NL8203746A - Werkwijze voor de intensivering van de microbiologische omzetting van steroideverbindingen. - Google Patents

Description

N/31.124-Kp/Pf/vdM

‘ - 1 -

Werkwijze voor de intensivering van de microbiologische omzetting van steroideverbindingen.

Onderwerp van de onderhavige uitvinding is een werkwijze voor de intensivering van de microbiologische omzetting van steroideverbindingen door toepassing van cyclo-dextrine toevoeging, 5 < Bij de bereidingvan steroideverbindingen komt het dikwijls voor dat men een trap van de meertrappige synthe-se door de toepassing van een specifieke functie van een micro-organisme uitvoert. De micro-organismecellen, de uit de cellen geextraheerde enzymen, de eventueel gefixeerde cellen 10 of de gefixeerde enzymen toepassende bioconversieprocessen worden in een waterig medium uitgevoerd. Hoewel de enzymati-sche reactie in dit medium zeker afloopt, is tegelijkertijd een nadeel in vergelijking met de reacties in organische op-losmiddelen, dat de steroiden in water slecht oplosbaar zijn. 15 De oplosbaarheid in water van een serie steroideverbindingen is zeer gering, waardoor de concentratie geringer is dan die concentratie waarbij de bioconversieprocessen nog economisch uitvoerbaar zijn. Bij de bekende werkwijzen is een bepaald gedeelte.vanhet substraat, resp. het steroideprodukt geduren-20 de de reactie in vaste vorm aanwezig. Het in oplossing gaan van het substraat in de vaste fase kan de reactiesnelheid be-palen, waarbij in het geval van heterogene deeltjesgrootte de snelheid van het in oplossing gaan met verhoging van de gemid-delde grootte van de niet opgeloste deeltjes steeds lager 25 wordt. Het kan voorkomen, dat vanwege de problemen met het oplossen de reactie voor het berexken van de gewenste omzet-tingsgraad tot stilstand komt.

Meerdece werkwijzen werden voor de verhoging van de oplosbaarheid in water van het substraat-steroide of de 30 verhoging van de oplossingssnelheid van het produkt, uitge-werkt.

Volgens het Britse octrooischrift 1.211.356 wordt voor^het bereiken van een homogeen, fijn gemaakt substraat het in de reactie te gebruiken steroide voordien mecha-35 nisch gedispergeerd. Volgens het Amerikaanse octrooischrift 8203746 t i ·» - 2 - 4.124.607 wordt het substraat met fijne korrelgrootte in een aparte trap bereid, doordat men de in een organisch oplosmid-del bereide steroide-oplossing in water emulgeert en het oplosmiddel afdestilleert. In meerdere werkwijzen wordt het 5 steroide in een organisch oplosmiddel opgelost en geschiedt de afscheiding direct in het bioconversieproces. Volgens het Hongaarse octrooischrift 149.678 wordt het voor het inbrengen van het substraat gebruikte oplosmiddel (pyridine, azijnzuur), voor de aanvang van de bioconversie geneutraliseerd en wordt 10 de oplosbaarheid bij alcoholen door de toevoeging van aard-alkalimetaalchloriden verbeterd.

Volgens het Britse octrooischrift 1.083.204 wordt de oplosbaarheid van het steroidesubstraat in het reac-tiemedium door de toevoeging van een organisch oplosmiddel, 15 doelmatig dimethylsulfoxide, verbeterd, dat reeds bij de toevoeging of na de toevoeging wordt gebruikt. Volgens een andere oplossing van het probleem wordt de oplosbaarheid in water van het steroidesubstraat met een met water niet mengbaar oplosmiddel verzekerd, waarbij in dit geval de snelle stofover-20 dracht door de grote grensoppervlakken van de gevormde emulsie mogelijk wordt gemaakt (zie Biotechn. Bioeng. 21^, 39 >/19797) . In de farmaceutische Industrie gebruikt men dikwijls solubili-seringsmiddelen. Zo verhoogt men bijv. volgens het Duitse octrooischrift 1.543.431 in aanzienlijke mate de androsten-25 dionopbrengst door de toevoeging van solubiliseringsmiddelen bij de bereiding van de verbinding uit 4-collesten-3-on.

De bekende oplossingen voor de problemen vermin-deren weliswaar de met de geringe oplosbaarheid in water van het steroidesubstraat verbonden nadelen, maar zijn niet econo-30 misch of vertonen ongunstige invloeden op het systeem. In het geval dat bijv. het substraat in microkristallijne vorm wordt bereid, betekent dit meer arbeidstrappen in de technologische rij en veroorzaakt het een verlies aan stof. Volgens andere waarnemingen wordt het micro-organisme gedurende langere tijd 35 door het organische oplosmiddel in de voor de aanmerkelijke verhdging van de oplosbaarheid in water van de steroiden beno-digde hoeveelheid beschadigd (Steroids, 12, 525 /Ϊ9687)*

Wanneer men solubiliseringsmiddelen gebruikt 8203746 t % '' - 3 - wordt volgens de ervaringen de schuimvorming verhoogd en dit verhindert een voldoende beluchting van het bioconversie-systeem.

Het doe1 van de uitvinding was de uitwerking van 5 een werkwijze welke enerzijds de nadelen van de uit de stand van de techniek bekende werkwijzen vermindert en tegelijker-tijd de intensivering van de reactie bij de microbiologische omzetting van de steroiden verzekert.

Gevonden werd dat de cyclodextrinen met voordeel 10 in bioconversiesystemen kunnen worden gebruikt voor de verbe-tering van de oplosbaarheid in water van de steroldemoleculen, , bij vast residu voor de verhoging van de oplossingssnelheid en daardoor voor de aanzienlijke verhoging van de bioconversi'e-reactie, verder in een bepaald systeem voor de eliminering van 15 de een verdere reactie remmende produktremming en in bepaalde gevallen voor de blokkering van bepaalde reacties door de af-dekking van enige sterische groepen van het steroidemolecuul.

De a- en g-cyclodextrinen, resp. hun mengsels, werken katalytisch in een esterhydrolyse. Wanneer de micro-20 organismen twee of meerdere functies vertonen dan kunnen de selectieve werkingen de verhouding van de reactieprodukten be-invloeden. De boven genoemde werkingen worden in het vervolg samenvattend als "intensivering" aangeduid.

Volgens de uitvinding wordt de reactie van de 25 microbiologische omzetting van de steroiden geintensiveerd door het steroidesubstraat in aanwezigheid van α-, β-, of γ-cyclodextrine of hun mengsel, om te zetten en evt. na de omzetting het cyclodextrine uit het mengsel te winnen. Onder "cyclodextrine" verstaat men in het vervolg a-/ 3-, of γ-30 cyclodextrine of enig mengsel ervan. Voorafgaande aan de microbiologische omzetting of aan het begin daarvan of in een bepaalde fase van de microbiologische conversie voegt men op een mol substraat 0,2-3 mol cyclodextrine toe. Volgens een uitvoe-ringswijze wordt het overeenkomstige cyclodextrine voorafgaan-35 de aan de toevoeging van het substraat in het bioconversie-medium gebracht. Volgens een andere uitvoeringswijze wordt het substraat met het cyclodextrine omgezet en wordt het verkre-gen substraat-inclusiecomplex, resp. de waterige oplossing of 8203746 . * '' - 4 - suspensie ervan toegevoegd aan het bioconversiemedium. Volgens een verder mogelijke uitvoeringsvorm wordt het cyclodextrine alleen of in de vorm van een met het substraat gevormd inclu-siecompiex, desgewenst een waterige oplossing of suspensie van 5 het inclusiecomplex, gedurende de microbiologische reactie na het bereiken van 30-50 % conversie, toegevoegd. De oplossing van het cyclodextrine of van het cyclodextrine en van het substraat-inclusiecomplex, kan voorafgaande aan de toevoeging aan het bioconversiemedium gesteriliseerd worden of kunnen 10 zij te samen met het bioconversiemedium gesteriliseerd worden. Cyclodextrine kan uit het waterige bioconversiemedium worden teruggewonnen door het sterolde met een organische oplosmiddel te extraheren en het cyclodextrine door toevoeging van een de oplosbaarheid sterk verlagend oplosmiddel, bij voorkeur hexaan, 15 uit het raffinaat neer te slaan en door filtratie te isoleren en het cyclodextrine desgewenst te drogen.

De intensivering van de microbiologische omzet-ting van de steroiden volgens de uitvinding is zeer voordelig, omdat deze werking naar voren komt in de verhoging van de 20 reactiesnelheid en in de vermindering van de reactieduur, de concentratie van het substraat in het medium verhoogd kan worden, de produktremming geelimineerd·kan worden, van de mogelijke reacties de gewenste reactie gekatalyseerd kan worden en aldus de microbiologische selectiviteit verhoogd kan worden. 25 De bereiding van cyclodextrine-steroidesubstraat- inclusiecomplexen kan volgens meerdere varianten worden uitge-voerd. Volgens een variant is het medium van de bioconversie een waterige oplossing met bepaalde concentratie van het gewenste cyclodextrine, waaraan het substraatsteroide wordt toe-30 gevoegd, waarop het inclusiecomplex volgens ligging van het evenwicht gevormd wordt (variant 1).

Volgens een andere werkwijze wordt om het in-brengen van het steroide in het systeem te vermijden, in een gescheiden houder de waterige oplossing van het substraatcyclo-35 dextrine-inclusiecomplex bereid, welke door filtratie gesteriliseerd wordt en vervolgens aan het bioconversiemedium wordt toegevoegd (variant 2).

In aanwezigheid van een weinig water is volgens 8203746 * * - 5 - de ervaring het mengsel van cyclodextrine en van steroxde ora te kristalliseren, waarbij een steroxde-cyclodextrine wordt gevormd, dat bij een bioconversieproces dat geen sterilisatie nodig heeft, in vaste vorm kan worden gebruikt (variant 3).

5 De cyclodextrinen zijn glucosepolymeren van natuurlijke oorsprong, die uit 6, 7 of 8 glucose-eenheden be-staande gesloten macroringen zijn. Hun structuur wordt door de speciale ordening van de hydroxylgroepen gekarakteriseerd.

Alle secundaire hydroxylgroepen zijn aan de ene rand van de 10 ring te vinden, terwijl daarentegen de primaire hydroxylgroepen aan de andere rand van de ring terug te vinden zijn.

Daaruit volgt dat het buitenoppervlak van de ring hydrofiel is, waardoor de cyclodextrinen in water oplosbaar zijn.

De binnenkant van de ring is hydrofoob. De 15 cyclodextrinen vormen met moleculen van de geschikte grootte en vorm inclusiecomplexen. Het uit 6 glucopyranose-eenheden bestaande cyclodextrine is a--cyclodextrine, β-cyclodextrine wordt uit 7 glucopyranose-eenheden ogpebouwd en γ-cyclodextri-ne bestaat uit 8 glucopyranose-eenheden. Naar hun wijze van 20 binding worden cyclodextrinen ook cycloamylosen genoemd.

Complexen van steroidemoleculen met cyclodextrine werden reeds gedurende de studie van meerdere farmacologische actieve stof-fen en meerdere solubiliserende stoffen onderzocht (Lech en Pauli: J. Pharm. Sci. 55^, 32 (\966/). In het geval van testos-25 teron en cortisonacetaat werden de waarschijnlijke stoechiome-trische verhoudingen van de componenten vastgesteld. Door de solubilisering wilde men de resorptie van de farmaceutisch actieve stoffen beinvloeden. De cyclodextrinen werden echter niet voor de intensivering van de reactie bij de microbiologi-30 sche omzetting van de steroidesubstraten gebruikt. Vastgesteld werd dat het complex van steroidesubstraat met cyclodextrine in een waterig medium direct dissocieert en het complex is in een bioconversiesysteem in een dynamisch evenwicht met de vrije sterolde- en cyclodextrinemoleculen. In een vast, een 35 gesuspendeerd steroide bevattend bioconversiesysteem is tel-kens de concentratie van het voor het enzym bereikbare opge-loste gedeelte altijd van de oplossingssnelheid van het ver-volg van het de reactie verzekerende substraat en de snelheid 8203746 * * - 6 - van de enzymatische reactie afhankelijk. Wanneer het in oplos-sing gaan een langzamer proces is, dan blijft gedurende de reactie de concentratie van de sterolde-oplossing ver onder de verzadigingswaarde en wordt daardoor de reactie in de zin van 5 de basiswet van de enzymatische reactie wezenlijk langzamer. Het substraat maakt zich uit het cyclodextrine-inclusiecomplex praktisch ogenblikkelijk vrij. De hoeveelheid van het opgelos-te substraat blijft in dit geval gedurende het gehele proces geheel tot aan het einde van het proces op de verzadigings-10 waarde en zo wordt de maximale conversiesnelheid van de gege-ven enzymreactie verzekerd.

Bij andere sterolde-omzettingsreacties kan het produkt volgens het z.g. eindproduktremmingsmechanisme de reactie vertragen of doen stoppen, wanneer het aan het enzym 15 over het oppervlak van de cellen gebonden is. Vanwege de ver-schillen in structuur tussen het substraat- en het eindpro-duktmolecuul vormen deze met het cyclodextrine complexen van meer of minder verschillende stabiliteit. Volgens ons onder-zoek worden zo gunstige reactieomstandigheden gevonden, waar-20 onder het anders eindproduktremming veroorzakende steroxde in cyclodextrinecomplex werd omgezet, zonder de toegankelijkheid van het substraatsteroide te hebben verslechterd. Wanneer de stabiliteit van het substraatcyclodextrinecomplex de stabiliteit van het eindproduktcyclodextrinecomplex overtreft, dan 25 kan door de benutting van de complexvorming de eindproduktremming worden opgeheven door het cyclodextrine slechts na een bepaalde voortgang van de reactie toe te voegen wanneer de overmaat van het produkt in het systeem kan worden aangetoond.

In volgende onderzoeken werd ook vastgesteld dat 30 de enzymatische hydrolyse van de veresterde steroidemoleculen door de bereiding van een overeenkomstig a- en/of 6-cyclodex-trinecomplex kan worden versneld. Dit kan vermoedelijk met de katalytische werking worden verklaard, die uit de structuur van het cyclodextrine volgt.

35 Bij verschillende bioconversieomzettingen werd ook waargenomen dat de cyclodextrinecomplexvorming verschui-ving van de verhoudingen kan veroorzaken, zo kan in het geval van een overeenkomstig stabiel complex door vermindering van 8203746 ·>. <*s . ' \ ' - 7 - de toegankelijkheid van het molecuul de snelheid van een reac-tie met gegeven configuratie verminderd of de reactie zelfs geheel uitgesloten worden.

Deze inclusiecomplexen vormende eigenschap en de 5 invloed daarvan op de intensivering van de bioconversiereactie is algemeen geldend voor de steraanverbindingen. Onderstaand worden de bijzonderheden van de werkwijze met behulp van voor-beelden van oestran-, androstan-, pregnan-, cholestan-, stigmastan- en nor-verbindingen aangetoond zonder de bescher-10 mingsomvang tot de genoemde voorbeelden te beperken.

VOORBEELD I

Substraat: hydrocortison

Micro-organisme:Arthrobacter simplex (ATCC 6946) α-cyclodextrine, snelheidsverhoging 15 Substraattoevoer: lste variant

Een agarcultuur van Arthrobacter simplex (ATCC

6946) werd met fysiologische zoutoplossing gewassen en men 3 moculeerde met 5 cm van deze suspensie de volgende voedings-bodem: 20 Glucose: 0,3 %, enzymatisch gehydrolyseerd caseine: 0,5 %, gistextract: 0,1 %, pH = 6,7. Men vulde de op- 3 lossing aan met water tot 100 cm en steriliseerde in een Erlenmeyerkolf van 500 cm . Men kweekte bij 32°C op een vlak-trilmachine met een slaggetal van 230/18 h, men voegde 5 mg 3 25 hydrocortison in 0,5 cm methanol opgelost aan de cultuur toe en het gewenste enzym werd geinduceerd. De inductie duurde 3 h en werd onder dezelfde omstandigheden als de gehele cultive-ring uitgevoerd. Van'de 5-1-dehydrogenase-enzym bevattende 3 3 cultuur werd 50 cm in een 950 cm steriel water bevattende 30 Erlenmeyerkolf van 3 1 gebracht en de conversie werd met de zo verkregen 20-voudig verdunde actieve cultuur uitgevoerd. Het gebruikte substraat bedroeg 2 g hydrocortison, de toevoeging geschiedde door de toepassing van het boven genoemde toevoeg-sel op de volgende wijze: 35 Men voegde 20 g a-cyclodextrine toe aan de cul tuur, en na het oplossen ervan loste men het hydrocortison in 3 20 cm methanol op, waarbij de methanol 10 gew.% CaC^ bevat-te. De oplossing voegde men toe aan de het a-cyclodextrine 8203746 - 8 - bevattende cultuur. De omzetting geschiedde bij 32°C gedurende 5 h op de boven genoemde schudmachine. De aanwezigheid van het α-cyclodextrine verhinderde bij de invoering van het substraat in het waterige medium de afscheiding ervan, de omzetting van 5 het opgeloste substraat geschiedde met een grotere, door de enzymactiviteit bepaalde grotere snelheid dan in het systeem dat het substraat in de vorm van een suspensie bevat. De con-versietijd van het boven genoemde substraat zonder cyclodextrine bedraagt 8 h. Aan het eind van de conversie is het 3 10 steroidegehalte van de gistingsbroei: 1920 ug/cm prednisolon, 3 '3 40 yag/cm 20-$-hydroxyprednisolon en 8 ^ig/cm hydrocortison.

VOORBEELD II

Substraat: 17 <*-methyltestosteron (androstan-derivaat)

15 Micro-organisme: Arthrobacter simplex (ATCC

6946) 8-cyclodextrine, opheffing van de eind- produktremming

Substraattoevoeging: variant 1.

De volgens voorbeeld I bereide en geinduceerde 20 cultuur werd vijfvoudig verdund en gebruikt voor de δ-1-dehy-drogenering van methyltestosteron door voor het in gang zetten van de bioconversie een oplossing van 1,0 g methyltestosteron 3 in 10 cm methanol in het systeem te brengen. De omzetting werd met behulp van dunne-laagchromatografie gevolgd. Het in-25 gebrachte substraat scheidt zich in het systeem af en wordt gedurende continu in oplossing gaan gedehydrogeniseerd. Bij 3 het bereiken van ca. 400 ^ig/cm δ-1-methyltestosteron voegde men aan het systeem 6,0 g 8_cyclodextrine toe. De toevoeging vormde een complex uit het gevormde produkt, hetgeen belang-30 rijk is omdat anders de enzymatische reactie vanwege de over-maat van het produkt op grond van het bekende eindprodukt-remmingsmechanisme langzamer zou zijn en tenslotte in het ge-heel niet meer zou zijn voortgegaan. De neiging tot complex-vorming van het β-cyclodextrine ten opzichte van het produkt 35 is ca. vijf maal zo intensief als die ten opzichte van het substraat. De toevoeging geschiedde in het tweede uur van de conversie en de incubatie werd op grond van dunne-laagchroma-tografiemetingen in het zesde uur stopgezet.

8203746 I ' - 9 -

Het steroxdegehalte van de gistingsbroei aan het eind van de omzetting bedroeg: 970 ^g/cm δ-1-methyltestoste-ron, 6 jLq/cse? methyltestosteron. Zonder de toevoeging van cyclodextrine wordt de reactie bij een achterblijvende sub-5 straatconcentratie van 100-120 ^ig/cm onderbroken.

VOORBEELD III

Substraat: 5-pregneen-3g, 17a,21-triol-20-on- 21-acetaat (geacyleerd pregneenderi-vaat) 10 Micro-organisme: Flavobacterium lucecoloratum (NCIB 9324) ^-cyclodextrine: variant 3.

Met een hellende agarcultuur van Flavobacterium 3 lucecoloratum (NCIB 9324) inoculeerde men 200 cm voedingsbo- 3 1 15 dem in een Erlenmeyerkolf van 750 cm . De cultivering voerde men bij 30°C gedurende 20 h op een vlakschudmachine met een slaggetal van 230 uit. Met de cultuur inoculeerde men 5 1 steriele voedingsbodem met gelijke samenstelling in een labo- ratoriumgistinrichting. De samenstelling: 1,0 gew.% gistex- 20 tract, 0,1 gew.% kaliumwaterstoffosfaat, 0,4 gew.% dikalium- waterstoffosfaat. Aan de gexnoculeerde voedingsbodem voegde 3 men 250 mg substraat, opgelost in 1,5 cm dimethylformamide, toe. De oplossing. werd door filtratie gesteriliseerd. De aan-wezigheid van het substraat maakte de vorming van de benodigde 25 enzymen gedurende de groei van de cultuur mogelijk. Na 12 h cultivering is het bacterienaantal en de enzymactiviteit ge-schikt voor het in gang zetten van de bioconversie en op dat moment voegde men 100 g pregneen-3B,17a,2l-tr±hydroxy-20-2l acetaat toe aan de cultuur, welke met γ-cyclodextrine werd 30 voorbehandeld. De behandeling geschiedde als volgt:

Men homogeniseert 100 g substraat met dezelfde 3 hoeveelheid Y-cyclodextrine en 200 cm water gedurende een pe-riode van 20 min. Gedurende deze tijd vormt zich een overeen-komstig deel van het substraat met het cyclodextrine een snel 35 oplosbaar complex. De suspensie werd in de gistinrichting gebracht en men incubeerde verder gedurende 11 h tot het substraat verbruikt was. Omstandigheden van de incubatie in de laboratoriumgistingsinrichting: 30°C, roeren met 420 rpm, 8203746 . '* -10-.

beluchting met een snelheid van 0,5 1/1/min. De omzetting werd met behulp van dunne-laagchromatografie gevolgd. Het sterolde- gehalte van de gistingsbroei aan het eind van de omzetting: 3 9020 ^ig/cm . Reichstein-S-verbinding: 4-pregneen-17a,2l-dihy-5 droxy-3,20-dion, 30 ^lg/cm^ substraat. Zonder cyclodextrine zou de bioconversie pas met een hoeveelheid van 10 g/1 substraat gunstig kunnen worden uitgevoerd.

VOORBEELD' IV

Substraat: 4-pregneen-17a,21-dihydroxy-3,20-10 dion-17-acetaat (geacyleerd corticos- teroide)

Micro-organisme: Curvularia prasadii (IMI 71475) β-cyclodextrine, katalyse van de esterhydrolyse Substraattoevoeging: variant 1.

15 Met een suspensie van sporen die van een hellen- de agarcultuur van Culvularia prasadii (IMI 71475) waren af- 3 gewassen, moculeerde men 100 cm voedingsbodem in een Erlen- 3 meyerkolf van 500 cm . De samenstelling van de voedingsbodem: 1,0 gew.% sojameel, 0,3 gew.% maismarmelade, 0,3 gew.% mais- 20 zetmeel, 0,5 gew.% moutextract, pH = 6,2. De cultuur werd bij 26°C gedurende 24 h bereid. Van de cultuur werd 10 cnr voor de 3 moculering van 10Q cm voedingsbodem in een even grote kolf gebruikt. De voedingsbodem bevatte geen moutextract maar had voor de rest dezelfde samenstelling als boven beschreven. Het 25 micro-organisme werd bij 26°C geschud en zo gepropageerd. Aan de nog groelende 16 h oude cultuur voegde men het om te zetten substraat toe. Het substraat was 4-pregneen-17o,2l -dihydroxy-3,20-dionacetaat, waarvan 0,12 g in 3 cm methanol opgelost werd toegevoegd aan het systeem. Men zette de incubatie voort,. 30 waarna de cultuur de verbinding in de Ιΐρ-positie hydroxy-leert, waarbij hydrocortison-17-acetaat ontstaat. In het 20ste uur van de met behulp van dunne-laagchromatografie gevolgde omzetting bedroeg het achtergebleven substraat 10 gew.%. Men voegde daarop Q,96 g β-cyclodextrine toe aan de omzetting. Het 35 cyclodextrine werkt katalytisch op de enzymatische hydrolyse van de acetylgroep van het steroidemolecuul, zodat gedurende de overblijvende tijd van de bioconversie naast de langzaam wordende hydroxylering de acetylgroep wordt afgesplitst. Na 8203746 - 11 - nog eens ca. 3 h kan het proces worden afgebroken.

Het steroldegehalte van de gistingsbroei aan het eind van de conversie: hydrocortison (4-pregneen-113,17a,21- 3 trihydroxy-3,20 dion) 0,730 mg/cm , hydrocortison-17-acetaat 3 3 5 0,185 ^g/cm , Reichstein-S-17-acetaat 0,005 ^ag/crn , Reichstein- S-verbinding 0,040 jig/cw?.

VOORBEELD V

Substraat: hydrocortison

Micro-organisme: Arthrobacter simplex (ATCC 10 6946) β-cyclodextrine, snelheidsstijging

Substraattoevoeging: variant 2.

Een op vaste voedingsbodem gegroeide Arthrobacter simplex (ATCC 6946) cultuur werd afgewassen en men inocu- 3 leerde 5 1 steriele voedingsbodem met ongeveer 30 cm suspen-15 sie in een laboratorium-gistingsinrichting.

De samenstelling van de voedingsbodem: 0,3 gew.% glucose, 0,3 gew.% pepton, 0,1 gew.% gistextract, pH = 6,8.

De cultuur werd bij 35°C onder roeren met een snelheid van 240 rpm en beluchting met 0,5 1/1/min in 20 h bereid. Met 1 1 20 van de cultuur inoculeerde men in een laboraboriumgistings-inrichting 9 1 gesteriliseerde voedingsbodem, waarvan de samenstelling de volgende was: 0,5 gew.% glucose, 0,5 gew.% pepton, 0,4 gew.% gistextract, pH = 6,8. De cultuur werd bij 35°C, bij roeren met een snelheid van 600 rpm en.bij beluch-25 ting met 0,3 1/1/min gedurende 18 h bereid, waarna voor de inducering van de enzymvorming een oplossing van 0,5 g hydro- 3 cortison in 50 cm methanol werd toegevoegd. Men incubeerde gedurende nog eens 4 h, waarna de actieve cultuur in een zuur-vast apparaat werd geperst, waar voordien het medium van de 30 bioconversie was bereid.

Medium: in de inrichting goot men 90 1 leiding-water, 1200 g β-cyclodextrine, de inrichting verhitte men tot 100°C en het medium werd bij deze temperatuur gedurende 20 min gesteriliseerd en daarop tot 35°C afgekoeld. Men loste 1,0 g 35 2-methyl-1,4-naftochinon en 400 g hydrocortison in 4 1, 400 g CaCl2 bevattende methanol, op, de oplossing werd door filtra-tie gesteriliseerd en in het apparaat gebracht. De cultuur werd ingeperst, waarop het bioconversieproces op gang werd 8203746 - 12 - gebracht. Gedurende het proces is het steroidesubstraat vrij-wel in oplossing, hetgeen belangrijk is omdat bij de aanvang van de produktafscheiding het gevaar van de mengkristalvorming uit het substraat en uit het produkt geelimineerd wordt.

5 Omstandigheden van de incubatie van de biocon- versie: 35°C, 180 rpm roeren en 0,6 1/1/min beluchting. Op grond van de dunne-laagchromatografieanalyse onderbrak men de reactie bij een substraathoeveelheid van 2 gew.%, de gistings-broei werd door tegenstroomextractie - op een apparaat dat de 10 aanwezigheid van vaste stof toelaat, bijv. een draaischijven-extractie-inrichting, met ethylacetaat twee maal geextraheerd. Het extract werd in vacuum bij max. 40°C tot een concentratie van 8 g/1 ingedampt - ca. 50 1 van het eerste concentraat -met een mengsel van 40 g actieve kool en 100 g celiet behan-15 deld en het mengsel werd tot aan de kristallisering - ca. 2 1 - verder ingedampt. De suspensie werd tot 5-10°C gekoeld en na enkele uren gefiltreerd. De moederloog werd met een vijf-voudige hoeveelheid diisopropylether behandeld, gekoeld en de neergeslagen vaste produkten werden afgefiltreerd.

20 Het produkt woog 375 g, waarvan de kwaliteit als volgt gekarakteriseerd kon worden:

Zuiverheid 98 gew.% verlies bij droging 1 gew.% sulfaatas 0,1 gew.% 25 achterblijvend hydrocortison 1,2 gew.% andere steroiden 0,35 gew.%

smeltpunt 234-236°C

fm a./^ - +98° (dioxaan, c = 1 gew.%).

Om het β-cyclodextrine terug te winnen werd het 30 extract met 1 1 cyclohexaan gedurende 1 h bij 18-20°C geroerd. Het gevormde residu werd gefiltreerd, in ongeveer 1 1 water gesuspendeerd en het cyclohexaan dreef men onder koken (door stoomdestillatie) uit het mengsel. De waterige β-cyclodextri-nesuspensie werd gedurende een nacht bij 5-l0°C achtergelaten, 35 de kristallen werden gefiltreerd en in vacuum gedroogd. Men won 700 g β-cyclodextrine terug, dat opnieuw kon worden ge-bruikt.

VOORBEELDEN VI-XI

8203746 --"13 -

De volgende microbiologische conversies werden analoog met de voorbeelden I-V onder de in de voorbeelden aangegeven omstandigheden uitgevoerd, onder to'epassing van cyclodextrine voor de intensivering van de gewenste reacties.

5 VOORBEELD VI

Substraat: progesteron

Micro-organisme: Mycobacterium sp. (NRRL B 3805) 3-cyclodextrine, concentratieverhoging Substraattoevoeging: variant 1.

10 Eindprodukt: androstat-4-dieen-4,17-dion.

De afbraak van de zijketen van het substraat voerde men volgens de methode van Marscheck, W.J. Kraychi, S. en Muir R.D. (1972) Appl. Microbiol. 23_, 72 uit. Sterolde/ cyclodextrine-molaire verhouding 1 : 0,2. De voedingsbodem 15 bevatte 0,5 % Na2HP04.7H20. Als gevolg van de aanwezigheid van cyclodextrine kon de zonder cyclodextrine bereikbare 1 g/1 sitosterineconcentratie onder gelijk blijvende conversieduur (ca. 170 h) tot 2 g/1 sitosterineconcentratie worden verhoogd. VOORBEELD VII

20 Substraat: progesteron

Micro-organisme: Ophiobolus herpotrichus 3-cyclodextrine, volledige omzetting Substraattoevoeging: variant 1.

Eindprodukt: 21-dihydroxyprogesteron.

25 De reactie werd volgens de methode van Meystre e.a., Helv. Chim. Acta 37, 1548 (1954) uitgevoerd. Steroxde/. cyclodextrine-molaire verhouding: 1 : 0,2. De voedingsbodem was bierbeslag, waarop het micro-organisme gedurende 3 dagen werd gecultiveerd, men voegde daarop de acetonoplossing van 30 progesteronsubstraat toe tot aan het bereiken van een concen-tratie van 0,25 g/1 gistingsbroei. Zonder toepassing van cyclodextrine duurt de conversie nog eens 3 dagen en bedraagt het achterblijvende substraat ongeveer 25 %. Toen 24-30 h na aan-vang van de bioconversie cyclodextrine aan het reactiemengsel 35 werd toegevoegd, werd de hoeveelheid achterblijvend substraat wezenlijk geringer.

VOORBEELD VIII

Substraat: 4-pregneen-17 ,21-dihydroxy-3,20-dion 8203746 - 14 - (Reichstein-S)

Micro-organisme: Curvularia lunata (IPO 49) 8-cyclodextrine, beinvloeding van de verhou- dingen tussen de reactieproduk- 5 ten

Substraattoevoeging: variant 1 Hoofdprodukt: hydrocortison.

De reactie werd volgens de methode van Kondo, E. en Mitsugi, T., J. Agrc. Chem. Soc. Japan J5, 521 (1961) uit-10 gevoerd. Steroide/Cyclodextrine-molaire verhouding: 1 : 0,3. Zonder toevoeging van het cyclodextrine verkrijgt men in de bioconversie 35-40 gew.% 6-3-hydroxy-Reichstein-S, 15-20 gew.% 1Ια-hydroxy-Reichstein-S en ca. 5 gew.% 7,14a-dihydroxy- en 5 gew.% 6-8-14a-dihydroxy-Reichstein-S. Toen in het Ode uur 15 van de bioconversie in de boven genoemde verhouding g-cyclo-dextrine aan het mengsel werd toegevoegd, kon de verhouding van lla-hydroxy-Reichstein-S (epi-hydrocortison) in het pro-dukt tot het dubbele worden verhoogd.

VOORBEELD IX

20 Substraat: 16a-methyl-Reichstein-S

Micro-organisme: Curvularia lunata (ATCC 12017) g-cyclodextrine, verbetering van de effectivi- teit van de conversie Substraattoevoeging: variant 1.

25 Eindprodukt: ll8,17a,2l-trihydroxy-l6a-methyl- pregn-4-een-3,2Q-dion (I6a-methyl-hydrocortison).

De reactie werd volgens de methode van Canonica, L. e.a., Gass. Chim. Ital. 93^-368 (1963) uitgevoerd. Molaire 30 verhouding van Steroide/cyclodextrine: 1:1. Zonder toepassing van cyclodextrine ontstaat het hoofdprodukt in een hoe-veelheid van ca. 55 gew.%. Toen in het Ode uur van de bioconversie in de boven genoemde verhouding 8~cyclodextrine aan het reactiemengsel werd toegevoegd, steeg het aandeel van het 35 hoofdprodukt met 5-10 %.

VOORBEELD X

Substraat: 38,17a,21-trihydroxypregn-5- en-20-on-21-acetaat 8203746 . .fS· - 15 -

Micro-organisme: Flavobacterium dehydrogenans (ATCC 13930) β-cyclodextrine, concentratieverhoging Substraattoevoeging: variant 1 5 Eindprodukt: Reichstein-S.

De reactie werd volgens het Amerikaanse octrooi- schrift 3.009.936 uitgevoerd. Molaire verhouding van Steroide/ cyclodextrine: 1 : 0,3. Met cyclodextrine kon de concentratie tot aan het dubbele worden verhoogd.

10 VOORBEELD XI

Substraat: Lanatozide-A (digitalis-glucoside) Micro-organisme: Streptomyces purpurascens β-cyclodextrine, concentratieverhoging Substraattoevoeging; variant 1.

15 De reactie werd volgens het Hongaarse octrooi- schrift 176.250 uitgevoerd. Lanatoside-A/cyclodextrine-molaire verhouding: 1:1. Zonder toepassing van cyclodextrine voegt men aan een 2 dagen oude cultuur van Streptomyces purpurascens een oplossing van lanatoside-A in organische op- 20 losmiddelen in een concentratie van 0,5 g/1 toe. Toen aan het reactiemengsel na 2 dagen durende cultivering in het Ode uur van de bioconversie met in acht name van de boven genoemde verhoudingen β-cyclodextrine werd toegevoegd, kon de concentratie van het substraat tot 2 g/1 worden verhoogd.

V .25 . · 30 8203746

Claims (10)

1. Werkwijze voor de intensivering van de micro-biologische conversie van steroiden, met h e t kenmerk , dat men de microbiologische reactie van het 5 steroidesubstraat in aanwezigheid van α-, β- of γ-cyclodextri-ne of enig mengsel daarvan uitvoert en het cyclodextrine na beeindiging van de omzetting eventueel uit het systeem terugwint.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met 10 het kenmerk, dat men het cyclodextrine vooraf-gaande aan de microbiologische reactie, bij het begin daarvan of gedurende de reactie, in het systeem brengt.

3. Werkwijze volgens conclusies 1-2, met het kenmerk, dat men het cyclodextrine in een 15 hoeveelheid van 0,2-3 mol op 1 mol van het substraat berekend, gebruikt.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men het geschikte cyclodextrine voorafgaande aan de toevoeging van het sustraat in 20 het bioconversiesysteem brengt.

4% .*· - 16 -

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men het inclusiecomplex van het substraat-cyclodextrine voor de microbiologische conversie gebruikt.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men een oplossing of suspensie van het substraat-cyclodextrine-inclusiecomplex gebruikt.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, met- het kenmerk, dat men het. cyclodextrine na 30 beeindiging van 35-50 % van de microbiologische conversie in het systeem brengt.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men het cyclodextrine, resp. het met het steroidesubstraat gevormde inclusiecomplex, 35 of evt. een oplossing ervan, voorafgaande aan de toevoeging aan het bioconversiemedium, steriliseert.

9. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men het in het bioconver- 8203746 - 17 - siemedium gebrachte cyclodextrine te samen met het medium steriliseert.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, met het k e n m e r k , dat men het steroide met een orga-5 nisch oplosmiddel uit het waterige bioconversiemedium extra-heert en het cyclodextrine door de toevoeging van een de oplosbaarheid sterk verlagend oplosmiddel, doelmatig hexaan, doet neerslaan, uit het raffinaat door filtratie isoleert en desgewenst droogt. 10 8203746