DE3235884A1

DE3235884A1 - Verfahren zur intensivierung der mikrobiologischen umwandlung von steroidverbindungen

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Publication number: DE3235884A1
Application number: DE19823235884
Authority: DE
Inventors: Geb Czurda Balazs; Istvan Bartho; Ilona Dipl Ing Chem Habon; Gabor Dipl Chem Hantos; Geb Szoeke Stadler; Jozsef Dipl Ing Chem D Szejtli; Maria Dipl Ing Chem Trinn; Nagy Geb Cserey Pecha Udrvardy; Zsuzsa Dipl Ing Chem Vida
Original assignee: Chinoin Gyogyszer es Vegyeszeti Termekek Gyara Zrt; Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Chinoin Private Co Ltd; Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1981-09-28
Filing date: 1982-09-28
Publication date: 1983-10-06
Also published as: IT8223453A0; FR2513656B1; ES516007A0; DK422182A; DE3235884C2; SE452777B; BE894501A; ES8400146A1; IT1157322B; GB2108965A; US4528271A; FR2513656A1; JPS5867194A; CS239932B2; CH656642A5; GB2108965B; ATA357182A; JPH047197B2; SE8205506L; SE8205506D0

Description

ttpl-Chem.IA-PEtER⁴WAGBR* "* " **" 323 5884

Patentanwalt München &Mo««Mr; epr -^s-

Τβίβίοο 223782 ^ _

RicAAe f GtUeQK V^^&^^^ft G-^ar &· I- i^^d

inC/n GuS0^l/i?e/- <z± Vtaueiidf-'/ Termekek Guc.ro. R₁T.

VERFAHREN ZUR INTENSIVIERUNG DER MIKROBIOLOGISCHEN UMWANDLUNG VON STEROIDVERBINDUNGEN

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Intensivierung der mikrobiologischen Umwandlung von Steroidverbindungen durch die Verwendung von Cyclodextrin-Zusatzstoff.

Bei der Herstellung von Steroidverbindungen kommt es oft vor, daß man eine Stufe der mehrstufigen Synthese durch die jirearwendung einer spezifischen Funktion eines Mikroorganismus Bb. Die Mikroorganismus-Zellen, die aus den. Zellen extrahierten Enzyme, die eventuell fixierten Zellen oder die fixierte^ Enzyme verwendenden Biokon-Versionsprozess j$e&«£f in einem wäßrigen Medium pe^. Obwohl die enzymatische Reaktion in diesem Medium sicher abläuft, ist gleichzeitig ein Nachteil im Vergleich mit den

(AficCJK fet Sihf^y

Reaktionen in organischen Lösungsmitteln/; düß "Tue Steroide im Wasser schlecht lösbar sind. Die Wasserlöslichkeit einer Reihe von Steroidverbindungen ist sehr schwach, also die Konzentration ist niedriger als diejenige Konzentration, bei welcher die Biokonversionsprozesse noch ökonomisch durchführbar sind. In den bekannten Verfahren ist ein bestimmter Teil des Substrats bzw. des Steroidproduktes während der Reaktion in fester Form anwesend. Die Auflösung des Substrats in der festen Phase kann die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmen, im Fall von heterogener Teilchengröße wird die Geschwindigkeit der Auflösung mit Erhöhung der Durchschnittgröße der nicht aufgelösten Teilchen immer niedriger. Es kann vorkommen, daß wegen der

A 2661-67 KY

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Auflösungsprobleme die Reaktion vor der Erreichung der gewünschten Konversion zum Stillstand kommt.

Mehrere Verfahren wurden zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit des Substrat-Steroids oder der Auflösung-Geschwindigkeit des Produktes ausgearbeitet.

Gemäß GB-PS 1 211 356 wird zur Erreichung eines homogenen, zerkleinerten Substrats das in die Reaktion eingeführte Steroid vorher mechanisch dispergiert. Nach US-PS 4 124- 607 wird das Substrat von Feinkorngröße in einer separaten Stufe hergestellt, indem man die in einem organischen Lösungsmittel hergestellte Steroidlösung in Wasser emulgiert und das Lösungsmittel abdestilliert· In mehreren Verfahren wird das Steroid in einem organischen Lösungsmittel aufgelöst, und die Ausscheidung erfolgt unmittelbar in dem Biokonversionsprozeß. Nach HU-PS 149 678 wird das zur Eintragung des Substrats verwendete Lösungsmittel (Pyridin, Essigsäure)^- vor dem ,Anfang der Biokonversion neutralisiert, und die Löslichkeit wird bei Alkoholen durch die Zugabe von Alkali-erdmetall-chloriden verbessert.

Gemäß GB-PS 1 083 204- wird die Löslichkeit des Steroid-Substrats in dem Reaktionsmedium durch die Zugabe eines organischen Lösungsmittels, zweckmäßig Dimethylsulfoxyds verbessert, das schon bei dem Einsatz oder nach dem Einsatz verwendet wird. Nach einer anderen Lösung wird die Wasserlöslichkeit des Steroidsubstrats mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gesichert, in diesem Fall wird d^er schnelle Stoffüber^riwj durch die große Grenzjsnefeeajflache der gebildeten Emulsion ermöglicht (s. Biotechn. Bioeng.

_21, 39 Zl97^?) · In der pharmazeutischen Industrie verwendet man oft Solubilisierungsmittel. So z. B. erhöht man^. gemäß DE-0S 1 543 431, erheblich die Androstendion-Ausbeute

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-S-

durch die Zugabe von Solubilisierungsmitteln bei der Herstellung der Verbindung aus 4~Col^esten-J-on.

Die bekannten lösungen vermindern zwar die mit der schwachen Wasserloslichkeit der Steroidsubstrate verbundenen Nachteile, sind aber nicht ökonomisch oder zeigen ungünstige Wirkungen auf das System. Falls z. B. das Substrat in mikrokristalliner Form hergestellt.wird, dies bedeutet mehr Arbeitsvorgänge in der technologischen Heine und verursacht einen Stoffverlust· Nach anderen Beaobachtungen wird der Mikroorganismus während einer längeren Zeit durch das organische Lösungsmittel in der zur bedeutenden Erhöhung der Wasserloslichkeit der Steroide nötigen Menge geschädigt (Steroids, 12, 525 /1968/).

Wenn man Solubilisierungsmittel verwendet, steigert sich nach Erfahrungen die Schaumbildung, und dieS₁ hindert eine genügende Lüftung des Biokonversionssystems.

Das Ziel der Erfindung war die Ausarbeitung eines Verfahrens das einerseits die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren vermindert und gleichzeitig die Intensivierung der Reaktion bei der mikrobiologischen Umwandlung der Steroide sichert.

Es wurde gefunden, daß ^t±ej Cyclodextrine in Biokonversionssystemen zur Verbesserung der Wasserloslichkeit der Steroidmoleküle, bei ^festen Kuckstande-s zur Erhöhung der Lösungsgeschwindigkeit und dadurch zur erheblichen ^ der Biokonversionsreaktion, weiterhin in einem gegebenen System zur Eliminierung der eine weitere Reaktion hemmenden Produkthemmung und in bestimmten Fällen zur Blockierung bestimmter Reaktionen durch die einiger sterischeji Gruppen des Steroidmoleküls vorteilhaft verwendet werden können. Die <*.'- und ß-Cyclodextrine bzw. deren Gemische wirken katalytisch in einer Ester-Hydrolyse. Wenn die

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Mikroorganismen zwei oder mehrere Funktionen aufweisen, so können die selektiven Wirkungen das Verhältnis der Reaktionsprodukte beeinflussen. Die obigen Wirkungen werden J zusammenfassend als "Intensivierung" bezeichnet·

Erfindungsgemäß wird die Reaktion der mikrobiologi schen Umwandlung der Steroide so intensiviert, daß man das Steroid-Substrat in Gegenwart von «c-, ß- oder Jp-Cyclo-

t»"h 6 kn. (Kwi frwti pot Cv cJltw qftvojy'

dextrin oder fäe&es} Gemisch (timsetzt und gegebenenfalls nach der Umwandlung das Cyclodextrin aus dem Gemisch gewinnt.

ik in for /»n fpl$tntit*. Unter "Cyclodextrin"^ verstehg v*-, ß- oder T-Cyclodextrin oder ein beliebiges Gemisch derselben. Vor der mikrobiologischen Umwandlung oder zu deren Beginn oder in.einer bestimmten Phase der mikrobiologischen Kohversion pz&y ^man ^auf ein Mol Substrat 0,2-3 Mol Cyclodextrin zu.

Nach einer Ausführungsmethode wird das entsprechende Cyclodextrin vor dem Einsatz des Substrats in das Biokonversionsmedium^geführt. Nach einer anderen Ausführungsmethode wird das Substrat mit dem Cyclodextrin umgesetzt, und der erhaltene Substrat-Inklusionskomplex^- bzw. dessen wäßrige Lösung oder Suspension wird zum Biokonversionsmedium gegeben. Nach einer weiteren möglichen Ausführungsform wird das Cyclodextrin allein oder in Form eines mit dem Substrat gebildeten Inklusionskomplexes, erwünschtenfalls eine wäßrige Lösung oder Suspension des Inklusionskomplexes während der mikrobiologischen Reaktion, üblicherweise nach Erreichung von 30-50 % Konversion zugegeben. Die Lösung des Cyclodextrins oder des Cyclodextrins und des Substrat-Inklusionskomplexes können vor der Eintragung in das Biokonversionsmedium sterilisiert werden oder sie können mit dem Biokonversionsmedium zusammen sterilisiert werden. Cyclodextrin kann aus dem wäßrigen Biokonversionsmedium so

Ej₁ _

zurückgewonnen werden, daß man das Steroid mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und das Cyclodextrin durch die Zugabe eines dessen Löslichkeit stark vermindernden Lösungsmittels, bevorzugt Hexans.aus dem Raffinat ausfällt und durch Filtrieren isoliert und das Cyclodextrin jsa?-f ©ewünschtenfalls trocknet·

Die Intensivierung der mikrobiologischen Umwandlung der Steroide gemäß der Erfindung ist sehr vorteilhaft, da diese Wirkung in der Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und in der Verminderung der Reaktionszeit Jbc heizbar wird \ die Konzentration des Substrats in dem Medium kann erhöht werden, die Produkthemmung kann eliminiert werden^)von den möglichen Reaktionen kann die gewünschte Reaktion katalysiert werden.also die mikrobiologische Selektivität kann gesteigert werden.

Die Herstellung der' Oyclodextrin-Steroidsubstrat-Inklusionskomplexe kann nach mehreren Varianten durchgeführt werden. Nach einer Variante ist das Medium der Biokonversion .eine wäßrige Lösung entsprechender Konzentration des Cyclodextrins, zu welcher das Substrat-Steroid gegeben wird, und der Inklusionskomplex wird der Gleichgewichtslage entsprechend gebildet (Variante 1).

Nach einer anderen Methode wird um den Einsatz des Steroids in das System zu vermeiden, in einem separaten Tank die wäßrige Lösung des Substrat-Oyclodextrin-Inklusionskoraplexes hergestellt, die durch Filtrieren sterilisiert ^ und so zum Biokonversionsmediura gegeben wird (Variante 2). In Gegenwart von etwas Wasser ist nach der Erfahrung das Gemisch von Cyclodextrin und von Steroid umkristalli*- sierbar, ein Steroid-Cyclodextrin wird gebildet, das bei einem Biokonversionsprozeß, der keiner Sterilisierung bedarf, in fester Form verwendet werden kann (Variante 5).

BAD

-Jer-

Die Cyclodextrine sind Glucose-Polymere von natürlichem Ursprung, die aus 6, 7 oder 8 Glucose-Einheiten bestehende !eingeschlossene Makroringe sind. Ihre Struktur wird durch die spezielle Anordnung der Hydroxylgruppen charakterisiert. Alle sekundären Hydroxylgruppen sind an dem

* einen Rand des Ringes zu finden, wcfgegen die primären Hydroxylgruppen an dem anderen Rande des Ringes aufzufinden sind. Daraus folgt, daß die äußere Oberfläche des Ringes hydrophil ist", daher sind die Cyclodextrine wasserlöslieh.

Die innere Seite des Ringes ist hydrophob. Die Cyclodextrine bilden mit Molekülen von entsprechender Größe und Form Inklusionskomplexe. Das aus 6 Glucopyranose-Einheiten bestehende Cyclodextrin ist cC-Cyclodextrin, ß-Cyclodextrin wird aus 7 Glucopyranose-Einheiten aufgebaut, und γ -Cyclodextrin besteht aus 8 Glucopyranose-Einheiten. Nach der Bindungsart werden Cyclodextrine auch Cycloamylose genannt. Komplexe von Steroidmolekülen mit Cyclodextrin wurden schon während de mewerer pharmakolo-

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gischejn Wirkstoffe und mehrerer solubilisierendejl Stoffe unteraucht (Lech und Pauli: J. Pharm. Sei. ^, 32 ΖΪ9667)· Im Fall von Testosteron und Cortisonacetat wurden die wahrscheinlichen stoechiometrischen Verhältnisse der Komponenten festgestellt. Durch die Solubilisierung wollte man die Resorption der pharmazeutischen Wirkstoffe beeinflussen.

Die Cyclodextrine wurden aber nicht zur Intensivierung der Reaktion bei der mikrobiologischen Umwandlung .pier Steroid-Substraterjverwendet. Es wurde festgestellt, daß der Komplex von Steroid-Snbstrat hiJS Cyclodextrin in einem wäßrigen Medium dissoziiert, und der Komplex fh&^ in einem Biokonversionssystem in einem dynamischen Gleichgewicht mit den freien Steroid- und Gyclodextrin-Molekülenvof.

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In einem festen, einj?nf suspendiertest Steroid enthaltenden Biokonversionssystem ist die jeweilige Konzentration des für das Enzym erreichbaren gelösten Anteils immer von der Losungsgeschwindigkeit des die lffe

Substrats und der Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion Wenn die Auflösung ein langsamerer Prozeß ist,

so bleibt während der Reaktion die Konzentration der Steroidlösung weit unter dem Sättigungswert und die Reaktion wird dadurch im Sinne des Grundgesetzes der enzymatischen Reaktion wesentlich langsamer. Das Substrat setzt sich aus dem Cyclodextrin-Inklusionskomplex praktisch augenblicklich frei. Die Menge des gelösten Substrats bleibt in diesem Fall während des ganzen Prozesses ganz bis zum Ende des Prozesses auf dem Sättigungswert, und so wird die maximale Konversionsgeschwindigkeit der gegebenen Enzymreaktion gesichert.

Bei anderen Steroid-Umwandlungsreaktionen kann das Produkt nach dem sogenannten Endprodukthemmungsmechanismus die Reaktion verlangsamen oder j, wenn es an das Enzym oder die Oberfläche der Zelle gebunden ist. Wegen der unterschiedlichen Struktur des Substrats und der Endproduktmoleküle bilden diese mit dem Cyclodextrin Komplexe von mehr oder weniger f Stabilität, } wurden &e günstige Reaktions}s»s4i

V£ie

gefunden, unter welchen das sonst) Endprodukthemmung verursachende Steroid ιΙΓ)Cyclodextrin-Komplex übergeführt wurde. ohne die Zugänglichkeit des Substrat-Steroids verschlechtert zu haben. Wenn die Stabilität des Substrat-Cyclodextrin-Komplexes die Stabilität des Endprodukt-Oyclodextrin-Komplexes übertrifft, dann kann durch die Verwertung der Komplexbildung die Endprodukthemmung so aufgehoben werden, daß man das Cyclodextrin nur nach einem gewissen

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t i>i Fortschritt der Reaktion einsetzt, wenn dea? Überschuß des Produktes im System nachgewiesen kann.

In weiteren Untersuchungen wurde auch festgestellt» daß die enzymatische Hydrolyse peaj· veresterten Steroidmolekülen durch die Herstellung eines entsprechenden <*- und/oder ß-Cyclodextrin-Komplexes beschleunigt werden kann· Dies kann vermutlicherweise durch die katalytische Wirkung erklärt werden, die aus der Struktur des Cyclodextrins folgt.

Bei verschiedenen Biokonversionsumwandlungen wurde auch beobachtet daß die Cyclodextrin-Komplex-Bildung andere Verhältnisverschiebungfverursachen kann; so kann im Fall eines entsprechend stabilen Komplexes durch die Verminderung der Zugänglichkeit des Moleküls die Geschwindigkeit einer Reaktion gegebener Konfiguration vermindert oder .die Reaktion sogar eliminiert werden.

Die^ Inklusionskomplexe bildende Eigenschaft und deren Wirkung au/ die Intensivierung der Biokonversionsreaktion ist -auf did Steranverbindungen allgemein gültig. [m feheu den

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,[m feheu den ,
cfcf werden pie Einzelheiten des Verfahrens an Beispielen von Oestran-, Androstan-, Pregnan-, Cholestan-, Stigmastan- und N or-V erb indungen demonstrier^ ohne den Schutzumfang auf die obigen Beispiele zu

Beispiel 1

Substrat: Hydrocortison

Mikroorganismus! Arthrobacter simplex (ATCC 694-6) <* -Cyclodextrin, Geschwindigkert/erhöhung Sub s tr at einführung: 1. Variante Eine Agarkultur von Arhtrobacter simplex (ATCC 694-6] wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und man inokuliert nrit 5 cnr dieser Suspension den folgenden Nährboden:

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-Al"

s C Glucose: 0,3 %, enzymatisch hydroIysierte^ Casein 0,5 ^, Hef eiiextrakt: 0,1 ^, pH=6,7· Man ergänzt die Lösung mit Wasser auf 100 cnr und sterilisiert in einem 500-cm - Erlenmeyer-Kolben. Man kultiviert bei 32 ⁰C an einer Flach-Rüttelmaschine von einer Hubzahl von 230/18 Stunden, man gibt 5 mg Hydrocortison, in 0,5 cm Methanol gelöst, zur Kulturbund das ^wünschte Enzym wird induziert. ,Die Induktion dauert 3 Stunden, die unter gleichen f wie alle Kultivierungf%urchgeführt wird. 50 cm der delta-1-fDehydrogenas^-Enzym enthaltenden Kultur wird in einen 950 car steriles Wasser enthaltenden 3~!""Erlenmeyer-Kolben vorgelegt, und die Konversion wird mit der so erhaltenen 20-fach verdünnten Aktivkultur durchgeführt. Das eingesetzte Substrat bejw&g^ 2 g Hydrocortison, der Einsatzwfolgt durch . die Verwendung des obigen Zusatzes f olgenderjW-eis«}:

Man gibt 20 g oC-CycIodextrin zur Kultur, nach deren

7.

Auflösung löst man das Hydrocortison im 20 cm Methanol auf, • wobei d£if Methanol 10 Gew.# CaCIp enthält. Die Lösung gibt man zu der das oC-Cyclodextrin enthaltenden Kultur.

Die Umwandlung erfolgt bei 32 ⁰C an der oben erwähnten Rüttelmaschine<^ Stunden lan^. Die Gegenwart des oC-Cyclodextrins verhindert bei der Eintragung des Substrats in das wäßrige Medium dessen Ausscheidung, die Umwandlung des aufgelösten Substrats erfolgt mit einer Igröflerenul durch die Enzymaktivität bestimmten größeren Geschwindigkeit als in dem System, das das Substrat in Form einer Suspension enthält. Die Konversionszeit des obigen Substrats ohne_t.( dextrin beträgt 8 Stunden. Am Ende der Konversion ßr^ der Steroidgehalt der Fermentbrühe: 1920 /Ug/cnr Prednisolon, 40/Ug/cnr 20-/3 -Hydroxy-prednisolon und 8 /Ug/cm^ Hydrocortison.

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-JsO-

Beispiel 2

Substrat: 17<< -Methyl-testosteron (Androstan-De~

rivat)

Mikroorganismus: Arthrobacter simplex (A2JCC 6946) ß-Cyclodextrin, Aufhebung der . Endprodukthemmung Substrateinsatz: Variante 1· Die nach Beispiel 1 hergestellte und induzierte Kultur wird auf das Fünffache verdünnt und zur delta-1-De-■ hydrbge^ierung von Methyl-Testosteron verwendet indem man zur Ingangsetzung der Biokonversion eine Lösung von 1,0 g Methyl-Testosteron in 10 cnr Methanol in das System^rührt. Die Umwandlung wird dünnschichtchromatographisch beobachtet. Das eingetragene Substrat scheidet sich im System aus und wird während kontinuierlichen Auflösung dehydrpge-f -j Bei Erreichung von j£ca. 400 /Ug/cm^p delta-1-MethyliTestosteron gibt man zum System 6,0 g ß-Cyclodextrin. Der Zusatz bildet einen Komplex aus dem entstehenden Produkt; das ist deshalb wichtig, weil sonst die enzymatische Reaktion wegen des Übergewichts des Produktes aufgrund des bekannten Endprodukthemmungs-mechanismus langsamer und schließlich überhaupt nicht fortgesetzt f«ica. Die Komplexbildungsneigung des ß-Cyclodextrins gegenüber dem

,Wie. Produkt ist ^zOa. fünffach so intensiv fft-f die gegenüber dem Substrat. Der Einsatz erfolgt in der zweiten Stunde der Konversion und die Inkubation wird aufgrund von dünnschichtchromatographischen Untersuchungen in der 6. Stunde eingestellt.

Der Steroidgehalt der Fermentbrühe am Ende der Umwandlung beträgt: 970 /Ug/cnr delta-1-Methyl-Testosteron, 6 /Ug/cm Methyl-Testosteron. Ohne die Zugabe von Cyclodextrin wird die Reaktion bei einer liückstand-Substrat-Konzentration von 100-120 /Ug/cnr unterbrochen/

- χι -

Beispiel 3

Substrat: 5-Pregnen-3ß _>17e<_>21-triol-20~on-21-

acetat /acylierte)? Pregnen-Derivat/ Mikroorganismus: Flavobacterium lucecoloratum B 93247

ff -Cyclodextrin: Variante 3·

Mit einer fkultur von Flavobacterium

lucecoloratum ^KJIB 93247 inokuliert man 200 cnr Nährboden

tintr* j·
±a 750-cnr-Erlenmeyer-Korben. Die Kultivierung führt man bei 30 ⁰C 20 Stunden an einer FlachfrrüttelfrMaschine von einer Hubzahl von 230 durch. Mit der Kultur inokuliert man 5 1 sterilen Nährboden von gleicher Zusammensetzung in einem laboratorijbehgn Jjermentor. j&änej Zusammensetzung: 1,0 Gew.% Hefe^textrakt. 0.1 Gew.# Kalium-phosphat, 0,4- Gew.% Dikaliumphosphat. Zum inokulierten Nährboden gibt man 250 mg Substrat, ^w^gelöst in 1,5 cnr Dimethylformamid. Die Lösung wird steril^filtriert. Die Gegenwart des Substrats ermöglicht die Bildung der nötigen ■ Enzyme . während des Wachstums der Kultur. Nach 12 Stunden Kultivierung ist die Bakterienzahl und die Enzymaktivilfat zur Ingangsetzung der Biokonversion geeignet, und man gibt nun 100 g Pregnen-3$17 eC _V21-trihydroxy-20-21-acetat zur Kultur, das mit Jf-Cyclodextrin vorbehandelt wurde. Die Behandlung erfolgt folgenderweise: ,

Man homogenisiert 100 g Substrat mit gleichen. Menge jtfon ο -Cyclodextrin und 200 cnr Wasser 20 Minuten. Während dieser Zeit bildet ein Io--. Anteil des Substrats

/eickf ^l mit dem Cylodextrin einen löslichen Komplex. Die Suspension wird in den Fermentor^geführt und man inkubiert weitere 11 Stunden, bis das Substrat verbraucht Jw*3Pd. ffew «idM-geH, 7 j un\cf · · ' der Inkubation in, dem JLaborator4· fermentor:

30 C₁ Rühren mit 420 r, i<üftungs f fle-

schwindigkeit von 0,5 l/l/Minute. Die Umwandlung wird durch Dünnschichtchromatographie beobachtet, pe^ Steroidgehalt der Fermentbrühe am Ende der Konversion: 9020 vug/cnr Reichstein S Verbindung: 4~Pregnen-17 <*,21-dihydroxy-3,20- £dion, 30 /Ug/cnr Substrat. Ohne Cyclodextrin könnte die Biokonversion erst mit einer Menge von 10 g/l Substrat günstig durchgeführt werden.

Beispiel 4

Substrat: 4-Pregnen-17 «* ,21-dihydroxy-3,20-dion-

fl7-acetat /acyliertes Corticosteroide/ Mikroorganismus: Curvularia prasadii /IMI 714-75/ β -Cyclodextrin, Katalyse der Lsterhydrolyse Substrateintragung: Variante 1. λ / .. Mit einer Suspension von Sporen, die von einer kultur von Culvularia prasadii ^TMI 71475/ ^ab~ gewaschen wurden, inokuliert man 100 ciir Nährboden in einem 500~cur-~Erlenmeyer-Kolben. pi«J Zusammensetzung des Nährbodens: 1,0 Gew..# Sojamehl, 0,3 Gew.% Maismarmelade, 0,3 Gew. Maisstarke, 0,5 Gew.# Malzextrakt, pH=6,2. Die Kultur

wird bei 26 ⁰C 24 Stunden hergestellt. 10 cm^ der VferoleK

Kultur jwi3?4 zur Inokulierung von 100 cnr NShrboden in einem gleichgroßen Kolben verwendet. Der NShrboden enthält

keinen Malzextrakt aber

hat sonst die gleiche Zusammen-

se.tzung.wie oben beschrieben. Der Mikroorganismus wird bei 26 ⁰C ehüttlt nd W iy Z h hde

26 ⁰C geschüttelt und so Wtpeh priy ■ Zur noch wachsenden, 16 Stunden alten Kultur gibt man das umzuwandelnde Substrat. Das Substrat ist 4-Pregnen-17<*ζ ,21-dihydroxy-3,20-dion- -acetat, aus welchem 0,12 g.in 3 cnr Methanol gelöst, zum System gegeben jwü»«!. Man inkubiert weiter, wonach die Kultur die Verbindung in Umstellung hydroxyliert, wobei Hydrocortison-17-acetat entsteht. In der 20. Stunde der

durch Dünnschichtchromatographie beobachtete Konversion betragt das Rückstand-Substrat 10 Gew.^. Man gibt dann Q »96 g A-Cyclodextrin zur g). Das Cyclodextrin wirkt katalytisch auf die enzymatisch^ Hydrolyse der Acetylgruppe des Steroidmoleküls, so jw*rd während der

übrigbleibenden Zeit der Bipkonyersion neben der langsam werdenden Hydroxylierung dieyffcefylgruppe ifa. Nach weiteren ca. 3 Stunden kann der Prozeß unterbrochen werden. ]be^ Steroidgehalt der Permentbrühe am Ende der Konversion: Hydrocortison ^4-Pregnen-ll /5-,17 <*-^l-trihydroxyff3,2O-dion7 0,730 mg/cnr , Hydrocortison-17-acetat 0,185 /Ug/cm^, Reichstein S-17-acetat 0,005 /Ug/cm^, Reichstein S-Verbindung 0,040 /Ug/cm .

Beispiel 5
j Substrat: Hydrocortison

Mikroorganismus: Arthrobacter simplex ^A/OG 6946/ P-Cyclodextrin, Geschwindigkeitsteigerung Substrateingabe: Variante 2.

Eine auf festem Nährboden gewachsene Arthrobacter— simplex-^ATCC 6946/-KuItür wird abgewaschen und man inokuliert 5 1 sterilen Nährboden mit ungefähr 30 cnr Suspension in einem laboratorii|ermentor.

Ρ±ή Zusammensetzung des Nährbodens: 0,3 Gew.% GIukose, 0,3 Gew.^ Pepton, 0,1 Gew.^ Hefejrextrakt, pH=6,8. Die Kultur wird bei 35 ⁰C 240 rv Rühren und 0,5 1/1/Min. lüftung 20 Stunden hergestellt. Mit 1 1 der

i, KmSfaboratoriermentor

9 1 sterilisierten Nährboden, deren Zusammensetzung folgende ist: 0,5 Gew.% Glucose, 0,5 Gew.% Pepton, 0,4 Gew.# HefeXextrakt, pH=6,8. Die Kultur wird bei 35 ⁰C, bei 600 \ Rühren^ und 0,3 Liter/Liter/Min, lüftung 18 Stunden lang hergestellt, wonach zur Induzierung der En-

zymbildung eine Lösung von O_r5 g Hydrocortison in 50 cnr Methanol zugegeben wird. Man inkubiert weitere 4 Stunden wonach die Aktivkultur in einen saue]rfesten Apparat gepre ßb wird, wo das Medium der Biokonversion vorher vorbereite

worden vv^r, ....

iTM' Medium: in die Vorrichtung man 90 1 Lei-

tungswasser^ 1200 g . β-Cyclodextrin, die Vorrichtung erhitzt man auf 100 ⁰C. und das Medium wird bei dieser Temperatur 20 Minuten sterilisiert und dann auf 35 °C abgekühlt. Man löst l»0 g 2-Methyl-l,4-naphtochinon und 4-00 g Hydrocortison in 4 I^ 400 g CaCIp enthaltendem Methanol auf, die Lösung wird fatri| steril filtriert und in dj*g Apparat eingeführt. Die Kultur wird eingepreßt, worauf der Biokonversionsprozeß in Gang gesetzt wird. .Während des Prozesses ist das Steroidsubstrat praktisch in Lösung; das ist deshalb wichtig, weil bei dem Anfang der Produktausscheidung die Gefahr der eeWischkristallbildung aus dem Substrat und aus dem Produkt eliminiert wird.

|ffmnfrnnrlr( der.Inkubation der Biokonversipn:

35 ⁰C, 180 ^roHoahl/Min^ Rühren und 0,6 1/1/Min. lüftung. Aufgrund der dünnschichtchromatographischen Analyse unterbricht man die Reaktion bei einer Substratmenge von 2 Gew.^, die ffermentbrühe wird durch Gegenstromextraktion - auf eine/d»

•Vorr/t/vfivw·, (Kit qW-fir-iiU _ '

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•Vorr/t/vfivw·, (Kit qW-fir-iiU _

a die Gegenwart von festem ί&έθ£ί zul'asst /z. B« ein Drehscheiben-Extraktor/ mit Ethylacetat zweimal extrahiert. Der Extrakt wird im Vakuum bei max. 40 ⁰C ^fpeine^ Konzentration von 8 g/l eingeengt - ca. 50 1 erstes Konzentrat -. mit einem Gemisch von 40 g Aktivkohle und 100 g Celite behandelt, und das Gemisch wird bis zur Kristallisierung - ca. 2 Liter - weiter eingeengt. Die Suspension wird auf 5-10 ⁰C gekühlt und nach einigen Stunden filtriert. Die

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Mutterlauge wird mit 4i»ep fünffachen Menge j^esj Diisopropyl-

ether ausgefSllt, gekühlt und filtriert.

Die Hem.}e «es- Produkt betragt 375 g, dessen Qualität wie folgt charakterisiert werden kann:

Reinheit 98 Gew.#

Trocknungsverlust 1 Gew. %

Sulfatasche 0,1 Gew. #

Hydrocortison-Rückstand 1,2 Gew.JIi

andere Steroide 0,35 Gew.#

Schmelzpunkt 234-236 ⁰C

/f*/?⁰= +98° /Dioxan, c=l Gew.

Um das Q-Cyclodextrin zurückzugewinnen, wird der Extrakt mit 1 Liter Cyclohexan 1 Stunde bei 18-20 ⁰O gerührt. Der gebildete Rückstand wird filtriert, in ungefShr 1 Liter Wasser suspendiert, und das Cyclohexan treibt man unter Kochen ,/durch Wasserdampfdestillation/' aus dem Gemisch. Die wäßrige ß-Cyclodextrin-Suspension wird eine Nacht bei 5-10 ⁰C gehalten, /'Sie Kristalle werden filtriert und im Vakuum getrocknet. Man gewinnt 700 g /3-Cyclodextrin zurück, das wieder verwendet werden kann.

Beispiele 6-11

Die folgenden mikrobiologischen Konversionen wurden analog fey§ den Beispielen 1-5 unter den in p^^Beispielen angegebenen jjfaictflCnde^i durchgeführt; man verwendet Cyclodextrin zur Intensivierung der erwünschten Reaktionen.

Beispiel 6

Substrat: j £i~h> sfrerfH, Mikroorganismus: Mycobacterium sp. ^pRRL B ß-Cyclodextrin, Konzentrationserhöhung Substrateinsatz: Variante 1. Endprodukt: Androsta^-4—dien-4,17-dion Den Abbau der Seitenkette des Substrats führt man

- danach der Methode von Marscheck, W.J. Kraychi, S. und Muir R.D. (1972) Appl. Microbiol. 2J5, 72. f Sieroid/Cyclodextrin-Molverhältnis 1:0,2. Der .Nährboden enthält

0,5 % Na₀HPO,,. 7H_o0. Infolge der iH* von-Cyolo-

i ihb

,5 % ₀, 7_o g y dextrin kann die ohne Cyclodextrin erreichbarefTÜ/l Sitosterin e unveränderter Konversionszeit (ca. 170 Stunden) auf 2 g/l Sitosterin fconeionfrrgtioi^ erhöht werden.

Beispiel 7

Substrat: Progesteron

Mikroorganismus: Ophiobolus herpotrichus

ß-Cyclodextrin, vollständige Konversion Substrateinsatz: Variante 1. Endprodukt: 21-Dihydroxy-progesteron

Die Reaktion wird nach der Methode von Meystre et al., HeIv. Chim. Acta J^, 1548 (1954) durchgeführt.

Steroid/Cyclodextrin-Mo!verhältnis: 1:0,2. Der Nährboden ist Biermaische saa welcher der Mikroorganismus 3 Tage kultiviert wird! man gibt dann die keeto Lösung von Progesteron-Substrat^bis zur Erreichung einer Konzentration von 0,25 g/l Fermentbrühe zu. Ohne Verwendung von Cyclodextrin dauert die Konversion weitere 3 Tage, und der Substratrückstand ist ungefähr 25 #. Wenn 24-30 Stunden nach Anfang der Biokonversion Cyclodextrin zum Reaktionsgemisch gegeben wird, wird die Menge des Substratrückstandes wesentlich kleiner.

- 4S*

Beispiel 8

Substrat: 4-Pregnen-17 * »21-dihydroxy-3»20-dion·

(Reichstein-S)

Mikroorganismus: Curvularia lunata (IFO 49) β-Cyclodextrin, Beeinflussung des Verhältnisses der Reaktionsprodukte
Substrateintragung: Variante 1. Hauptprodukt: Hydrocortison

Die Reaktion wird nach der Methode von Kondo, E. und Mitsugi, T., J. Agrc. Chem. Soc. Japan ^, 521 (1961) durchgeführt. Steroid/Cyclodextrin-Molverhältnis: 1:0,3· Ohne Zugabe von Cyclodextrin erhält man Jt^ der Biokonversion 35-40 Gew.% 6-ß-Hydroxy-Reichstein S, 15-20 Gew.# cK-Hydroxy-Reichstein-S und etwa 5 Gew.# 7,14<*-Dihydroxy- und 5 Gew.% ö-ß-l^oc-Dihydroxy-Reichstein-S. Wenn in der 0. Stunde der Biokonversion in dem obigen Verhältnis ß-Cyclodextrin zu dem Gemisch gegeben wird, kann von 11 ot.-Hydroxy-Reichstein-S (epi-Hydrocortison) im Produkt auf das Doppelte erhöht werden. 20

Beispiel 9

Substrat: lecC-Methyl-Reichstein-S. Mikroorganismus: Curvularia lunata (ATCC 12017) ß-Cyclodextrin, Verbesserung der Effektivität der Konversion

Substrateinsatz: Variante 1.

Endprodukt: llß-17 °C,21-Trihydroxy-16 <-raethyl-pregnif4-en-3,20-dion (16 << -Methyl-hydrocortison)

Die Reaktion wird nach der Methode von Canonica, L. et al. GaS. Chim. Ital. ^3, 368 (1963) durchgeführt. Molverhältnis von Steroid/Cyclodextrin: 1:1. Ohne Verwendung

BAD ORIGINAL

von Cyclodextrin entsteht das Hauptprodukt in einer Menge von ca. 55 Gew.^. Wenn in der O. Stunde der Biokonversion in dem obigen Verhältnis ß-Cyclodextrin zu dem Reaktionsgemisch gegeben wird, steigert sich des Hauptproduktes um 5-10 #.

Beispiel 10

Substrat: 3ß, 17* »21-Trihydroxy-pregn-5-en-20-on-21- ^acetat
Mikroorganismus: Flavobacterium dehydrogenans

(ATTCG 13930)

ß-Cyclodextrin, Konzentrationserhohung Substfcateinsatz: Variante 1 Endprodukt: Reichstein-S

Die Reaktion wird nach US-PS 3 009 936 durchgeführt. Steroid/Cyclodextrin-Molverhältnis: 1:0,3- Mit Cyclodextrin kann die Konzentration auf das Doppelte gesteigert werden.

Beispiel 11

Substrat: Lanatozid-A (Digitalis-Glucosid) Mikroorganismus: Streptomyces purpurascens ß-Cyclodextrin, Konzentrationserhohung Substrateinsatz: Variante 1.

Die Reaktion wird nach der HU-PS 176 250 durchgeführt. Lanatosid-A/Cyclodextrin-Molverhältnis: 1:1. Ohne Verwendung von Cyclodextrin gibt man zu einer 2-tägigen Kultur von Streptomyces purpurascens eine Lösung von Lanatosid-A in organischen Lösungsmitteln in einer Konzentration von 0,5 g/l· Wenn zu dem Reaktionsgemisch nach 2 Tage dauernder Kultivierung in der 0. Stunde der Biokonversion unter Einhaltung des obigen Verhältnisses ß-Cyclodextrin

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gegeben wird, kann die Konzentration des Substrats auf 2 g/l erhöht werden.

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Claims

3235884 Dr. Peter WAGBR

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Telefon 223* Μ

VERFAHREN ZUR INTENSIVIERUNG DER MIKROBIOK)G ISCHEN UMWANDLUNG VON STEROIDVERBINDUNGEN

PATENTANSPRÜCHE

il.J Verfahren zur Intensivierung der mikrobiologisehen Konversion von Steroiden, dadurch gekennzeichnet , daß man die mikrobiologische Reaktion des Steroid-Substrats in Gegenwart von et-, Q- oder T-Cyclodextrin oder einem beliebigen Gemisch derselben durchführt und das Cyclodextrin nach Beendigung der Umwandlung gegebenenfalls aus dem System zurückgewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das Cyclodextrin vor der mikrobiologischen Reaktion, bei deren Beginn oder während der Reaktion in das Systentführt.
3· Verfahren nach Anspruch^ 1 wad 2, dadurch gekennzeichnet , daß man das Cyclodextrin in einer Menge von 0,2-3 Mol auf 1 Mol des Substrats berechnet verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet , daß man das entsprechende Cyclodextrin vor Eintragung des Substrats in das Biokonversionssystem einsetzt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3_? dadurch gekennzeichnet , daß man den Inklusionskomplex des Substrat-Cyclodextrins zur mikrobiologischen Konversion verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet , daß man eine Lösung oder Suspension des Substrat-Cyclodextrin-Inklusionskomplexes verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet , daß man das Cyclodextrin nach Beendigung von 35-50 & der mikrobiologischen Konversion in das SystenT)führt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet , daß man das Cyclodextrin^ bzw. dessen mit dem Steroid-Substrat gebildeten Inklusionskomplex oder gegebenenfalls eine Lösung derselben vor dem Einsatz in das Biokonversionsmedium sterilisiert.
9· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet , daß man das in das Biokonversionsmedium eingetragene Cyclodextrin samt dem Medium sterilisiert.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e kennzeichnet, daß man das Steroid mit einem organischen Lösungsmittel aus dem wäßrigen Biokonversionsmedium extrahiert und das Cyclodextrin durch die Zugabe eines die Löslichkeit stark herabsetzenden Lösungsmittels, zweckmäßig Hexans, ausfällt, aus dem Raffinat durch Filtration isoliert undRe^wünschtenfalls trocknet.