CH656642A5

CH656642A5 - Verfahren zur intensivierung der mikrobiologischen umsetzung von steroidverbindungen.

Info

Publication number: CH656642A5
Application number: CH5673/82A
Authority: CH
Inventors: Nagy Eva-Cserey Pecha Udrvardy; Istvan Bartho; Gabor Hantos; Maria Trinn; Zsuzsa Vida; Jozsef Dr Szejtli; Agnes-Szoeke Dr Stadler; Ilona Habon; Marta-Czurda Balazs
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet; Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1981-09-28
Filing date: 1982-09-27
Publication date: 1986-07-15
Also published as: JPH047197B2; SE452777B; ES8400146A1; DE3235884C2; BE894501A; IT1157322B; DK422182A; DD204267A5; SE8205506D0; NL8203746A; ES516007A0; IT8223453A0; GB2108965B; FR2513656A1; US4528271A; GB2108965A; FR2513656B1; CA1185548A; SE8205506L; HU190784B

Description

656 642

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Intensivierung der mikrobiologischen Umsetzung von Steroiden, dadurch gekennzeichnet, dass man die mikrobiologische Reaktion des Steroid-Substrats in Gegenwart von a-, ß- oder y-Cyclodextrin oder einem Gemisch derselben durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cyclodextrin nach Beendigung der Umsetzung aus dem System zurückgewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cyclodextrin vor der mikrobiologischen Reaktion in das System einführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cyclodextrin bei Beginn oder während der mikrobiologischen Reaktion in das System einführt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cyclodextrin in einer Menge von 0,2 bis 3 Mol, auf 1 Mol des Substrats berechnet, verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2,4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das entsprechende Cyclodextrin vor Eintragung des Substrats in das Bioreaktionssystem einsetzt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2,4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man den Inklusionskomplex des Substrat-Cyclodextrins zur mikrobiologischen Umsetzung verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung oder Suspension des Substrat-Cyclo-dextrin-Inklusionskomplexes verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1,2,4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cyclodextrin nach Beendigung von 35 bis 50% der mikrobiologischen Umsetzung in das System einführt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Cyclodextrin bzw. dessen mit dem Steroid-Substrat gebildeten Inklusionskomplex oder gegebenenfalls eine Lösung derselben vor dem Einsatz in das Bioreaktionsmedium sterilisiert.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das in das Bioreaktionsmedium eingetragene Cyclodextrin samt dem Medium sterilisiert.

12. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Steroid mit einem organischen Lösungsmittel aus dem wässrigen Bioreaktionsmedium extrahiert und das Cyclodextrin durch die Zugabe eines die Löslichkeit stark herabsetzenden Lösungsmittels, zweckmässig Hexan, ausfällt, aus dem Raffinat durch Filtration isoliert und gegebenenfalls trocknet.

Der Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Intensivierung der mikrobiologischen Umsetzung von Steroid-verbindungen durch die Verwendung von Cyclodextrin-Zu-satzstoff.

Bei der Herstellung von Steroidverbindungen kommt es oft vor, dass man eine Stufe der mehrstufigen Synthese durch die Verwendung einer spezifischen Funktion eines Mikroorganismus löst. Die Mikroorganismus-Zellen, die aus der Zellen extrahierten Enzyme, die eventuell fixierten Zellen oder die fixierten Enzyme verwendenden Biokonversionsprozesse gehen in einem wässrigen Medium vor. Obwohl die enzymati-sche Reaktion in diesem Medium sicher abläuft, ist gleichzeitig ein Nachteil im Vergleich mit den Reaktionen in organischen Lösungsmitteln, dass die Steroide im Wasser schlecht lösbar sind. Die Wasserlöslichkeit einer Reihe von Steroidverbindungen ist sehr schwach, also die Konzentration ist niedriger als diejenige Konzentration bei welcher die Biokonversionsprozesse noch ökonomisch durchführbar sind. In den bekannten Verfahren ist ein bestimmter Teil des Substrats 5 bzw. des Steroidproduktes während der Reaktion in fester Form anwesend. Die Auflösung des Substrats in der festen Phase kann die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmen, im Fall von heterogener Teilchengrösse wird die Geschwindigkeit der Auflösung mit Erhöhung der Durchschnittsgrösse 10 der nicht aufgelösten Teilchen immer niedriger. Es kann vorkommen, dass wegen der Auflösungsprobleme die Reaktion vor der Erreichung der gewünschten Konversion zum Stillstand kommt.

Mehrere Verfahren wurden zur Erhöhung der Wasserlös-15 lichkeit des Substrat-Steroids oder der Auflösung-Geschwindigkeit des Produktes ausgearbeitet.

Gemäss GB-PS 1 211 356 wird zur Erreichung eines homogenen, zerkleinerten Substrats das in die Reaktion eingeführte Steroid vorher mechanisch dispergiert. Nach US-PS 20 4 124 607 wird das Substrat von Feinkorngrösse in einer separaten Stufe hergestellt, indem man die in einem organischen Lösungmittel hergestellte Steroidlösung im Wasser emulgiert und das Lösungmittel abdestilliert. In mehreren Verfahren wird das Steroid in einem organischen Lösungs-25 mittel aufgelöst und die Ausscheidung erfolgt unmittelbar in dem Biokonversionsprozeß. Nach HU-PS 149 678 wird das zur Eintragung des Substrats verwendete Lösungsmittel (Pyridin, Essigsäure), vor dem Anfang der Biokonversion neutralisiert, und die Löslichkeit wird bei Alkoholen durch die 30 Zugabe von Alkali-erdmetall-chloriden verbessert.

Gemäss GB-PS 1 083 204 wird die Löslichkeit des Steroid-Substrats in dem Reaktionsmedium durch die Zugabe eines organischen Lösungsmittels, zweckmässig Dimethylsulf-35 oxyds verbessert, das schon bei dem Einsatz oder nach dem Einsatz verwendet wird. Nach einer anderen Lösung wird die Wasserlöslichkeit des Steroidsubstrats mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gesichert, in diesem Fall wird die schnelle Stoffübergabe durch die grosse Grenzenoberflä-40 che der gebildeten Emulsion ermöglicht (s. Biotechn. Bioeng. 21,39 / 1979). In der pharmazeutischen Industrie verwendet man oft Solubilisierungsmittel. So z.B. erhöht man, gemäss DE-PS 1 543 431, erheblich die Androstendion-Ausbeute durch die Zugabe von Solubilisierungsmitteln bei der Herstel-45 lung der Verbindung aus 4-Co!lesten-3-on.

Die bekannten Lösungen vermindern zwar die mit der schwachen Wasserlöslichkeit der Steroidsubstrate verbundenen Nachteile, sind aber nicht ökonomisch oder zeigen ungünstige Wirkungen auf das System. Falls z.B. das Substrat in so mikrokristalliner Form hergestellt wird, dies bedeutet mehr Arbeitsvorgänge in der technologischen Reihe und verursacht einen Stoffverlust. Nach anderen Beobachtungen wird der Mikroorganismus während einer längeren Zeit durch das organische Lösungsmittel in der zur bedeutenden Erhöhung der 55 Wasserlöslichkeit der Steroide nötigen Menge beschädigt (Steroids, 12,525 [1968]).

Wenn man Solubilisierungsmittel verwendet, steigert sich nach Erfahrungen die Schaumbildung und dies hindert eine genügende Lüftung des Bioreaktionssystems.

60 Das Ziel der Erfindung war die Ausarbeitung eines Verfahrens das einerseits die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren vermindert und gleichzeitig die Intensivierung der Reaktion bei der mikrobiologischen Umsetzung der Steroide sichert.

65 Es wurde gefunden, dass die Cyclodextrine in Bioreaktionssystemen zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit der Steroidmoleküle, bei festem Rückstand zur Erhöhung der Lösungsgeschwindigkeit und dadurch zur erheblichen Erhöhung

3 656 642

der Bioumsetzung, weiterhin in einem gegebenen System zur stallisierbar, ein Steroid-Cyclodextrin wird gebildet, das bei Eliminierung der eine weitere Reaktion hemmenden Produkt- einem Bioumsetzungsprozess, der keiner Sterilisierung be-hemmung und in bestimmten Fällen zur Blockierung be- darf, in fester Form verwendet werden kann (Variante 3).

stimmter Reaktionen durch die Deckung einiger sterischen Die Cyclodextrine sind Glucose-Polymere von natürli-

Gruppen des Steroidmoleküls vorteilhaft verwendet werden 5 chem Ursprung, die aus 6,7 oder 8 Clucose-Einheiten beste-können. Die a- und ß-Cyclodextrine bzw. deren Gemische hende eingeschlossene Makroringe sind. Ihre Struktur wird wirken katalytisch in einer Ester-Hydrolyse. Wenn die Mi- durch die spezielle Anordnung der Hydroxylgruppen charak-kroorganismen zwei oder mehrere Funktionen aufweisen, so terisiert. Alle sekundäre Hydroxylgruppen sind an dem einen können die selektiven Wirkungen das Verhältnis der Reak- Rand des Ringes zu finden, wogegen die primären Hydroxyl-tionsprodukte beeinflussen. Die obigen Wirkungen werden 10 gruppen an dem anderen Rande des Ringes aufzufinden sind, weiterhin zusammenfassend als «Intensivierung» bezeichnet. Daraus folgt, dass die äussere Oberfläche des Ringes hydro-

Erfindungsgemäss wird die Reaktion der mikrobiologi- P^il ist, daher sind die Cyclodextrine wasserlöslich.

sehen Umsetzung der Steroide so intensiviert, dass man das Die innere Seite des Ringes ist hydrophob. Die Cyclodex-

Steroid-Substrat in Gegenwart von a-, ß- oder y-Cyclodextrin 1S trine bilden mit Molekülen von entsprechender Grösse und oder deren Gemisch umsetzt und gegebenenfalls nach der Form Inklusionskomplexe. Das aus 6 Glucopyranose-Ein-Umsetzung das Cyclodextrin aus dem Gemisch gewinnt. Un- heiten bestehende Cyclodextrin ist a-Cyclodextrin, ß-Cyclo-ter «Cyclodextrin» versteht man weiterhin a, ß- oder y-Cyclo- dextrin wird aus 7 Glucopyranose-Einheiten aufgebaut und y-dextrin oder ein beliebiges Gemisch derselben. Vor der mikro- Cyclodextrin besteht aus 8 Glucopyranose-Einheiten. Nach biologischen Umsetzung oder zu deren Beginn oder in einer 20 der Bindungsart werden Cyclodextrine auch Cycloamylose bestimmten Phase der mikrobiologischen Umsetzung gibt genannt. Komplexe von Steroidmolekülen mit Cyclodextrin man mit Vorteil auf ein Mol Substrat 0,2-3 Mol Cyclodextrin wurden schon während des Studierens mehrerer pharmakolo-zu. Nach einer Ausführungsmethode wird das entsprechende gischen Wirkstoffe und mehrerer solubilisierenden Stoffe un-Cyclodextrin vor dem Einsatz des Substrats in das Bioreak- tersucht (Lech und Pauli: J. Pharm. Sei. 55,32 [1966]). Im tionsmedium geführt. Nach einer anderen Ausführungsme- 2s Fall von Testosteron und Cortisonacetat wurden die wahr-thode wird das Substrat mit dem Cyclodextrin umgesetzt und scheinlichen stoechiometrischen Verhältnisse der Komponen-der erhaltene Substrat-Inklusionskomplex, bzw. dessen wäss- ten festgestellt. Durch die Solubilisierung wollte man die Re-rige Lösung oder Suspension wird zum Bioreaktionsmedium sorption der pharmazeutischen Wirkstoffe beeinflussen. Die gegeben. Nach einer weiteren möglichen Ausführungsform Cyclodextrine wurden aber nicht zur Intensivierung der Rewird das Cyclodextrin allein oder in Form eines mit dem Sub- 30 aktion bei der mikrobiologischen Umwandlung der Steroid-strat gebildeten Inklusionskomplexes, erwünschtenfalls eine Substrate verwendet. Es wurde festgestellt, dass der Komplex wässrige Lösung oder Suspension des Inklusionskomplexes von Steroid-Substrat mit Cyclodextrin in einem wässrigen während der mikrobiologischen Reaktion, üblicherweise Medium gleich dissoziiert und der Komplex ist in einem Bio-

nach Erreichung von 30-50% Umsetzung zugegeben. Die Lö- reaktionssystem in einem dynamischen Gleichgewicht mit sung des Cyclodextrins oder des Cyclodextrins und des Sub- 35 den freien Steroid- und Cyclodextrin-Molekülen. In einem fe-strat-Inklusionskomplexes können vor der Eintragung in das sten, einen suspendierten Steroid enthaltenden Bioreaktions-Bioreaktionsmedium sterilisiert werden oder sie können mit system ist die jeweilige Konzentration des für das Enzym er-dem Bioreaktionsmedium zusammen sterilisiert werden. Cy- reichbaren gelösten Anteils immer von der Lösungsgeschwin-clodextrin kann aus dem wässrigen Bioreaktionsmedium so digkeit des die Nachfolgung sichernden Substrats und der Gezurückgewonnen werden, daß man das Steroid mit einem or- 40 schwindigkeit der enzymatischen Reaktion abhängend. Wenn ganischen Lösungsmittel extrahiert und das Cyclodextrin die Auflösung ein langsamerer Prozess ist, so bleibt während durch die Zugabe eines dessen Löslichkeit stark vermindern- der Reaktion die Konzentration der Steroidlösung weit unter den Lösungsmittels, bevorzugt Hexans aus dem Raffinat aus- dem Sättigungswert und die Reaktion wird dadurch im Sinne fällt und durch Filtrieren isoliert und das Cyclodextrin er- des Grundgesetzes der enzymatischen Reaktion wesentlich wünschtenfalls trocknet. 45 langsamer. Das Substrat setzt sich aus dem Cyclodextrin In-

Die Intensivierung der mikrobiologischen Umsetzung der klusionskomplex praktisch augenblicklich frei. Die Menge Steroide gemäss der Erfindung ist sehr vorteilhaft, da diese des gelösten Substrats bleibt in diesem Fall während des gan-Wirkung in der Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und zen Prozesses ganz bis zum Ende des Prozesses auf dem Sätti-in der Verminderung der Reaktionszeit scheinbar wird, die gungswert und so wird die maximale Umsetzungsgeschwin-Konzentration des Substrats in dem Medium kann erhöht 50 digkeit der gegebenen Enzymreaktion gesichert.

werden, die Produkthemmung kann eliminiert werden, von Bei anderen Steroid-Umsetzungsreaktionen kann das den möglichen Reaktionen kann die gewünschte Reaktion Produkt nach dem sogenannten Endprodukthemmungsme-katalysiert werden also die mikrobiologische Selektivität chanismus die Reaktion verlangsamen oder einstellen, wenn kann gesteigert werden. es an das Enzym oder die Oberfläche der Zelle gebunden ist.

Die Herstellung der Cyclodextrin-Steroidsubstrat-Inklu- 55 Wegen der unterschiedlichen Struktur des Substrats und der sionskomplexe dann nach mehreren Varianten durchgeführt Endproduktmoleküle bilden diese mit dem Cyclodextrin werden. Nach einer Variante ist das Medium der Bioumset- Komplexe von mehr oder weniger verschiedener Stabilität, zung eine wässrige Lösung entsprechender Konzentration des Gemäss unserer Untersuchungen wurden so günstige Reak-gewünschten Cyclodextrins, zu welcher das Substrat Steroid tionsumstände gefunden unter welchen das sonst Endpro-gegeben wird und der Inklusionskomplex wird der Gleichge- 60 dukthemmung verursachende Steroid in Cyclodextrin-Kom-wichtslage entsprechend gebildet (Variante 1). plex übergeführt wurde ohne die Zugänglichkeit des Substrat-

Nach einer anderen Methode wird um den Einsatz des Steroids verschlechtert zu haben. Wenn die Stabilität des SubSteroids in das System zu vermeiden, in einem separaten strat-Cyclodextrin-Komplexes die Stabilität des Endprodukt-Tank die wässrige Lösung des Substrat-Cyclodextrin-Inklu- Cyclodextrin-Komplexes übertrifft, dann kann durch die sionskomplexes hergestellt, die durch Filtrieren sterilisiert 65 Verwertung der Komplexbildung die Endprodukthemmung wird und so zum Bioreaktionsmedium gegeben wird (Va- so aufgehoben werden, dass man das Cyclodextrin nur nach riante 2). In Gegenwart von etwas Wasser ist nach der Erfah- einem gewissen Fortschritt der Reaktion einsetzt wenn der rang das Gemisch von Cyclodextrin und von Steroid umkri- Überschuss des Produktes im System nachgewiesen kann.

656 642

In weiteren Untersuchungen wurde auch festgestellt, dass die enzymatische Hydrolyse der veresterten Steroidmoleküle durch die Herstellung eines entsprechenden a- und/oder ß-Cyclodextrin-Komplexes beschleunigt werden kann. Dies kann vermutlicherweise durch die katalytische Wirkung erklärt werden, die aus der Struktur des Cyclodextrins folgt.

Bei verschiedenen Bioreaktionen wurde auch beobachtet dass die Cyclodextrin-Komplex-Bildung andere Verhältnisverschiebung verursachen kann, so kann im Fall eines entsprechend stabilen Komplexes durch die Verminderung der Zugänglichkeit des Moleküls die Geschwindigkeit einer Reaktion gegebener Konfiguration vermindert oder die Reaktion sogar eliminiert werden.

Diese Inklusionskomplex bildende Eigenschaft und deren Wirkung auf die Intensivierung der Bioumsetzungsreaktion ist auf die Steranverbindungen allgemein gültig. Untenstehend werden die Einzelheiten des Verfahrens an Beispielen von Oestran-, Androstan-, Pregnan-, Cholestan-, Stigmastan-und Nor-Verbindungen demonstriert ohne den Schutzumfang auf die obigen Beispiele zu limitieren.

Beispiel 1 Substrat: Hydrocortison

Mikroorganismus Arthrobacter simplex (ATCC 6946) a-Cyclodextrin, Geschwindigkeiterhöhung Substrateinführung: 1. Variante Eine Agarkultur von Arthrobacter simplex (ATCC 6946) wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und man inokuliert mit 5 cm3 dieser Suspension den folgenden Nährboden:

Glucose: 0,3%, enzymatisch hydrolysierter Kasein 0,5%, Hefenextrakt: 0,1%, pH = 6,7. Man ergänzt die Lösung mit Wasser auf 100 cm3 und sterilisiert in einem 500 cm3 Er-lenmeyer-Kolben. Man kultiviert bei 32 °C an einer Flach-Rüttelmaschine von einer Hubzahl von 230/18 Stunden, man gibt 5 mg Hydrocortison in 0,5 cm3 Methanol gelöst zur Kultur und das erwünschte Enzym wird induziert. Die Induktion dauert 3 Stunden, die unter gleichen Umständen wie alle Kultivierung durchgeführt wird. 50 cm3 der delta-1-Dehydroge-nas-Enzym enthaltenden Kultur wird in einen 950 cm3 steriles Wasser enthaltenden 3 1 Erlenmeyer Kolben vorgelegt und die Umsetzung wird mit der so erhaltenen 20-fach verdünnten Aktivkultur durchgeführt. Das eingesetzte Substrat beträgt 2 g Hydrocortison, der Einsatz folgt durch die Verwendung des obigen Zusatzes folgenderweise:

Man gibt 20 g a-Cyclodextrin zur Kultur, nach deren Auflösung löst man das Hydrocortison im 20 cm3 Methanol auf, wobei der Methanol 10 Gew. % CaCl2 enthält. Die Lösung gibt man zu der das a-Cyclodextrin enthaltenden Kultur. Die Umsetzung erfolgt bei 32 °C an der oben erwähnten Rüttelmaschine 5 Stunden lang. Die Gegenwart des a-Cyclodextrins verhindert bei der Eintragung des Substrats in das wässrige Medium dessen Ausscheidung, die Umsetzung des aufgelösten Substrats erfolgt mit einer grösseren, durch die Enzymaktivität bestimmten grösseren Geschwindigkeit als in dem System, das das Substrat in Form einer Suspension enthält. Die Umsetzungszeit des obigen Substrats ohne Cyclodextrin beträgt 8 Stunden. Am Ende der Umsetzung ist der Steroidge-halt der Fermentbrühe: 1920 ng/cm3 Prednisolon, 40 ng/cm3 20-ß-Hydroxy-prednisolon und 8 jag/cm3 Hydrocortison.

Beispiel 2

Substrat: 17 a-Methyl-testosteron (Androstan-Derivat) Mikroorganismus: Arthrobacter simplex (ATCC 6946) ß-Cyclodextrin, Aufhebung der Endprodukthemmung Substrateinsatz: Variante 1.

Die nach Beispiel 1 hergestellte und induzierte Kultur wird auf das fünffache verdünnt und zur delta-l-Dehydroge-nierung von Methyl-Testosteron verwendet indem man zur Ingangsetzung der Bioumsetzung eine Lösung von 1,0 g Methyl-Testosteron in 10 cm3 Methanol in das System führt. Die Umwandlung wird dünnschichtchromatographisch beobachtet. Das eingetragene Substrat scheidet sich im System aus und wird während kontinuierlicher Auflösung dehydro-genisiert. Bei Erreichung von ea. 400 (ig/cm3 delta-1-Methyl-Testosteron gibt man zum System 6,0 g ß-Cyclodextrin. Der Zusatz bildet einen Komplex aus dem entstehenden Produkt, das ist deshalb wichtig, weil sonst die enzymatische Reaktion wegen des Übergewichts des Produktes aufgrund des bekannten Endprodukthemmungs-Mechanismus langsamer wäre und schliesslich überhaupt nicht fortgesetzt wäre. Die Komplexbildungsneigung des ß-Cyclodextrins gegenüber dem Produkt ist ca. fünffach so intensiv als die gegenüber dem Substrat. Der Einsatz erfolgt in der zweiten Stunde der Umsetzung und die Inkubation wird aufgrund von dünnschicht-chromatographischen Untersuchungen in der 6. Stunde eingestellt.

Der Steroidgehalt der Fermentbrühe am Ende der Umwandlung beträgt: 970 |a/cm3 delta-l-Methyl-Testosteron. 6 ng/cm3 Methyl-Testosteron. Ohne die Zugabe von Cyclodextrin wird die Reaktion bei einer Rückstand-Substrat-Kon-zentration von 100-120 (ig/cm3 unterbrochen.

Beispiel 3

Substrat: 5-Pregnen-3ß 17 a, 21-triol-20-on -21- acetat [acylierter Pregnen-Derivat]

Mikroorganismus: Flavobacterium lucecoloratum [NIB 93241

y-Cyclodextrin: Variante 3.

Mit einer schiefen Agarkultur von Flavobacterium lucecoloratum [NCIB 9324] inokuliert man 200 cm3 Nährboden im 750 cm3 Erlenmeyer-Kolben. Die Kultivierung führt man bei 30 °C 20 Stunden an einer Flach-Rüttel-Maschine von einer Hubzahl von 230 durch. Mit der Kultur inokuliert man 51 sterilen Nährboden von gleicher Zusammensetzung in einem laboratorischen Fermentor. Die Zusammensetzung: 1,0 Gew.-% Hefenextrakt, 0,1 Gew.-% Kaliumwasserstoffphosphat, 0,4 Gew.-% Dikaliumwasserstoffphosphat. Zum inokulierten Nährboden gibt man 250 mg Substrat aufgelöst in 1,5 cm3 Dimethylformamid. Die Lösung wird steril-fil-triert. Die Gegenwart des Substrats ermöglicht die Bildung der nötigen Enzyme während des Wachstums der Kultur. Nach 12 Stunden Kultivierung ist die Bakterienzahl und die Enzymaktivität zur Ingangsetzung der Bioumsetzung geeignet und man gibt nun 100 g Pregnen-3 ß, 17 a, 21-trihydroxy-20-21-acetat zur Kultur das mit y-Cyclodextrin vorbehandelt wurde. Die Behandlung erfolgt fogenderweise:

Man homogenisiert 100 g Substrat mit gleicher Menge von y-Cyclodextrin und 200 cm3 Wasser 20 Minuten. Während dieser Zeit bildet ein proportioneller Anteil des Substrats mit dem Cyclodextrin einen sehnell löslichen Komplex. Die Suspension wird in den Fermentor eingeführt und man inkubiert weitere 11 Stunden bis das Substrat verbraucht wird. Umstände der Inkubation in dem laboratorischen Fermentor: 30 °C, Rühren mit 420 Drehzahl per Minute, Lüftung einer Geschwindigkeit von 0,5 1/1/Minute. Die Umsetzung wird durch Dünnschichtchromatographie beobachtet. Der Steroidgehalt der Fermentbrühe am Ende der Umsetzung: 9020 (ig/cm3 Reichstein S Verbindung: 4-Pregnen-17a, 21-di-hydroxy-3,20-dion, 30 ng/cm3 Substrat. Ohne Cyclodextrin könnte die Bioumsetzung erst mit einer Menge von 10 g/1 Substrat günstig durchgeführt werden.

4

S

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

656 642

Beispiel 4

Substrat: 4-Pregnen-17a, 21-dihydroxy-3,20-dion-17-ace-tat [acyliertes Corticosteroid]

Mikroorganismus: Curvularia prasadii [IMI 71475] ß-Cyclodextrin, Katalyse der Esterhydrolyse Substrateintragung: Variante 1.

Mit einer Suspension von Sporen die von einer schiefen Agarkultur von Culvularia prasadii [IMI 71475] abgewaschen wurden, inokuliert man 100 cm3 Nährboden in einem 500 cm3 Erlenmeyer-Kolben. Die Zusammensetzung des Nährbodens: 1,0 Gew.-% Sojamehl, 0,3 Gew.-% Maismarmelade, 0,3 Gew.-% Maisstärke, 0,5 Gew.% Malzextrakt, pH = 6,2. Die Kultur wird bei 26 °C 24 Stunden hergestellt. 10 cm3 der Kultur wird zur Inokulierung von 100 cm3 Nährboden in einem gleich grossen Kolben verwendet. Der Nährboden enthält keinen Malzextrakt aber hat sonst die gleiche Zusammensetzung wie oben beschrieben. Der Mikroorganismus wird bei 26 °C geschüttelt und so propagiert. Zur noch wachsenden 16 Stunden alten Kultur gibt man das umzuwandelnde Substrat. Das Substrat ist 4-Pregnen-17ct, 21-dihydro-xy-3,20-dionacetat, aus welchem 0,12 g in 3 cm3 Methanol gelöst zum System gegeben wird. Man inkubiert weiter, wonach die Kultur die Verbindung in 11 ß-Stellung hydroxyliert, wobei Hydrocortison-17-acetat entsteht. In der 20. Stunde der durch Dünnschichtchromatographie beobachtete Umsetzung beträgt das Rückstand-Substrat 10 Gew.-%. Man gibt dann 0,96 g ß-Cyclodextrin zur Umwandlung. Das Cyclodextrin wirkt katalytisch auf die enzymatische Hydrolysis der Acetylgruppe des Steroidmoleküls, so wird während der übrigbleibenden Zeit der Bioumsetzung neben der langsam werdenden Hydroxylierung die Acetylgruppe abgespaltet. Nach weiteren ca. 3 Stunden kann der Prozess unterbrochen werden.

Der Steroidgehalt der Fermentbrühe am Ende der Umsetzung: Hydrocortison [4-Pregnen-l lß, 17a, 21-trihydroxy-3,20-dion] 0,730 mg/cm3, Hydrocortison-17-acetat 0,185 ng/cm3, Reichstein S-17-acetat 0,005 |ig/cm3, Reichstein S-Verbindung 0,040 jig/cm3.

Beispiel 5 Substrat: Hydrocortison

Mikroorganismus: Arthrobacter simplex [A/CC 6946] ß-Cyclodextrin, Geschwindigkeitsteigerung Substrateingabe: Variante 2.

Eine auf festem Nährboden gewachsene Arthrobacter simplex [ATCC 6946] Kultur wird abgewaschen und man inokuliert 51 sterilen Nährboden mit ungefähr 30 cm3 Suspension in einem laboratorischen Fermentor.

Die Zusammensetzung des Nährbodens: 0,3 Gew.-% Glukose, 0,3 Gew.-% Pepton, 0,1 Gew.-% Hefenextrakt, pH = 6,8. Die Kultur wird bei 35 C 240 Drehzahl/Min. Rühren und 0,5 1/1/Min. Lüftung 20 Stunden hergestellt. Mit 11 der Kultur inokuliert man in einem laboratorischen Fermentor 91 sterilisierten Nährboden, deren Zusammensetzung folgende ist: 0,5 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.% Pepton, 0,4 Gew.-% Hefenextrakt, pH = 6,8. Die Kultur wird bei 35 °C, bei 600 Drehzahl/Min. Rühren, und 0,3 Liter/Liter/ Min. Lüftung 18 Stunden lang hergestellt, wonach zur Induzierung der Enzymbildung eine Lösung von 0,5 g Hydrocortison in 50 cm3 Methanol zugegeben wird. Man inkubiert weitere 4 Stunden wonach die Aktivkultur in einen sauerfesten Apparat gepresst wird wo das Medium der Bioumsetzung vorher vorbereitet wurde.

Medium: in die Vorrichtung giesst man 901 Leitungswasser, 1200 g ß-Cyclodextrin, die Vorrichtung erhitzt man auf 100 C und das Medium wird bei dieser Temperatur 20 Minuten sterilisiert und dann auf 35 °C abgekühlt. Man löst 1,0 g 2-Methyl-l,4-naphtochinon und 400 g Hydrocortison in 41,

400 g CaCl2 enthaltenden Methanol auf, die Lösung wird auf steril filtriert und in den Apparat eingeführt. Die Kultur wird eingepresst worauf der Bioumsetzungsprozess in Gang gesetzt wird. Während des Prozesses ist das Steroidsubstrat praktisch 5 in Lösung, das ist deshalb wichtig, weil bei dem Anfang der Produktausscheidung die Gefahr der Gemischkristallbildung aus dem Substrat und aus dem Produkt eliminiert wird.

Umstände der Inkubation der Bioumsetzung:

35 C, 180 Drehzahl/Min. Rühren und 0,6 1/1/Min. Lüftung, io Aufgrund der dünnschichtchromatographischen Analyse unterbricht man die Reaktion bei einer Substratmenge von 2 Gew.-%, die Fermentbrühe wird durch Gegenstromextrak-tion - auf einem Apparat das die Gegenwart von festem Stoff zulässt [z.B. ein Drehscheiben-Extraktor] mit Ethylacetat is zweimal extrahiert. Der Extrakt wird im Vakuum bei max. 40 °C zu einer Konzentration von 8 g/1 eingeengt - ca. 50 1 erstes Konzentrat - mit einem Gemisch von 40 g Aktivkohle und 100 g Celite behandelt, und das Gemisch wird bis zur Kristallisierung - ca. 2 Liter - weiter eingeengt. Die Suspen-20 sion wird auf 5-10 : C gekühlt und nach einigen Stunden filtriert. Die Mutterlauge wird mit einer fünffachen Menge von Diisopropylether ausgefällt, gekühlt und filtriert.

Das Produkt betragt 375 g, dessen Qualität wie folgt charakterisiert werden kann:

25 Reinheit 98 Gew.-%

Trocknungsverlust 1 Gew.-%

Sulfatasche 0,1 Gew.-%

Hydrocortison Rückstand 1,2 Gew.-%

andere Steroide 0,35 Gew.-%

30 Schmelzpunkt 234-236 °C

20

[a]

D

+98c [Dioxan, c = 1 Gew.-%].

Um das ß-Cyclodextrin zurückzugewinnen wird der Ex-

35 trakt mit 1 Liter Cyclohexan 1 Stunde bei 18-20 C gerührt. Der gebildete Rückstand wird filtriert, im ungefähr 1 Liter Wasser suspendiert und das Cyclohexan treibt man unter Kochen [durch Wasserdampfdestillation] aus dem Gemisch. Die wässrige ß-Cyclodextrin-Suspension wird eine Nacht bei

40 5-10 C gehalten, die Kristalle werden filtriert und im Vakuum getrocknet. Man gewinnt 700 g ß-Cyclodextrin zurück, das wieder verwendet werden kann.

Beispiel 6-11

45 Die folgenden mikrobiologischen Umsetzungen wurden analog mit den Beispielen 1-5 unter den in den Beispielen angegebenen Umständen durchgeführt, man verwendet Cyclodextrin zur Intensivierung der erwünschten Reaktionen.

so Beispiel 6

Substrat: Progesteron

Mikroorganismus: Mycobacterium sp. [NRRL B 3805] ß-Cyclodextrin, Konzentrationserhöhung Substrateinsatz: Variante 1.

55 Endprodukt: Androstat-4-dien-4,17-dion

Den Abbau der Seitenkette des Substrats führt man nach der Methode von Marscheck, W.J. Kraychi, S. und Muir R.D. (1972) Appi. Microbiol. 23,72. [durch Steroid] Cyclodextrin Molverhältnis 1:0,2. Der Nährboden enthält 0,5%

60 Na2HP04 • 7H20. Infolge der Gegenwart von Cyclodextrin kann die ohne Cyclodextrin erreichbare 1 g/1 Sitosterin Konzentration unter unveränderter Umsetzungszeit (ca. 170 Stunden) auf 2 g/1 Sitosterin Konzentration erhöht werden.

65 Beispiel 7

Substrat: Progesteron

Mikroorganismus: Ophiobolus herpotrichus ß-Cyclodextrin, vollständige Umsetzung

656 642

Substrateinsatz: Variante 1.

Endprodukt: 21 -Dihydr oxy-progesteron Die Reaktion wird nach der Methode von Meystre et al., Helv. Chim. Acta 37,1548 (1954) durchgeführt.

Steroid/Cyclodextrin Molverhältnis: 1:0,2. Der Nährboden ist Biermaische an welcher der Mikroorganismus 3 Tage kultiviert wird, man gibt dann die acetonische Lösung von Progesteron-Substrat bis zur Erreichung einer Konzentration von 0,25 g/1 Fermentbrühe zu. Ohne Verwendung von Cyclodextrin dauert die Umsetzung weitere 3 Tage und der Substratrückstand ist ungefähr 25%. Wenn 24-30 Stunden nach Anfang der Bioumsetzung Cyclodextrin zum Reaktionsgemisch gegeben wird, wird die Menge des Substratrückstandes wesentlich kleiner.

Beispiel 8

Substrat: 4-Pregnen-17a, 21-dihydroxy-3,2G-dion. (Reich-stein.S)

Mikroorganismus: Curvularia lunata (IFO 49) ß-Cyclodextrin, Beeinflussung des Verhältnisses der Reaktionsprodukte

Substrateintragung: Variante 1.

Hauptprodukt: Hydrocortison

Die Reaktion wird nach der Methode von Kondo, E. und Mitsugi, T., J. Agre. Chem. Soc. Japan 35,521 (1961) durchgeführt. Steroid/Cyclodextrin Molverhältnis: 1:0,3. Ohne Zugabe von Cyclodextrin erhält man in der Bioumsetzung 35-40 Gew.-% 6-ß-Hydroxy-Reichstein S, 15-20 Gew.-% 1 la-Hydroxy-Reichstein-S und etwa 5 Gew.-% 7,14a-Dihy-droxy- und 5 Gew.-% 6-ß-14 a-Dihydroxy-Reichstein-S. Wenn in der 0. Stunde der Bioumsetzung in dem obigen Verhältnis ß-Cyclodextrin zu dem Gemisch gegeben wird kann das Verhältnis von 1 la-Hydroxy-Reichstein-S (epi-Hydro-cortison) im Produkt auf das Doppelte erhöht werden.

Beispiel 9 Substrat: 16a-Methyl-Reichstein-S Mikroorganismus: Curvularia lunata (ATCC 12017) ß-Cyclodextrin, Verbesserung der Effektivität der Umsetzung

Substrateinsatz: Variante 1.

Endprodukt: 1 lß-17a, 21-Trihydroxy-16 a-methyl-pregn-4-en-3,20-dion ( 16a-Methyl-hydrocortison)

Die Reaktion wird nach der Methode von Canonica, L. et 5 al. Gass. Chim. Ital. 93,368 (1963) durchgeführt. Molverhältnis von Steroid/Cyclodextrin: 1:1. Ohne Verwendung von Cyclodextrin entsteht das Hauptprodukt in einer Menge von ca. 55 Gew.-%. Wenn in der 0. Stunde der Bioumsetzung in dem obigen Verhältnis ß-Cyclodextrin zu dem Reaktionsge-10 misch gegeben wird, steigert sich die Proportion des Hauptproduktes um 5-10%.

Beispiel 10

Substrat: 3ß,17a, 21-Trihydroxy-pregn-5-en-20-on-21-" acetat

Mikroorganismus: Flavobacterium dehydrogenans (ATTCC 13930)

ß-Cyclodextrin, Konzentrationserhöhung 2c Substrateinsatz: Variante 1 Endprodukt: Reichstein-S

Die Reaktion wird nach US-PS 3 009 936 durchgeführt. Steroid/Cyclodextrin Molverhältnis: 1:0,3. Mit Cyclodextrin kann die Konzentration auf das Doppelte gesteigert werden.

25

Beispiel 11

Substrat: Lanatozid-A (Digitalis Glucosid) Mikroorganismus: Streptomyces purpurascens ß-Cyclodextrin, Konzentrationserhöhung 3C Substrateinsatz: Variante 1.

Die Reaktion wird nach der HU-PS 176 250 durchgeführt. Lanatosid-A/Cyclodextrin Molverhältnis: 1:1. Ohne Verwendung von Cyclodextrin gibt man zu einer 2-tägigen Kultur von Streptomyces purpurascens eine Lösung von La-35natosid-A in organischen Lösungsmitteln in einer Konzentration von 0,5 g/1. Wenn zu dem Reaktionsgemisch nach 2 Tage dauernder Kultivierung in der 0. Stunde der Bioumsetzung unter Einhaltung des obigen Verhältnisses ß-Cyclodextrin gegeben wird, kann die Konzentration des Substrats auf 2 g/1 erhöht werden.

C