DE2557499A1

DE2557499A1 - Verfahren zur herstellung von cholestrin-oxidase

Info

Publication number: DE2557499A1
Application number: DE19752557499
Authority: DE
Inventors: Fumio Hirata; Taeko Kuratsu; Hiroshi Shimizu; Mamoru Sugiura; Masayasu Sugiyama
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-12-27
Filing date: 1975-12-19
Publication date: 1976-07-08
Also published as: GB1472680A; FR2296011A1; FR2296011B1; JPS552277B2; US4003794A; JPS5179781A

Description

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OUO PHAEMACEUTICAIfCO., LTD. Osaka/Japan

Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-oxidase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-oxidase auf mikrobiologischem, Wege.

Es ist bekannt, daß bestimmte Bakterien, beispielsweise Mycobacterium und Brevibacterium, oder Actinomyceten Cholesterinoxidase bilden. Jedoch haben diese Cholesterin-oxidasen den Nachteil, daß sie eine zu breite Substratspezifitat aufweisen. Es ist schwierig, durch Züchtung üblicher Mikroorganismen unter anschließender Extraktion und Reinigung ein Enzym zu erhalten, das ausschließlich die 3ß-Hydroxylgruppe von Cholesterin unter Oxidation zur Ketogruppe angreift. Insbesondere treten bei der großtechnischen Herstellung eines derartigen Enzyms verschiedene Probleme auf. Beispielsweise sind Enzyme aus Brevibacterium sterolicum nicht nur 'in bezug auf die 3ß-Stellung, sondern auch auf die 17ß-Stellung von Cholesterin aktiv, Diese Enzyme weisen eine sehr breite Substratspezifitat auf. Zu den Substraten

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gehören Cholesterin, Cholestanol, Dihydroergosterin, Stigmasterin, Testosteron, 5ö£-Androstan-3a,"I7ß-&iol und dergl. Die Substratspektren dieser Enzyme lassen sich nur durch verschiedene Reinigungsschritte auf ein spezifisches Substrat einengen.

Bei der praktischen Anwendung zur ChoIesterinbeStimmung an biologischem Material, wie Gewebe oder Serum, ist eine so breite Substrats-pezifität unerwünscht. * "

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Cholesterin-oxidase zur Verfügung zu stellen, die nur in der 3ß-S'tellung von Cholesterin angreift. .

Zur Lösung dieser Aufgabe wurden verschiedene Bakterien, wie Eumyceten und Basidiomyceten, untersucht. Es wurde erfindungs- - gemäß festgestellt, daß ein bisher unbekannter Stamm von Schizophyllum commune eine Cholesterin-oxidase von hoher Sübstratspezifität bildet.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-oxidase auf mikrobiologischem Wege, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Schizophyllum commune Ii¹O 4928 in einem ITährmedium züchtet und aus dem Gärmai schenfil tr at die 'Cholest'erinoxidase isoliert.

Der erfindungsgemäß .eingesetzte Stamm Schizophyllum-commune IPO 4928 hat die Fähigkeit,- Cholesterin-oxidase in einem Medium, das frei von Cholesterinen ist, zu bilden. Durch Zusatz von Cholesterinen zum.Hahrmedium wird die'Ausbeute an Cholesterin-oxidase nicht erhöht.

Das im erfindungsgemäßen "Verfahren eingesetzte Nahrmedium kann als Kohlenstoffq_uelle beispielsweise Glucose, Melassen, Abfall— melassen oder verschiedene Stärken, wie Maisstärke oder Kartoffelstärke, und als Stickstoffquelle beispielsweise Harnstoff, Hefeextrakt, Maltoseextrakt, Casein, Pepton, Maisquellflüssigkeit (CSL), Sojabohnenpulver oder entfettete Sojabohnen, enthalten.

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Ob ein Nährmedium zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, läßt sich leicht feststellen, indem man Schizophyllum commune IPO 4928 in verschiedenen Medien, die Cholesterin enthalten, züchtet und die Cholesterinabnahme und die Zunahme an 4-Cholesten-3-on im Nährmedium dünnschichtchromatographisch feststellt. Alle Medien, die beim vorgenannten Test sich als positiv erweisen, lassen sich im erfindungsgemäßen Verfahren verwenden. Bei Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen wird das erfindungsgemäße; Enzym nicht gebildet. Ein bevorzugtes Medium, in dem die gewünschte Cholesterin-oxidase in ausreichender Weise gebildet wird und das sich auch im großtechnischen Maßstab verwenden läßt, besteht aus Sojabohnenpulver und CSL. Jedoch ist die Erfindung nicht auf dieses Uährmedium beschränkt.

Im allgemeinen beträgt das Verhältnis von Kohlenstoffquelle zu Stickstoffquelle (σ/Ν) von 3:1 bis 5:1 (Glucose=C und Polypepton=N) bei Verwendung eines Glucose-Polypepton-Hefeextrakt-Mediums, 4:1 bis 4:2 (Sojabohnenpulver = C und CSL = ET) bei Verwendung eines · Sojabohnenpulver-CSL-Mediums und 1:3 (Sqjabohnenöl = C und entfettete Sojabohnen = IT) bei Verwendung eines Sojabohnenöl-entfettete Sojabohnen-Mediums. Bei Einsatz anderer Jiährmedien gelten ähnliche Verhältnis zahlen. ·■■ · - ■>■

Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise in einer Schüttelkultur, einem Fermenter oder dergl. durchgeführt werden. Schüttelkulturen werden im allgemeinen bei etwa 25 bis 30⁰C unter Atmosphärendruck 6 bis 7 Tage mit einer Schüttelfrequenz von I20 U/min durchgeführt. Bei Verwendung eines Fermenters wird im allgemeinen bei etwa 25-bis 30 C unter einem Druck der etwa eine halbe at über dem Atmosphärendruck liegt, mit einer Schüttel- bzw. Rührfrequenz von 0 bis 200 U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 WM (.Volumenteil Luft/Volumenteil Medium/min) 3 bis 5 Tage gezüchtet.

Die erfindungsgemäß vom Mikroorganismus gebildete Cholesterinoxidase befindet sich in der Gärlösung. Die"se Lösung-wird gewonnen und auf übliche Weise eingeengt und gereinigt,, beispiels-

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weise durch Fällung mit Ammoniumsulfat, Einstellung auf. den isoelektrischen Punkt, Fällung mit einem Lösungsmittel oder Behandlung mit einem Ionenaustauscher. Die Fällung mit Ammoniumsulfat erfolgt bei 55 prozentiger Sättigung, d.h. 351 g Ammoniumsulfat/Liter Enzymlösung bei 5°C. Zur Fällung durch Einstellung auf den isoelektrischen Punkt wird im allgemeinen ein pH-Bereich von 4,4 bis 4>5 angewendet. Als lösungsmittel zur Lösungsmittelfällung können beispielsweise. Äthanol, Isopropanol, Aceton oder dergl. verwendet werden. Beispielsweise erreicht man mit 50 Prozent (Yolumen/Volumen) Aceton eine vollständige Fällung des gewünschten Enzyms. Im allgemeinen werden als Ionenaustauscherharze Anionenaustauscherharze verwendet, z.B. Harze auf der.Basis von Dowex 1-X1 (ein bevorzugtes Beispiel ist Doulite A-101D), das stark basisch ist, zur Absorption von Pigmenten sowie DEAE-Cellulose, das schwach basisch ist, zur Adsorption und Elution des Enzyms. . ■

Man erhält das gewünschte Enzympräparat in hoher Ausbeute. Dieses Enzympräparat greift spezifisch die 3ß-Stellung von Cholesterin an und weist eine gute pH- und WärmeStabilität auf. ,

Untersuchungen der enzymatischen und. chemischen Eigens chaften.,.der erfindungsgemäß erhaltenen Choles'terin—oxidase haben gezeigt, daß das durch Ammoniumsulfatfällung, durch Einstellung auf den isoelektrischen Punkt oder durch Ionenaustauschbehandlung mit Dowex 1-X1 erhaltene Enzym ausgezeichnete Eigenschaften aufweist.

Die erfindungsgemäß erhaltene Cholesterin-oxidase weist folgende Eigenschaften auf:

(1) Wirkung und Substratspezifität ' Im Unterschied zu herkömmlichen Cholesterin-oxidasen aus Bakterien, z.-B. Actinomyceten, greift die erfindungsgemäße Cholesterinoxidase nur-die 3ß-Hydroxylgruppe von Choiesterinen an. Zersetzt man beispielsweise das bei der Dehydrierung der 3ß-Stellung freigesetzte Wasserstoffperoxid mit einer Peroxidase, bringt den dabei gebildeten Sauerstoff zur Bildung, eines Farbstoffs in Kontakt mit

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einer chromogenen Verbindung,- wie o-Tolidin, und mißt das Absorptionsspektrum des Produkts im. sichtbaren Bereich des Lichts, so ergibt sich bei der Durchführung dieses Tests mit verschiedenen Steroiden, daß die erfindungsgemäße Cholesterin-oxidase neben den Cholesterinen mit Sterinen reagiert, die eine Hydroxylgruppe in der 3ß-8tellung aufweisen, beispielsweise ß-Oytost.erin, 5-Pregnen-3ß-ol-20-on Dehydroepiandrosten, 5# -Cholestan-3ß-ol, Ergosterin, 7-Dehydrocholesterin, 16-Dehydropregnelon, 5a -Pregnan-3ß,20ß-diol, 5-Androstan-3ß,17ß-diol und 5-Androsten-3ß,17ßdiol. Jedoch reagiert die erfindungsgemäße Cholesterin-oxidase nicht mit Hydroxylgruppen von Sterinen in anderen Stellungen, d.h. sie reagiert spezifisch nur mit der 3ß-Hydroxylgruppe. Diese Eigenschaft erweist sich bei der Cholesterinbestimmung als sehr vorteilhaft, da die zu diesem Test verwendeten biologischen Proben im wesentlichen neben Cholesterin keine anderen Substanzen in merklichen Mengen enthalten.

Das erfindungsgemäße Enzym reagiert direkt mit Cholesterin ohne _t Eeaktion mit BAD (Nicotinamid-adenin-dinucleotid) unter Bildung von 4-Cholesten-3-on. Dies läßt sich durch einen Vergleich mit auf chemischem Wege synthetisiertem Material durch Elementaranalyse, IE, UV-, SiME- und Massenspelctroskopie und Dünnschicht-Chromatographie feststeilen. Jfcr- gg-^Bgrglish dar I2holfis^erin— Aktivität liegt beim erfindtrngBgBraaBen .Enzym J.m Y&x.gLals2h zn. herkömmlichen Cholesterin-oxidasen mehr im Sauren.

(2) pH-Optimum der Cholesterin-oxidase-Aktivität pH-Wert 4 bis 7

(3) pH-Stabilität der Choleeterin-oxidase-Aktivität pH-Wert 4 bis 9

(4) Wärmestabilität ' ·

Bis zu 50⁰C; rascher Aktivitätsverlust bei 6O⁰C und darüber.

(5) Bestimmung der enzymatischen Aktivität

Die enzymatische Aktivität wird bestimmt, indem man die spezifi- ' sehe. Absorption bei 245 rim von 4-Cholesten-3-on mißt, das durch Umsetzung der Enzymlösung mit dem Choleste/rinsubstrat gebildet wirdi.' · -

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(6) Quantitative Bestimmung von Serumcholesterin Eine Serumprobe wird mit einem Enzym vorbehandelt, das Cholesterinester zersetzt (beispielsweise mit lipoprotein-lipase aus Pseudomonas). Dadurch werden Cholesterinester in freies Cholesterin umgewandelt. Anschließend wird mit der erfindungsgemäßen Cholesterinoxidase umgesetzt. Diese Umsetzung wird bei 57°C in einem 0,4 m Phosphatpuffer-vom pH-Wert 5,2 durchgeführt. Die vorgenannte Vorbehandlung ist notwendig, da im Serum zwei Cholesterinformen, nämlich veresterte und freie Cholesterine, vorliegen und die Cholesterin-oxidase nur auf die freien Cholesterine wirkt. Das gebildete Wasserstoffperoxid wird mit einer Peroxidase versetzt. Der freigesetzte Sauerstoff wird von einer chromogenen Verbindung, z.B. o-Dianisidin aufgenommen. Durch Oxidation dieser. Verbindung wird gemäß folgender Gleichung ein Farbstoff gebildet.

H₃CO ■ OCH₃ · . H₃CO

peroxidase. \

) HN

o-Dianisidine ' \ Pigment

Die nach dieser quantitativen Bestimmung erhaltenen Werte für Serumcholesterin stimmen gut mit dem nach dem herkömmlichen Zak-Henly-Verfahren überein.

Die Beispiele-erläutern die Erfindung. Sofern nichts anderes angegeben wird, beziehen sich alle Teil-, Prozent*- und Verhältnisangaben auf das Gewicht. Es wird durchweg bei Atmosphärendruck in wäßrigen Systemen gearbeitet.

Beispiel 1 ' ·

50 Aliq^uotanteile, die Jeweils 100 ml einer Schüttelkultur von Schizophyllum commune Ii¹O 4928 enthalten, werden auf 100 Liter Fährlösung vom pH-Wert 5 bis 6 überimpft. Die Nährlösung enthält 1 Prozent Polypepton, 0,1 Prozent Hefeextrakt und 4 Prozent Glucose.

Der Anteil des Inokulums beträgt somit 5 Prozent (Vol./Vol.). Die Züchtung wird 4 Tage bei 29⁰C unter Schütteln mit einer Schüttelvorrichtung mit einer Frequenz von 120 U/min oder unter Rühren durch Einleiten von Luftblasen mit einer Geschwindigkeit von 1 VVM durchgeführt. Feste Bestandteile werden sodann aus der erhaltenen Gärmaische durch Filtration mit einer Filterpresse und durch Zentrifugation abgetrennt. Der FiItratüberstand wird bei 5°G bis zu einer 55 prozentigen Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt. Der Ammoniumsulfatniederschlag wird gegen I/IOO m Phosphorsäurepuffer vom pH-Wert 7,0, der 0,1 millimolar an EDTA ist, dialysiert. Das erhaltene Produkt wird bei etwa -20⁰C eingefroren und durch Eintauchen in Wasser von etwa 15°C 2 bis 3 Stunden aufgetaut. Der gebildete Niederschlag wird entfernt. Sodann wird bei etwa 5⁰C Ammoniumsulfat bis zur 60 prozentigen Sättigung zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wird gegen die vorgenannte Pufferlösung dialysiert. Nach dem Gefriertrocknen erhält man ein schwach bräunlich gefärbtes Enzym in Pulverform. Die Ausbeute beträgt 3000 bis 5000 Einheiten pro 100 Liter Gärmaische.

Beispiel 2 ·

Sofern nicht anders angegeben wird, verfährt man wie in Beispiel Schizophyllum commune IFO 4928 wird in" eine Nährlösung vom pH-Wert 4 bis 5 ub'erimpft. Diese Nährlösung enthält 3 Prozent Sojabohnen und 1 Prozent Maisquellflüssigkeit. Die Züchtung wird 4 Tage bei 29⁰C unter Schütteln oder unter Bewegen mit.Luft durchgeführt. Die'Gärmaische wird anschließend gemäß Beispiel 1 filtriert und aufgearbeitet.■ Man erhält 4000 bis 8000 Einheiten des Enzyms aus 100 Liter Gärmaische.

Beispiel 3

Sofern nicht anders angegeben wird, verfährt man wie in Beispiel. Schizophyllum commune IFO 4928 wird im gleichen Mengenverhältnis wie in Beispiel 1 in eine Gärlösung vom pH-Wert 4»5 überimpft. Die Gärlösung enthält 3 Prozent entfettete.Sojabohnen, 1 Prozent So-jabohnenöl und 0,25 Prozent 8 η NaOH. Man züchtet .4 bis 5 Tage, bei '26⁰C unter Schütteln oder Bewegen mit Luft. Feste Bestandteile werden .durch Filtrieren oder Zentrifugieren aus der Gär-

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maische entfernt. Der pH-Wert des Filtratüberstands wird mit Essigsäure auf den pH-Wert 4,4 "bis 4,5 eingestellt. Der gebildete Niederschlag wird' in Wasser suspendiert. Der pH-Wert der Suspension wird mit I¹IaOH auf 6 bis 7 eingestellt. Die Suspension wird anschließend eingefroren und wieder aufgetaut. Der gebildete Niederschlag wird entfernt. Der Überstand wird über Dowex 1-X1 {Cl-Typ) gegeben und Ammoniumsulfat wird bei ,etwa 5 C bis zur 60 prozentigen Sättigung zugesetzt. Dowex 1-X1 ist die Handelsbezeichnung für ein stark basisches Anionenaustauscherharz der Firma Dow Chemical Co., das als hauptsächliche Struktureinheiten Styrol- und Divinylbenzolgruppen enthält und quaternäre Ammoniumgruppen als ionenaustauschende Gruppen enthält. Das in eine Säule gepackte Dowex 1-X1 wird in d,ie Cl-Porm überführt und anschließend mit 1/50 m Phosphorsäure gewaschen. Über das so behandelte Ionenaustauscherharz,wird das Enzympräparat gegeben, wobei Fremdproteine adsorbiert werden. Der durch die Ammoniumsulfatfällung gebildete Niederschlag wird sodann gegen einen 1/1OO m Phosphorsäurepuffer vom pH-Wert 7,0 dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält wie in Beispiel 2 -aus 100 Liter Gärmaische 4OOO bis 8000 Einheiten..

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Claims

- 9 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Gholesterin-oxidase auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man Schizophyllum comaune IPO 4928 in einem Nährmedium. züchtet und aus dem Gärmaischenfiltrat die Cholesterin-oxidase isoliert.

2. Verfahren, nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einem pH-Wert von 4 bis 7 durchführt.

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