JPH02219597A - １，２‐デヒドロステロイド類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は医薬品として有用な１．２−デヒドロステロイ
ド類の製造に関し、さらに詳しくは、微生物を用いて効
率良＜１，２−デヒドロステロイド類を製造する方法に
関する。

（従来の技術） ステロイド類の合成において、　１，２−飽和−ステロ
イド化合物のＡ環への微生物による１、２−不飽和結合
の導入は公知である（米国特許第２８３７４６４号）。

かかる方法においては、水に難溶性のステロイド化合物
の溶解性を高めるために、粉末化する方法やエタノール
、アセトンなどのよ。

うに水と混和しやすい有機溶媒に溶解して用いる方法が
記載されているが、収率が低く副生成物が多くなるとい
う欠点を有していた。また、かかる欠点を改良するため
に、界面活性剤ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノ
オレートやソルビタン−モノパルミチイトを用いてステ
ロイド類の水性懸濁物を調製して用いる方法も知られて
いる（特公昭４１−９５３８号）。しかし、かかる方法
においても一般式Ｉで示されるステロイド類を基質とし
て用いた場合には、収率が低いという欠点を有すること
が明らかになった。さらに、α−β−もしくはγ−シク
ロデキストリンを反応混合物に添加して基質ステロイド
類が包接複合体を形成させる方法も開示されている（特
開昭５８−６７１９４号）が、かかる方法も該シクロデ
キストリン類が高価なため、経済的に不利であるという
欠点を有していた。

乾燥粉末として微生物と接触させる方法においては、粉
末化や粉末の微粒子化のための特殊な粉砕装置および低
温下での粉砕が必要であるという欠点を有していた。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは前記欠点を解決すべく鋭意研究の結果、水
溶性高分子分散剤用いて調製した１、２−飽和−３−ケ
トステロイド類の水性懸濁物を、ステロイド−ｌ−脱水
素酵素活性を有する微生物の菌体または菌体処理物と接
触させることにより、効率よ＜１，２−デヒドロステロ
イド類が製造できることを見いだし、本発明を完成する
に到った。

（問題点を解決するための手段） かくして本発明によれば、　１．２−飽和−３−ケトス
テロイド類を、ステロイド−１−脱水素酵素活性を有す
る微生物の菌体または菌体処理物を用いて１．２−デヒ
ドロステロイド類へ転換せしめるに際し、水溶性高分子
分散剤を用いて調製した１゜２−飽和−３−ケトステロ
イド類の水性懸濁物を用いることを特徴とする１、２−
デヒドロステロイド類の製造方法が提供される。

本発明で基質として用いられる１、２−飽和−３−ケト
ステロイド類としては、アンドロスト−４，９（１１）
−エン−３，１７−ジオン等やその１６−メチル、６α
−メチル、　６α−ノルオロ誘導体類、アンドロスト−
４−エン−３，１７−ジオン等のアンドロステン系のも
の、１７α−ヒドロキシプレグナ−４−ニンー２０−イ
ン−３−オン、その１６−メチル誘導体類、　１１β、
２１−ジヒドロキシ−プレグナ−４，１７（２０）−ジ
エン−３−オン、その６α−メチル誘導体、２０−クロ
ロ−プレグナ−４，９（１１）、１７（２０）−トリエ
ン−２１−アール−３−オン、さらに３，２０−ジケト
−プレグネン類として、　９β、　１１β−エポキシ−
１７，２１−ジヒドロキシ−１６β−メチル−プレグナ
−４−エン−３，２０−ジオン等の９β、　１１β−エ
ポキシ−′１７．２１−ジヒドロキシ化合物類、１７α
、２１−ジヒドロキシ−プレグナ−４，９（１１）　−
ジエン−３，２０−ジオンやその１６α−メチル誘導体
等の３，２０−ジケト−４，９（１１）−プレグネジエ
ン類、またはハイドロコーチシンやその６α−メチル誘
導体等の１１．１７．２１−　トリヒドロキシ化合物類
、　　２１−ヒトロキシープレグナ−４，９（１１）、
１６−　トリエン−３，２０−ジオンやその６α−ノル
オロ誘導体等の３．２０−ジケト−４，９（１１）、１
Ｂ−プレグネジエン類等のプレグネン系のものが挙げら
れる。特に〔式中Ｒはアルキル基を表す〕で示される３
、２０−ジケト−４，９（１１）、１６−ブレグネトリ
エン類が好ましい。式中のＲのアルキル基の具体例とし
てはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基
、ブチル基、イソブチル基、イソペンチル基などが挙げ
られる。炭素数が大きいものは、収率が低くなるため、
炭素数は５以下のものが好ましい。これらのアルキル基
のうちで、特に好ましいものはイソプロピル基である。

本発明において用いられる微生物は菌体または菌体処理
物の形態でステロイド−１−脱水素酵素活性を有するも
のであればいずれでも良く、例えばアルスロバクタ−（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）属、ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、マ
イコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋）　
　属などに属する微生物が挙げられる。、その中でも、
アルスロバクタ−属に属する微生物が好ましく、具体例
としてはアルスロバクタ−・シンプレックス（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔ、ｅｒ　ｓｉｍｐｌｅｘ）　ＡＴＣＣ６９
４Ｂ、マイコノくクテリウム・ロドクラウス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　）　ＡＴ
ＣＣ１２４８３、バシルス・スフエリカス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　）　ＡＴＣＣ１３８０
５、ノカルデイア・トランスバレンシス（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａｔｒａｎｓｖａｌｅｎｓｅｓ　）ＡＴＣＣ１２４８
５が挙げられる。特にアルソロバクター・シンプレック
ス＾ＴＣＣ６９４６が好ましい。

本発明において微生物は菌体または菌体処理物の形態で
用いることができるが、菌体の形態で用いる場合、増殖
菌体の状態でも、休止菌体の状態のどちらでもかまわな
い。

増殖菌体を用いる場合には炭素源、窒素源、無機塩類お
よび必要に応じてビタミン等の栄養素を含む培地を滅菌
し、これに該微生物を接種して振盪培養または通気撹拌
培養を行う。

用いられる培地成分としては次のようなものが挙げられ
る。炭素源としてはシュクロース、グルコース、糖蜜、
スターチ、デキストリン、脂肪酸、油脂類等が挙げられ
る。窒素源としては天然物では酵母エキス、ペプトン、
コーンステイープリカー等が、合成品ではアンモニウム
塩、硝酸塩、アミノ酸類、尿素等が挙げられる。

また培地に添加される無機物としては例えば、リン酸二
水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリンおよびカ
リウム源やマグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、
コバルト、亜鉛等の塩類が挙げられる。その他必要に応
じてビタミン類を添加することもできる。

培養条件は適宜選択すれば良く、培養温度は２５〜４０
℃、Ｐ（１は６〜８の範囲が好ましい。

本発明におけるステロイド−１−脱水素酵素はアンドロ
スタ−４−エン−３，１７−ジオンやコーチシンアセテ
ートのような１，２−飽和−３−ケトステロイド化合物
を培地の０．００５％（重量／体積）以上の水準で添加
することにより強く誘導される。

誘導物質の添加時期は特に限定されないが１通常、培養
開始後１２〜７２時間に添加する。添加方法としては、
メタノール、エタノールなどの有機溶媒の溶液か粉末状
態で添加することが好ましく、誘導物質を添加した後は
、培養を６〜４８時間続けることが好ましい。かくして
得られる菌体は、増殖菌体の状態でも休止菌体の状態の
いずれにおいても使用することができる。また、乾燥菌
体、菌体破砕物として、さらに常法に従って固定化した
状態でも使用することができる。

本発明における１、２−デヒドロステロイド類の製造は
、水溶性高分子分散剤を用いて調製した基質ステロイド
類の水性懸濁物を使用することにより達成される。水溶
性高分子分散剤としては、ポリビニルアルコール、メチ
ルセルロース、ゼラチン等があるが、特に好ましいのは
ポリビニルアルコールである。通常、ポリビニルアルコ
ールは酢酸ビニルを重合して得られるポリ酢酸ビニルを
鹸化して製造され、その性質は水酸基の割合を表した鹸
化度と４％水溶液の粘度で示されることが知られている
。ポリビニルアルコールは鹸化度が低い、または分子量
が小さくても分散剤として充分に機能しない。ポリビニ
ルアルコールとしては鹸化度が約７０％以上でかつ４％
水溶液粘度が３ｃｐｓ以上のものが好ましい。

本発明における基質ステロイド類の水性懸濁物のとは塩
化メチレン、クロロホルム、トルエン、キシレン、酢酸
エチルなどの実質的に水と混じり合わない有機溶媒に基
質ステロイド類を溶解した溶液を、ポリビニルアルコー
ル水溶液と混合し。

分散させたものをいう。用いるポリビニル水溶液の濃度
は０．１−１０％、好ましくは０．５〜５％である。分
散させるには、超音波破砕機やホモジナイザーなどを用
いればよい。有機溶媒中の基質ステロイド類の濃度とし
ては５ｍｇ／ｒｒ６１以上、好ましくは１０ｅ＋ｇ／−
以上であり、基質ステロイド類に対するポリビニルアル
コールの割合は重量比で０．０１〜ｌの範囲が好ましい
。

本発明における基質ステロイド類の１．２−デヒドロス
テロイド類への１換は、前記微生物と基質ステロイド類
の水性懸濁物を分子状酸素の存在下に接触、反応させる
ことにより実施されるが、これに加えて１反応を促進さ
せるために電子受容体を添加することが望ましい。電子
受容体は、ステロイド類の反応に一般的に用いられる電
子受容体であれば特に限定されず、具体例としては、メ
ナジオン（２−メチル−１，４−ナフトキノン）、フェ
ナジンメトサルフエー）、　　１．４−ナフトキノン。

ユビキノン類及びビタミンに型化合物などが挙げられる
。添加量としては、基質ステロイド類に対して０．０１
〜５重量％が好ましい。また、添加方法としては基質ス
テロイド類と混合して同時に水性懸濁物として添加する
方法や、メタノール、エタノール、　トルエン、クロロ
ホルムなどの有機溶媒に溶解して添加することもできる
。

本発明における反応液中の基質ステロイド類の濃度は１
反応液に対して０．０１〜１０％、好ましくは０．０５
〜５％（重量／体積）である。微生物の濃度は、微生物
の種類や用いる形態などにより一概には規定できないが
１通常、微生物菌体として用いる場合は反応液１２あた
り乾燥菌体重量として！。

以上となるように調ｆｆすることが望ましい。反応系の
ＰＨは５〜１０、好ましくは６〜９に保てば良く、ｐｌ
＋の調整は通常の方法、例えばリン酸バッファートリス
バッファー　塩化アンモニウムバッファーなどによって
調整すれば良い。反応温度は、反応が良く進行し酵素活
性、基質および生成物に影響のない範囲であれば良く、
通常は２０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃である。

反応方法は微生物、基質および電子受容体を含む反応液
を空気雰囲気下に激しく振盪する方法や、通気撹拌する
方法が挙げられる。反応時間は、微生物や基質の濃度、
系のｐＨ、温度により一概には規定できないが、通常、
２〜１４４時間、好ましくは６〜９６時間である。かく
して基質ステロイド類から　１，２−デヒドロステロイ
ド類を効率良く得ることができる。

Ｊ、ｉｆｆである１、２−飽和−３−ケトステロイド類
が一般式■で示される構造を有する場合は、本発明にお
ける目的物質である１、２−デヒドロステロイド類は、 〔式中Ｒ１はＨまたはＣＯＲ２を表す。ただし、Ｒ２は
一般式ＩのＲと同一のアルキル基を表す〕で示される。

反応に用いる微生物がステロイド−ｌ−脱水素酵素活性
を有し、ステロイド−２１−エステル体の加水分解酵素
活性を有しない場合は１，２−デヒドロ−２１−エステ
ル−ステロイド類の製造が可能である。また、微生物が
該脱水素酵素活性に加えて該加水分解酵素活性を合わせ
持つ場合には１，２−デヒドロ−２１−ヒドロキシ−ス
テロイド類の製造が可能である。さらに、両酵素活性を
合わせ持つ微生物を用いる場合においても、両酵素活性
の最適条件が異なるので、反応条件を適宜選択すること
により　１，２−デヒドロ−２１−エステル−ステロイ
ド類を優先的に製造することも可能である。また望むな
らば、　１．２−デヒドロ−２１−ヒドロキシ−ステロ
イド類と　１．２−デヒドロ−２１−エステル−ステロ
イド類の混合物を得ることも可能である。

基質である１、２−飽和−３−ケトステロイド類が一般
式Ｉで示される構造を有する場合は、上記の１．２−デ
ヒドロ−２１−エステル−ステロイド類は一般式■にお
いて式中のＲ１がＣ０Ｒ２（ただし、Ｒ２は一般式■の
Ｒと同一のアルキル基を表す）で示されるもので、　１
，２−デヒドロー２１−ヒドロキシ−ステロイド類は一
般式■においてＲＩがＨである２１−ヒドロキシ−プレ
グナ−１，４，９（１１）、１６テトラエンー３．２０
−ジオンである。

かくして、　１，２−デヒドロステロイド類を含有する
反応液が得られるが、該反応液から１，２−デヒドロス
テロイド類を分離、精製する方法は公知の方法によれば
良い。例えば、反応液から１，２−デヒドロステロイド
類を分離する方法としては、塩化メチレン、クロロホル
ム、＃：酸エチルなどの水と混和しにくい有機溶媒で直
接抽出する方法Ｎ・、反応液から濾過または遠心分離な
どにより菌体と１．２−デヒドロステロイド類を同時に
回収した後。

メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、塩
化メチレン、クロロホルムなどの有機溶媒により抽出す
る方法が挙げられる。抽出液から１゜２−デヒドロステ
ロイド類を精製する方法としては１例えば、溶媒を留去
した後、得られた粗１，２−デヒドロステロイド類をク
ロロホルムに溶解し。

この溶液にヘキサンを添加して１，２−デヒドロステロ
イド類を晶析する方法が挙げられる。

（発明の効果） かくして本発明によれば、従来技術に比較して高収率で
副生成物の少なく、かつ効率的な１，２−デヒドロステ
ロイド類を製造方法が提供される。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。なお、実施例及び比較例中の％は、特に新りのないか
ぎり重量基準である。

実施例−１ （１）菌体懸濁液の調製 コーンステイープリカー２．０％、綿実油２．０％、グ
ルコース０．５％、硝酸アンモニウム０．３％、Ｋ１１
２ＰＯ４０，２％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、Ｍｇ５Ｏａ
・７Ｈ２００，０２％および水からなる種培地（ｐＨ７
）　　３ｍ１１を１８ｍｍ径試験管に分注し、　１２１
”Ｃｌ２Ｏ分間蒸気滅菌を行った。これにアルスロバク
タ−・シンプレックスＡＴＣＣ６９４６の１白金耳を接
種し、２８℃で２５０往復／分、振＃１２ｃｍの往復振
盪機で２４時間培養した。

この培養液０．３−を先に記した培地６０ｎｔＱ　（ｐ
Ｈ７，０，１２１’Ｃｌ２Ｏ分間蒸気滅菌）を含む５０
〇−容坂ロフラスコに接種した。本培養は２８℃で１３
０往復／分、振＠７ｃＩ１１の往復振盪条件で行い、培
養開始後２６時間目に滅菌済アンドロステ−４−エン−
３，１７−ジオン１２０ｍｇをメタノール溶液で無菌的
に加えた。

その後、培養を８時間継続した後、遠心分離により菌体
な集め、生理食塩水で１回洗浄した。かくして得られた
菌体を０．１Ｍ　リン酸バッファー（Ｐ１１７．０）に
懸濁して、菌体懸濁液１５ｄを調製した。

（２）基質ステロイド類の水性懸濁液の調製２１−イソ
ブチロキシープレダナー４．９．１８−トリエン−３，
２０−ジオン　５ｇとメナジオン１００ｍにを７．５艷
の塩化メチレンに溶解し、　５℃に冷却した後、撹拌し
つつ、第１表に示すポリビニルアルコール（日本合成化
学工業ｍ＞または界面活性剤の２％水溶液２０艷を加え
た。次いで、超音波破砕機で２０分間処理し水性懸濁液
を調製した。

（３）反応の実施 （１）で調製した・菌体懸濁液１５−および（２）で調
製した基質ステロイドの水性！＠濁液０．９ｄ　（基質
ステロイドを１５０ｍｇ含む）を５００ｍＲ容坂ロフラ
スコに入れ、２８℃で１３０往復／分、振幅７ＣＩ１１
の往復振盪機で７２時間反応させた。反応終了後、反応
液を７５ｎｔ９のクロロホルムで抽出し、この抽出液中
の２１−ヒドロキシ−プレグナ−１，４，９（１１）、
１６−テトラエン−３，２０−ジオンの収率を高速液体
クロマトグラフィーで分析した結果を＄１表に示す。

第１表 実施例−２ 実施例−１の（１）項と同じ方法で調製した菌体５ひ濁
液１５ｍ１１と、第２表に示すポリビニルアルコールま
たは界面活性剤を用いて実施例−１の（２）と同じ方法
で調製した２１−イソブチロキシ−プレグナ−４，９（
１１）、１６−　トリエン−３，２０−ジオンの水性！
＠濁液１．８−を５００艷容坂ロフラスコに入れ、反応
時間が８時間であること以外は実施例−１と同じ条件で
反応させた。反応終了後１反応液を７５１ＴＬＱのクロ
ロホルムで抽出し、この抽出液中の２１−イソブチロキ
シ−プレグナ−１，４，９（１１）、１６−テトラエン
−３，２０−ジオンと２１−ヒドロキシ−プレグナ−１
，４，９（１１）、１６−テトラエン−３，２０−ジオ
ンの収率を高速液体クロマトグラフィーで分析した結果
を第２表に示す。

第　　２　　表 の抽出液中の基質ステロイド類に対応する１、２−デヒ
ドロステロイド類と２１−ヒドロキシ−プレグナ−１，
４，９（１１）、１６−テトラエン−３，２０−ジオン
の収率を高速液体クロマトグラフィーで分析した結果を
第３表に示す。

第　　３　　表 実施例−３ 実施例−１のＡ項と同じ方法で調製した菌体懸濁液１５
−と、第３表に示すポリビニルアルコールまたは界面活
性剤を用いて実施例−１のＢ項と同じ方法で調製した第
３表に示す基質ステロイド類の水性懸濁液０．４５−を
５００ｔ＋ｄＪ容坂ロフラスコに入れ、実施例−１と同
じ方法で反応させた。反応終了後、反応液を７５−のク
ロロホルムで抽出し、こ特許出願人　　日本ゼオン株式
会社 樗ト続苔１１正＊ｊｌ−（自発） 平成１年９月１８日 １，小事件表示 平成１年特許願第３９７６１号 ２、発明の名称 １．２−デヒドロステロイド類の製造方法３、補正をす
る者 事件との関係　　　特許出願人 住所　東京都千代田区丸の内二丁目６番１号５、補正の
対象 願書、及び明細書の「発明の詳細な説明」の欄６、補正
の内容 （１）　Ｉｆｎ書を添付した訂正願書と差し替える。

（２）第５頁第２行目のｒエンＪをｒジエンＪに訂正す
（３）第５頁第３行目のｒフルオロ」をｒフルオロ」に
訂正する。

（４）第６頁第１行目の「フルオロ」をｒフルオロ」に
訂正する。

（５）第７頁第４行目から第５行目の「その中でも、ア
ルスロバクタ−属に属する微生物が好ましく、」を削除
する。

（６）第７頁第１２行目のｒｔｒａｎｓｖａｌｅｎｓｅ
ｓ　Ｊをｒ仁ｒａｎｓｖａｌｅｎｓｉｓ　、ｊｌに訂正
する。

（７）第７頁第１２行目の「特にアルソロバクター」を
「アルスロバクタ−属に属する微生物が好ましく。

その中でも特にアルスロバクタ−」に訂正する。

（８）第１０頁第４行目の「小さくても」を「小さいと
」に訂正する。

（９）第１０頁第８行目から第９行目の［水性懸濁物の
とは」を「水性懸濁物とは」に訂正する。

（１０）第１０頁第１３行目の「ポリビニル水溶液」を
ｒポリビニルアルコール水溶液１に訂正する。

（１１）第１６頁第１４行目の「アンドロステ」を「ア
ンドロスト」に訂正する。

（１２）第１７頁第１行目ｒ４，９，１６Ｊを［ｉ’４
．９（１１）、　１Ｂ、ｊに訂正する。

以上

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）１，２−飽和−３−ケトステロイド類を、ステロ
   イド−１−脱水素酵素活性を有する微生物の菌体または
   菌体処理物と接触させることにより、１，２−デヒドロ
   ステロイド類へ転換せしめるに際し、１，２−飽和−３
   −ケトステロイド類を水溶性高分子分散剤を用いて水性
   懸濁物に調製して用いることを特徴とする１，２−デヒ
   ドロステロイド類の製造方法。
2. （２）１，２−飽和−３−ケトステロイド類が一般式
   I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒはアルキル基を表す〕で示されるものであり、
   １，２−デヒドロステロイド類が 一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＿１はＨまたはＣＯＲ＿２を表す、ただし、Ｒ
   ＿２は一般式 I のＲと同一のアルキル基を表す〕で示
   されるものである請求項（１）記載の１，２−デヒドロ
   ステロイド類の製造方法。