 ml der zu untersuchenden Enzymlösung aufgegeben, worauf man die Enzymlösung bei 30° C 24 Stunden lang mit dem CMC-Gel reagieren ließ. Die CMC-ase-Aktivität ist in diesem Fall die Länge der verflüssigten CMC-Gelschicht. Zur Bestimmung der C_A.-Aktivität wurden 4 ml einer 0,62% Na-CMC enthaltenden Zitronensäure-Pufferlösung, deren pH auf ein für das jeweilige Enzym optimalen Wert eingestellt wurde, und 1 ml der zu untersuchenden Enzymlösung bei 45° C für 1 Stunde miteinander zur Reaktion gebracht. Die Menge des dabei gebildeten Zuckers (Glukose), welche nach der sogenannten Nelson-Somogi-Methode (vgl. »J. Biol. Chem.«, Vol. 160/1945, S. 61 bis 68 sowie Vol. 195/ 1952, S. 19 bis 23) ermittelt wurde, ist ein Maß für die C_v-Aktivität.

Der durch das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber den aus der schweizerischen Patentschrift 444 097 und USA.-Patentschrift 3 310 476 bekannten Verfahren erreichte Vorteil besteht darin, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren die Gewinnung der Cellulase durch Ausfällung aus der nitrierten Gärbrühe möglich ist, während bei den beiden obengenannten bekannten Verfahren die Cellulase erst nach Extraktion aus den Zellen ausgefällt werden kann.

Gemäß Beispiel 3 der deutschen Auslegeschrift 1 243 618 werden 500 mg Filterpapier durch das auf das Fünffache des ursprünglichen Volumens konzentrierte Kulturfiltrat von Oxyporus populinus (Schum. ex Fr) Donk in 48 Stunden nur zu 41,4"/O abgebaut, während das Kulturfiltrat des Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 gemäß dem vorliegenden Beispie! ohne Konzentrierung das eingesetzte Filterpapier bereits in nur 105 Minuten vollständig löst. Obgleich zwar die eingesetzten Filterpapiere nicht identisch sein dürften, so spricht doch die obige Gegenüberstellung deutlich zugunsten des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1

30 ml eines Nährmediums aus 2%> Saccharose, 1 % Cellulosepulver, 3 % löslichen Destillaten, 0,3 % Hefeextrakt, 0,5% KH₂PO₄ und 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O wurden auf ein pH von 5,5 eingestellt, in einen 250-ml-Kolben eingefüllt und sterilisiert. Teile dieses Nährmediums wurden getrennt mit Lampteromyces japonicus ATCC 20 195, Fomitopsis annosa ATCC 20 194 und Fomitopsis pinicola ATCC 20 036 beimpft. Danach wurde 7 Tage lang unter Schütteln bei 30° C gezüchtet. Die ^-Aktivitäten (in Minuten) und die durch Verflüssigung von CMC-Gel bestimmten CMC-ase-Aktivitäten (in mm) pro ml der filtrierten Zuchtbrühen sind in der folgenden Übersicht angegeben:

	C₁	CMC-ase
ATCC 20 195	105	50
ATCC 20 194	180	35
ATCC 20 036	180	50

Diese Ergebnisse zeigen unmittelbar, daß die erfindungsgemäß hergestellte Cellulase besser ist als die Cellulase, welche nach »Chemical Abstracts«, Vol. 66, 1967, Ref. 9937 ν und 9938 c, gewonnen werden ':aun, wo der Einsatz eines beliebigen Stammes von Fomitopsis (Fomes) annosa und Fomitopsis (Fomes) pinicola zum Erfolg führen soll.

Beispiel 2

ίο Weizenkleie, Reiskleie, Sojabohnenmehl und lösliche Destillate wurden im Verhältnis 10:1:1:1 vermischt, gut mit Wasser angefeuchtet und sterilisiert, um ein festes Nährmedium zu erhalten, welches mit dem zuvor in flüssigem Medium gezüchteten

t5 Lampteromyces japonicus ATCC 20195 beimpft und dann 10 Tage lang bei 25° C gezüchtet wurde. Nach dem Züchten wurde das Kulturmedium fein zerteilt und 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur mit der fünffachen Volumenraeuge Wasser extrahiert. Die

ao Cj-Aktivität betrug pro ml des Extraktes 150 Minuten.

Beispiel 3

3000 ml eines Nährmediums aus 2% Saccharose, 1 % Sojabohnenmehl, 3 % löslichen Destillaten, 0,3 % Hefeextrakt, 0,5 % KH₂PO₄ und 0,05 % MgSO₄ · 7 H₂O wurden auf ein pH von 5,5 eingestellt. Das Nährmedium wurde mit Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 beimpft. Danach wurde 5 Tage lang unter Rühren aerob bei 30° C gezüchtet. Das Filtrat der Gärbrühe wurde auf 0° C abgekühlt, worauf 65 Volumprozent Aceton zugefügt wurde, welches vorher auf —20° C heruntergekühlt worden war. Der erhaltene Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet; es ergaben sich 27 g eines kräftigbraunen Pulvers. Die C.-Aktivität betrug pro g des Pulvers 95 Minuten.

Vergleichsversuch I

Jeweils 30 ml eines auf ein pH von 4,5 eingestellten Nährmediums I aus 2 % Saccharose, 1 % Sojabohnenmehl, 3% löslichen Destillaten, 0,3% Hefeextrakt, 0,1% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄-7H₂O und eines Nährmediums II, wie es im Beispiel 1 der deutsehen Auslegeschrift 1 233 358 angegeben ist, wurden jeweils getrennt in einen Erlenmeyerkolben eingegeben und sterilisiert. Jedes der beiden Nährmedien wurde jeweils getrennt mit Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 und Trichoderma viride ATCC 16 325 geimpft. Anschließend erfolgte fünftägige Züchtung bei 30° C in einem Drehschüttler (250 U/min). Nach der Züchtung wurden die mikrowellen Teile aus der Zuchtbrühe abgefiltert. Die Cj-Aktivität pro ml des jeweiligen Filtrats ist in der nachfolgenden Übersicht in Minuten wiedergegeben, während das Symbol + einen 25prozentigen Zerfall nach 5 Stunden Reaktionszeit angibt:

60	ATCC 20 195	I	TI
ATCC 16 325	90 +	+ 110

6s Das Ergebnis dieses Vergleichsversuches zeigt die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem aus der deutschen Auslegeschrift 1 233 358 (Beispiel 1) bekannten Verfahren.

Vergleichsversuch II

Nährmedien und Mikroorganismen der nachstehend aufgeführten Art wurden in der Weise verwendet, daß 30 ml jedes Nährmediums auf ein für den eingeimpften Stamm geeignetes pH eingestellt, das Nährmedium dann in einen 250 ml Erlenmeyerkolben eingebracht und sterilisiert, der Stamm eingeimpft und anschließend durch Schütteln mittels eines Drehschüttlers (250 U/min) bei 28° C gezüchtet wurde.

Verwendete Mikroorganismen: Lampteromyces japonicus ATCC 20 195, Trametes sangiunea ATCC 14 622, Trametes cinnabarina ATCC 14 623. Trichoderma viride ATCC 16 325, Penicillium variable ATCC 16340, Trichoderma koningii IMT 73022.

Verwendete Nährmedien: Nährmedium A gemäß dem vorstehenden Beispiel 1, bestehend aus 2 ⁰Z₀ Saccharose, 1 «/o Sojabohnenmehl, 3 % lösliche Destillate, 0,3Vo Hefeextrakt, 0,]% ΚΗ.,ΡΟ., 0,02 V» MgSO, · 7H,O.

Nährmedium B gemäß britische Patentschrift 1 084 265, Beispiel 1, bestehend aus 4 ⁰Zo Saccharose, 2°/o Glukose, 3Vo Sojabohnenmehl, 1% Maiswasser, 0,2Vo (NH₄).,SO₄, 0,2 Vo KR₁PO₄, 0,1Vo MgSO₄-7 H₂O, 0,05 Vo CuSO₄ · 5 H₂O. "

Nährmedium C in etwa gemäß USA.-Patentschrift 3 398 055, bestehend aus 0,1 Vo Laktose, 1 Vo kristalline Cellulose, 1,5% Maishülsen, 0,03Vo Harnstoff (getrennt sterilisiert), 0,4% (NHJ₀HPO., 0,1% KH₂PO₄, 0,03 Vo MgSO₄ · 7 H₂O.

D~er pH-Wert des Nährmediums wurde für ATCC 20 195 auf 4,5, für ATCC 14 622 und ATCC 14 623 auf 6,0, für ATCC 16 325, ATCC 16 340 und IMT 73 022 auf 5,0 eingestellt.

Nach einer Zuchtdauer von 3,4 bzw. 5 Tagen wurden die mikrowellen Teile durch Filtration von der Zuchtbrühe abgetrennt. Für jedes der so erhaltenen Filtrate wurde dann die C_?-Aktivität und die C_x-Aktivität bestimmt, letztere jeweils unter Verwendung von 1 ml des um das Zehnfache verdünnten Filtrats. In Tabelle 1 sind die pH-Werte der Reaktionslösungen angegeben. Tabelle 2 gibt die C_rAktivitäten wieder, wobei die Zahlenwerte die Zeit in Minuten, in welcher die Filterpapiere zersetzt wurden, und bei unvollständiger Zersetzung die Symbole +, + +, + + + angeben, ob die Filterpapiere nach jeweils fünfstündiger Reaktion zu ¹Ai bzw. ^xn bzw. ³A zersetzt waren. Tabelle 3 gibt die Ergebnisse für die C_x-Aktivitäten wieder. Die Werte der Tabellen 2 und 3 geben jeweils den günstigsten Wert wieder, der für einen Mikroorganismus aus den nach 3,4 oder 5 Tagen gezüchteten Zuchtbrühen gewonnen wurde.

Tabelle 1
pH-Wert der Reaktionslösungen

	C₁	3,0 4,5 4,5 5,0
ATCC ^O 195	2,5 4,0 4,0 5,0	5,0 5,0
ATCC 14 622	5,0 5,0
ATCC 14 623
ATCC 16 325
ATCC 16 340
IMI 73 022

Tabelle 2
C,-Aktivität

Nährmedium	A	90	B	C
ATCC 20 195	+ + +	240	+ + +
ATCC 14 622	+ +		120
ATCC 14 623		+	130
ATCC 16 325	-f-	-j- 4	180
ATCC 16 340	-t-		-I- -f
IMI 73 022	+ +	+ +

Tabelle 3
C_x-Aktivität

	Nährmedium	A	B	C
ATCC	20 195 .	1060	210	1200
ATCC	14 622	800	2600	2450
ATCC	14 623	1270	1100	4120
ATCC	16 325 .	200	110	2165
ATCC	16 340 .	350	230	500
IMI 73	022	150	140	125

Wie die vorstehend genannten Ergebnisse zeigen, ist das erfindungsgemäße Verfahren den aus der britischen Patentschrift 1 084 265, USA.-Patentschrift 3 398 055 sowie aus »Biochemical Journal«, Vol. 109, 1968, S. 217 bis 227, bekannten Verfahren weit überlegen, da die durch Verwendung von Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 erhaltene Cellulase die stärkste Cj-Aktivität besitzt.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Cellulase durcli aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem hierfür geeigneten Nährmediuin bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 einsetzt.