DE2758481A1

DE2758481A1 - Glucan und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2758481A1
Application number: DE19772758481
Authority: DE
Inventors: Akira Misaki; Shigeo Takaya; Yoichi Tsuburaya; Koji Yokobayashi
Original assignee: TEA EXPERIMENT; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: National Research Institute Of Vegetables Ornamen
Priority date: 1976-12-31
Filing date: 1977-12-28
Publication date: 1978-07-27
Also published as: US4202966A; CA1098065A; FR2376211A1; GB1570644A; JPS5385000A; DE2758481C2; JPS5527561B2; FR2376211B1

Description

Glucan und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Glucan (Elsinan) aus wiederkehrenden Einheiten der Formel l3)-Glc-(1->4)-Glc-(1-»4-)-0lc-(">] , worin GLc den Alpha-D-Glucopyranose-Rest bedeutet, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die bekennten Polysaccharide, die in Alpha-Stellung verknüpfte D-Glucose enthalten, die Alpha-Glucane, umfassen aus PfLanzen stammende Stärke, aus tierischem Material stammendes Glycogen sowie mikrobiellss Dextran und mikrobielles Pullulan.

Wenngleich diese Alpha-Glucane in großen Mengen verbraucht worden sind, so wurden sie doch hauptsächlich auf dem Gebiet der Nahrungsmittel und in der pharmazeutischen Industrie verwendet.

Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen GLucans, daß sich nicht nur in der Nahrungsmittel- und pharmaze^tioonen Industrie verwenden läßt, sondern auch auf anderen unterschied-

809830/0638

ORIGINAL INSPECTED

lichen technischen Gebieten*

Es wurde gefunden, daß das Polysaccharide das durch Züchten von Mikroorganismen der Gattung Elsinoe auf einem Nährmedium erhalten werden kann, ein neues wasserlösliches Glucan mit wiederkehrenden Einheiten der Formel [3)-Glc-(1*4)-Glc-(1-»4)-GIc-(Ii^ darstellt und sich für eine Reihe von industriellen Verwendungszwecken eignet, einschließlich einer Verwendung in Folienform. Das neue Glucan wurde Elsinan genannt.

Das Elsinan wurde als ein Alpha-Glucan identifiziert und besitzt die folgenden Eigenschaften:

Reinheit: Durch Ultrazentrifugieren und Elektrophorese wurden keine Verunreinigungen entdeckt.

Analyse: Gef. C-43.7%, H-6.16% Ber. C-44.4%, H-6.17% N<Ö,1%, Asche<O,O1% Spezifische Drehung:BÜ Jp + 175 Us 280° (1-1, c-1,6, 0,5n

NaOH)

Löslichkeit: Leichtlöslich, in Wasser, O,"fn Natronlauge,

90%-ige Ameisensäure, Formamid und Dimethyleulfoxid.'Unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Aceton, Chloroform oder Essigester.

Aussehen: Farbloses, feines Pulver, geruch- und geschmacklos. Farbreaktionen: Grünfärbung mit Anthron/Schwefelsäure,

Gelbfärbung mit Cyetein/Schwefelsäure; bleibt farblos bei der Morgan-Elson-Eeaktion; Jodfärbung negativ.

809830/0631

Infrarot-Sp^ktruai: Das Infrarotspektrum im KBr ist in Fig. 1 wiedergegeben. Die Absorption bei 840 cm ist für die Alphaverknüpfung charakteristisch.

Komponenten: Die analytischen Ergebnisse, die durch Papierchromatografie, Gaschromatografie, Flüssigkeitschromatografie und nach Anwendung der Glucose-Oxidase-Peroxidase-Methode erhalten wurden, zeigten, daß der bei der Hydrolisierung von Elsinan mit n-Schwefelsäure, η-Salzsäure oder n-TriChloressigsäure erhaltene Zucker D-Glucose war.

Außerdem zeigten die Analyseergebnisse, die durch Anwendung chemischer Verfahren, wie der Methylierung, Oxidation mit Perioda¹:, dem Smith-Abbau und dem gesteuerten Smith-Abbau, erhalten wurden, daß das Elsinan gemäß der Erfindung ein neues Glucan mit einer bisher unbekannten Struktur darstellt. Die Eigenschaften des neuen Glucans Elsinan werden im folgenden im einzelnen näher beschrieben.

1. Die hohe spezifische Drehung vonEO jp + 175 bis 280° sowie die Absorption bei 840 cm im Infrarotspektrum deuten darauf hin, daß die Gesamtheit oder die meisten der glucosidischen Bindungen des Elsinans vom Alphatyp sind.

2fi) Qualitative und quantitative Analyse durch Gaschromatografie und Massenspektrumetrie des Hydrolisats von methyliertem Elsinan zeigen, daß die Hauptkomponenten 2,4,6-Tri-O-Methyl-D-Glucose (ca. 30%) und 2,3,6-Tri-O-Methyl-D-Glucose (ca. 68%) sind und außerdem geringe Mengen an 2,4-Di-O-Methyl- D-Glucose (ca. Λ%) und 2,3,4,6-Tetra-O-Methyl-D-Glucose (ca. 1%) vorhanden sind. „ 4 „

809830/063·

b) Vollständige Oxidation des Elsinans mit Periodat ergab,

daß 0,8 Mol Periodat je Glucoserest verbraucht wurden, wobei gleichzeitig 0,07 Mol Ameisensäure je Glucoserest gebildet . wurden.

c) Qualitative und quantitative Analyse durch Papierchromatografie, Gaschromatografie und Flüssigkeitschromatografie der Produkte des Smith-Abbaus von Elsinan bestätigten die folgende Zusammensetzung: D-Erythrit 68 bis 70%; D-Glucose 29 bis 30%; Glycerin.

Die obigen Ergebnisse bestätigen, daß die Glucosereste im Elsinan im wesentlichen lineare Moleküle darstellen, die im Mol-Verhältnis von 2,0 bis 2,3 J 1»0 durch Alpha-1,4- und Alpha-1,3-Verknüpfungen miteinander verbunden sind.

Sehr wenige der Glucosereste, die mit den benachbarten Glucoseresten über das C-Atom 1 und das C-Atom 3 verknüpft sind, sind durch eine Alpha-1,6Verknüpfung an C-Atom 6 verzweigt. Derartige Glucosereste sind höchstens in einer Menge von 1:70 Glucoseresten enthalten.

3· Die papierchromatografische und gaschromatografisehe Analyse der Produkte des gesteuertenSmith-Abbaus von Elsinan zeigt, daß D-Erythrit und 2-0-Alpha-D-Glucopyranosyl-D-Erythrit im Mol-Verhältnis von 1,0 bis 1,3 '· 1»0 vorhanden sind, wobei die Anwesenheit von 2-0-alpha-D-Glucopyranosyl-D-Erythrit zeigt, daß der Glucoserest am C-Atom 3 mit einem benachbarten Glucoserest über eine alpha-1,3-Verknüpfung und am Kohlenstoffatom 1 mit dem benachbarten Glucoserest auf der anderen Seite über eine alpha-1,4-Verknüpfung verbunden ist. Außerdem wurd« eine Spur Glycerin

- 5 -809830/0638

--V

2758A8I

nachgewiesen, die von dem nicht reduzierenden endständigen GIucoserest stammt.

. Partielle Hydrolyse von Elsinan mit verdünnter Säure ergibt, daß Maltotriose eine geringe Menge Maltotetraose und andere Trisaccharide und Tetrasaccharide, die sowohl alpha-1,4- als auch alpha-1,3 Verknüpfungen enthalten, im Hydrolysat vorhanden sind.

Die oben erwähnten Beobachtungen 1,2, 3 und 4 zeigen, daß das erfindungsgemäße Elsinan ein Polysaccharid ist, das kaum verzweigt ist und alpha-1,3- und alpha-1,^-Verknüpfungen enthält, wobei aie Hauptstruktur darin besteht, daß etwa drei alpha-1,4-verknüpfte Glucosereste wiederholt durch eine alpha-1,3-Verknüpfung aneinandergereiht sind.Mit anderen Worten besitzt das Elsinan eine praktisch linearkettige Struktur, in der Maltotriose-Einheiten wiederholt Ln alpha-1,3-Verknüpfung aneinandergereiht sind. Die Feststellungen 2, 3 und 4 zeigen ferner, daß obwohl· die wiederkehrenden Einheiten vorwiegend aus Maltotriose bestehen, in geringer Menge auch Maltotetraose-Reste vorhanden sind.

Somit sind die wiederkehrenden Einheiten des Elsinans die foLgenden:

Die Struktur es ElsinanS kann wie folgt dargestellt werden:

CH₁OH

CHiOrt ' ChtC-

I I · ι Λ I O

I/I \i .A \l ι A Nl /). \l

CHzOri CM₂OH

H OH H

H OH H OK H

Maltotrioserest

Nigeroserest 809830/0638

Maltotrioserest - 6 -

Das mittlere Molekulargewicht von Elsinan läßt sich im Bereich von etwa 5OOO bis etwa 10.000.000 frei einstellen, weil das Glucan entweder chemisch oder biochemisch hergestellt werden kann und eich leicht mit Salzsäurei Schwefelsäure usw. hydrolysieren läßt.

Das erfindungsgemäße Elsinan läßt sich chemisch beispielsweise durch Polymerisieren von Maltotrioseeinheiten mit wiederholten alpha-1,3-Verknüpfungen herstellen.

Die biochemische Herstellung des Elsinans läßt eich durch Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Elsinoe durchführenc Beispielsweise läßt sich Eleinoe leucospila für eine wirksame Herstellung von Elsinan verwenden. Der Mikroorganismus ist aus Arg.Inst. Biol. S.Paulo, 17,Seiten 67 - 72 (1946) und Study of Tea, 49, Seiten 79 - 88 (1975) bekannt und wurde bei dem Fermentation Institute, Agency of Industrial Science and Tehnol°ßy» 8-1, 5-chome, Inagehigashi, Chiba, Japan unter der Hinterlegungsbezeichnung FEHM-P No.387* hinterlegt.

Für die Herstellung von Elsinan sind außerdem die Mikroorganismen der Gattung Elsinoe verwendbar«.

Elsinoe ampe«J.ina IFO 5263, IFO 6359 Elsinoe araliae IFO 6166, IFO 7162 Elsinoe fawcetti IFO 6442, IFO 8417, ATCC 13200 Elsinoe annonae ATCC 15027 Elsinoe corni ATCC 11189 Elsinoe heveae ATCC 12570 Elsinoe lepagei ATCC 13008 Eleinoe tiliae ATCC 24510

ΘΟ·Ι30/063·

Im folgenden wird das Verfahren zur Herstellung von Elsinan näher erläutert: Die erwähnten Mikroorganismen der "Gattung Elsinoe werden auf einem Kulturmedium gezüchtet, das geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralien und andere zur Erzeugung von Elsinan erforderlicheaNährstoffe enthält, wonach das erhaltene Glucan abgetrennt und gewonnen wird.

Das Kulturmedium kann in fester oder flüssiger Form vorliegen. Im Falle eines flüssigen Mediums kann zwar auch eine statische Kultur durchgeführt werden, jedoch ergeben Schüttelkulturen oder Submereverfahren höhere Ausbeuten an Elsinan.

Für ein Kulturmedium eignen sich Kartoffelextrakt mit heißem Wasser und Sacharose. Synthetische Verbindungen, wie Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff und natürliche organische Substanzen, wie Polypeptone, Maiseinweichflüssigkeit (corn steep liquor), Hefeextrakt, entfetteter Sojabohnenextrakt, Peptide oder Aminosäuren, können in beliebiger Weise als Stickstoffquellen verwendet werden.

Als Mineralien können Phosphate, Kaliumsalze, Sulfate und Magnesiumsalze verwendet werden. Nötigenfalls können auch andere Mineralien, wie Ferrite oder Ferrate, Kalziumsalze und Manganate verwendet werden.

Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums muß in einem Bereich liegen, der das mikrobielle Wachstum und die Elsinanproduktion begünstigt.

Im allgemeinen wird ein pH-Wert von 5 bis 8 bevorzugt. Analog muß die Züchtungstemperatur in einem Bereich liegen, der mikro-

808830/0638

bielles Wachstum und Elsinanproduktion begünstigt. Im allgemeinen wird hierfür eine Temperatur von 20 bis JO⁰C bevorzugt. Die Züchtung wird durchgeführt, bis die Maximalausbeute an Elsinan erreicht ist, was im allgemeinen 3 bis 7 Tage dauert.

Die erhaltene Kulturbrühe, in der nach dem obenerwähnten Verfahren Elsinan erzeugt und angereichert wird, besitzt eine hohe Viskosität. Die Brühe wird zur Entfernung der Zellen und Mycele filtriert oder zentrifugiert, wonach das Elsinan in dem auf diene Weise erhaltenen klaren Filtrat oder der überstehenden Flüssigkeit in Form weißer Federn oder in Gummiform durch Zugabe geeigneter Ausfällungsmittel, beispielsweise organischer Ausfällungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Azeton ausgefällt wird. Das Elsinan wird durch geeignete Verfahren, wie Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen. Das erhaltene Elsinan kann als solches verwendet werden oder nach weiterer Reinigung, die durch Auflösen in Wasser und wiederholtes Ausfällen durch Zugabe organischer Ausfällungsmittel erfolgt, wonach das Produkt nötigenfalls getrocknet wird. Für das Trocknen eignen sich beispielsweise das Strömunfistrocknen (Flow drying), Heißlufttrocknen, Sprühtrocknen, Trommeltrocknen, Vakuumtrocknen und Lyophylisieren.

Das folgende Beispiel erläutert das Herstellungsverfahren für

Elsinan.

ine-¹" Beispiel;

Ein flüssiges Medium aus 5%'(Gew./Volumen) Sacharose 0,5% (Gew./ Volumen) Hefeextrakt 0,042% (Gew./Volumen) Dinatriumhydrogenphosphat 0,018% (Gew./Volumen) Kalium Dihydrogenphosphat, einer durch eine semipermeable Membran geführte Lösung aus Kartoffel-

809830/0631

extrakt mit heißem Wasser (300 g frische Kartoffeln je 1 L Medium^ und Wasser wurde 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert und anschließend gekühlt. Danach wurde das Medium mit Elsinoe leucospila, FERJi-P No.3874 bei einem AnfangspH-Wert von 6,8 beimpft und bei 24⁰C 5 Tage lang einem Submers-Verfahren unterzogen. Nach Pasteurisieren der erhaltenen Brühe während 15 Minuten bei 85°C wurden Zellen und Mycele durch Zentrifugieren. (20 Min. 5·000 g) entfernt. Durch Zugabe von 1,5 Volumenteilen Äthanol zu der so erhaltenen klaren übersehenden Flüsoigkeit wurde rohes Elsinan als Niederschlag in Form von Federn oder Gummi erhalten. Das rohe Elsinan wurde in Wasser gelöst und zentrifugiert, um unlösliche Substanzen, wie oben beschrieben, zu entfernen, wonach es erneut durch Zugabe von ^thanoL zu der überstehenden Flüssigkeit ausgefällt wurde. Nach dreimaliger Wiederholung dieses Vorgehens wurde die Ausfällung L.yophilisiert.

Man erhielt ein weißes Pulver aus gereinigtem Elsinan mit etwa 30%-iger Ausbeute, bezogen auf die in dem Medium eingesetzte Saccharose.

Die Viskosität einer 3%~ig^en (Gew./Gew.) wässerige Lösung d^s gereinigten Elsinans, bestimmt bei 30⁰C uu. r Ve: ./er.dung eiriuti Brookfield-Rotations-Viskosimeters, betrug 407 cps. Die Sch.-itzung der Mole'culargewichtsverteilung des gereinigten Elsinans

durch Gelfiltration ergab einen Verteili </?*" dreien von etwa

10.000 bis etwa 10.000.000 oder darüber, ^e aus Fig.2 hervorgeht.

Eine 5%-ige wässerige Lösung des gereinigten Elsinans wurds gleichmäßig auf eine klare Glasplatte νβι_5>..:"" und an Luft

- 10 809830/0638

getrocknet. Man erhielt eine farblose, klare, intensive, biegsame und selbsttragende Folie; die ausgezeichnete Überzugs- und Folienbildung des Elsinans fuhrt dazu, daß man es als Verpackungefolien oder überzugsmittel vexifenden kann.

In der folgenden Fig,1 ist das Infrarotspektrum des gereinigten Elsinans und in der folgenden Fig·2 die Molekulargewichtsverteilung des gereinigten Elsinans, ermittelt durch Gelfiltration, angegeben.

308830/0638

Rg.

Molekulargewicht (Mn)

120

Ci	co	=»,
ο	O	TJ
er	(O	O •rl
09	OO	43
*C>**	u>	a)
O	O	+>
■»^		ti
α	O	Φ
CD	co	Ö
«j*	u> OO	I

Ϊ100

80

60

S U)

20

■-H 86

IxD

_lf?⁶

1x1

olumen (ml)

150

200

Nummer:	27 it 481
Inta.»:	*crnnnm*
Anmektetag:	28. Dezember 1977
QffenJegungstag:	27, Juli 1978

ρ«

■ϊ

801130/063·

Claims

Patentansprüche

1. Glucan aus wiederkehrenden Einheiten der Formel[3)-Glc-(1-«<O-Glc-(1*4-).GIc-(I-*] (Elsinan), worin GIc einen Alpha-D-Glucopyranose-Rest bedeutet.

2. Verfahren zur Herstellung eines Glucans aus wiederkehrendes Einheiten der Formel £3)-Glc-(1-*O-Glc-(1VO-Glc-(1·«!, worin GIc einen Alpha-D-Glucopyranose-Rest bedeutet (Elsinan), dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattung Elsinoe, die zur Erzeugung des Glucans Elsinan befähigt sind, auf einem Nährmedium züchtet und das erzeugte Glucan Elsinan abtrennt und gewinnt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzei :l^o.et, daß man als Mediuip ein solches verwendet, das Saccharose enthält.

ORIGINAL INSPECTED

808830/0638