JPS6155953B2 - - Google Patents

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JPS6155953B2
JPS6155953B2 JP52131619A JP13161977A JPS6155953B2 JP S6155953 B2 JPS6155953 B2 JP S6155953B2 JP 52131619 A JP52131619 A JP 52131619A JP 13161977 A JP13161977 A JP 13161977A JP S6155953 B2 JPS6155953 B2 JP S6155953B2
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JP
Japan
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dione
steroids
compound
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mycobacterium
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JP52131619A
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Burenda Biigusu Kyandeisu
Richaado Paiku Toomasu
Jenu Bobucha Meeeru
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Upjohn Co
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Publication date
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Publication of JPS6155953B2 publication Critical patent/JPS6155953B2/ja
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Description

【発明の詳細な説明】 微生物によるステロイド類の転化は広く研究さ
れ記録されている。見たところ、初期のこのよう
な研究は、1937年ベリヒデBer.70巻470頁及び
Ber.70巻2079頁のマモリ（Mamoli）とヴエルセ
ローネ（Vercellone）によるものであつた。彼ら
は酵母を発酵させることによつて17―ケトステロ
イドの17β―ヒドロキシステロイドへの還元を明
らかにした。より最近では、ピーターソン
（Peterson）及びマレー（Murray）がカビのリゾ
プス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）によ
るプロゲステロンの11α―ヒドロキシル化を明ら
かにした。合衆国特許第2602769号（1952年）を
参照。また最近では、クレーキー（Kraychy）等
が合衆国特許第3684657号（1972年）で、ミコバ
クテリウム・スペシーズNRRL Ｂ―3683により
17―アルキル側鎖中に少なくとも８個の炭素を含
有するステロイドを発酵させることによつてステ
ロイドの17―アルキルを選択的に微生物で減成さ
せ、アンドロスト―４―エン―３，17―ジオン、
アンドロスト―１，４―ジエン―３，17―ジオン
及び20α―ヒドロキシメチル―プレグナ―１，４
―ジエン―３―オンをつくることを明らかにし
た。もつと最近では、ヤーシエツク
（Marsheck）等が合衆国特許第3759791号（1973
年）で、ミコバクテリウム・スペシーズNRRL
Ｂ―3805で、17―アルキル側鎖中に少なくとも８
個の炭素を含有するコレスタン又はスチグマスタ
ン系のステロイドを発酵させることによる、アン
ドロスト―４―エン―３，17―ジオンの選択的微
生物学的製造を明らかにしている。
本発明方法でつくられる化合物の3aα―Ｈ―４
α―〔3′―プロピオン酸〕―7aβ―メチルヘキサ
ヒドロ―１，５―インダンジオン（以下化合物
と呼ぶ）はシー（Sih）及びワン（Wang）によ
りその論文「微生物による、ステロイド酸化の機
作」．3aα―Ｈ―４α―〔3′―プロピオン酸〕
―7aβ―メチルヘキサヒドロ―１，５―インダン
ジオンの単離及び特性化J.Am.Chem.Soc.85巻
2135〜2137頁（1963年）で記載された既知化合物
である。シーとワンはノカルデイア・レストリツ
クス（Nocardia restrictus）によるアンドロス
ト―４―エン―３，17―ジオンの減成における中
間体として化合物の製造を記載した。
また本発明の背景中で適切なものは、シユーベ
ルト・ケイ（Schubert，K.）、ボート・ケイ・エ
ツチ（Bohme，Ｋ―H.）及びホルホールド・シ
ー（Hovhold，C.）による「微生物によるプロゲ
ステロンからの低分子量減成生成物の形成」と題
した論文「『ステロイド』４巻581〜586頁（1964
年））である。この著者等は、ミコバクテリウ
ム・スメグマチス（Mycobacterium
smegmatis）によるプロゲステロンの減成中にお
ける三環式中間体の形成を記載した。
本発明方法の培養法ミコバクテリウムフオルト
ウイツム（Mycobacterium fortuitum）NRRL
Ｂ―8129は、1975年11月17日出願の係属中の出願
番号第632635号で明らかにされている。出願番号
第632635号で明らかにされた方法条件は、本出願
の化合物の製造に誘導するものではない。
２〜10個の炭素原子の17―アルキル側鎖をもつ
た又はもたないステロイド類を選択的に減成さ
せ、発酵液中に圧倒的に化合物Ｉを蓄積する能力
によつて特徴づけられる突然変異株を使用する新
規な微生物転化方法。
これらの突然変異株はミコバクテリウム属のス
テロール減成微生物から、本明細書で明らかにさ
れた突然変異手順又はその他の突然変異手順を使
用して得られる。この属の例示的な種はエム・フ
レイ（M.phlei）、エム・スメグマチス（M.
smegmatis）、エム・ロードクロウス（M.
rhodochrous）、エム・ミユーコスム（M.
mucosum）、エム・フオルトウイツム（M.
fortuitum）、及びエム・ブチリクム（M.
butyricum）、である。本明細書で特定して例示
されているのは突然変異株の微生物ミコバクテリ
ウム・フオルトウイツムNRRL Ｂ―8129であ
り、これは２〜10個の炭素原子を含む17―アルキ
ル鎖をもつた又はもたないステロイド類を化合物
へ選択的に減成させるのに用いられる。適当な
ステロイド類の例はシトステロール、コレステロ
ール、スチグマステロール、カンペステロール及
び２〜10個の炭素原子の17―アルキル側鎖をもつ
同様なステロイド類、並びにアンドロスト―４―
エン―３，17―ジオン、アンドロスト―１，４―
ジエン―３，17―ジオン、デヒドロエピアンドロ
ステロン及びテストステロンである。これらのス
テロイド基質は純粋型又は粗製型でありうる。
また発酵液中には、より少量の3aα―Ｈ―４α
―〔3′―プロパノール〕―7aβ―メチルヘキサヒ
ドロ―１，５―インダンジオンヘミケタール（以
下化合物と呼ぶ） 及び痕跡量の3aα―Ｈ―４α―〔3′―プロパナー
ル〕―５α―ヒドロキシ―7aβ―メチルヘキサヒ
ドロ―１―インダノンヘミアセタール（以下化合
物と呼ぶ） 3aα―Ｈ―４α―〔3′―プロピオン酸〕―５α―
ヒドロキシ―7aβ―メチルヘキサヒドロ―１―イ
ンダノン―δ―ラクトン（以下化合物と呼ぶ） 及び3aα―Ｈ―４α―〔3′―プロパノール〕―５
α―ヒドロキシ―7aβ―メチルヘキサヒドロ―１
―インダノン（以下化合物と呼ぶ） もつくられる。
微生物 ２〜10個の炭素原子を含む17―アルキル側鎖を
もつた又はもたないステロイド類を選択的に減成
し、発酵液中に圧倒的に化合物を蓄積する能力
によつて特徴づけられる突然変異株は、ミコバク
テリウム属のステロール減成微生物を突然変異さ
せることによつて得られる。本明細書で明らかに
されるように、ミコバクテリウム・フオルトウイ
ツムATCC6842突然変異させると、実験室突然変
異株の微生物を生ずる。1974年ATCCカタログは
ATCC6842の目録に載せることと共に以下を明ら
かにしている。「ジエイ・シー・クルス（J.C.
Cruz）寒性膿瘍、Acta Med.Rio de Janeiro １
巻１頁（1936年）。培地90 37C」エム・フオルト
ウイツムATCC 6842はステロール類を小分子量
化合物、例えばCO2＋H2Oへ非選択的に減成す
る。このため、この微生物は選択的ステロイド減
成剤として不適である。
ニトロソグアニジンを使用するエム・フオルト
ウイツムATCC 6842の突然変異は、２〜10個の
炭素原子の17―アルキル側鎖をもつた又はもたな
いステロイド類を選択的に減成し発酵液中に圧倒
的に化合物をつくるような突然変異株の産生を
生じた。エム・フオルトウイツムのこの突然変異
株の微生物は、これが永久蒐集中に寄託されてい
る合衆国イリノイ州ピオリアの合衆国農務省北部
地域研究実験所によりNRRL Ｂ―8129受込れ番
号を与えられた。この微生物の二次培養基は、こ
の寄託所へ申込めば自由に入手できる。培養基が
入手できることが、政府活動により題目の証書と
共に授与された特許権を侵害してまでも本発明を
実施する実施権を構成するものではないことは、
理解されるべきである。
本邦ではFERM―Ｐ No.3805（昭和51年11月
12日寄託）で工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。
エム・フオルトウイツムNRRL Ｂ―8129の形
態と薬剤感受性は親株のエム・フオルトウイツム
ATCC6842のそれと区別できない。エム・フオル
トウイツムの両培養基は抗酸性、非運動性、非胞
子形成性であつて、アクチノマイセタレス目のミ
コバクテリアセアエ族に属する杆菌である。ラニ
ヨンの分類（ラニヨン・イー・エツチ
（Runyon，E.H.）、1959年、Med.Clin.North
America 43巻273頁）によれば、これは色素非形
成群のミコバクテリウムである。すなわちこれ
は低温で急速に生長し、比較的単純な培地上に色
素をもたない集落をつくる。
ステロイド分子への作用においては、エム・フ
オルトウイツムATCC 6842とエム・フオルトウ
イツムNRRLB―8129は明瞭に区別できる。上で
明らかにされたように、エム・フオルトウイツム
ATCC6842はステロイドの減成剤であるが、一方
エム・フオルトウイツムNRRL Ｂ―8129は選択
的な減成剤である。本明細書で明らかにされたと
おり、エム・フオルトウイツムNRRL Ｂ―8129
のこの性質のため、これが非常に有用なものとな
つている。
エム・フオルトウイツムNRRL Ｂ―8129を与
えるエム・フオルトウイツムATCC6842の突然変
異は、ニトロソグアニジンを使つて行なわれる。
この手順の詳細は下に記載されている。突然変異
手順はこの技術に一般に知られているが、本突然
変異手順の使用により得られるような突然変異株
があつた場合にその型を教示したり示唆したりす
るような既知技術はない。また本明細書で明らか
にされている突然変異手順及び転化手順はミコバ
クテリウムに対して詳細に述べられているが、類
似又は均等な手順が本明細書で明らかにされたそ
の他の属の微生物によつても使用できることは、
理解されるべきである。
転化手順 本発明の選択的転化はエム・フオルトウイツム
NRRLB―8129の生育中の培養基で、培養期間中
に選ばれたステロイド基質を培養基へ加えるか、
又は接種前の栄養培地中にこれを混入することに
よつて行なわれる。ステロイドは単独で、又は他
のステロイドと組合せて添加できる。培養基中に
おけるステロイドの好ましいが限定的ではない濃
度範囲は、リツトル当り約0.1ないし約100ｇであ
る。培養基は炭素源例えば同化できる炭水化物と
窒素源例えば同化できる窒素化合物又は蛋白質材
料を含有する栄養培地中で生育させられる。好ま
しい炭素源はブドウ糖、黒砂糖、蔗糖、グリセロ
ール、殿粉、とうもろこし殿粉、乳糖、デキスト
リン、糖蜜等を包含する。好ましい窒素源はコー
ンスチープリカー、酵母、固型乳を加えた自己分
解醸造酵母、大豆粉、棉実粉、コーンミール、固
型乳、カゼインの膵液消化物、魚粉、尿素、デイ
スチラーズソリツド、動物ペプトン液、肉と骨の
砕片、アンモニウム塩等を包含する。これらの炭
素源と窒素源の組合せを使用するのが有利であ
る。痕跡量の金属、例えば亜鉛、マグネシウム、
マンガン、コバルト、鉄等は発酵培地に加える必
要がない。というのは水道水と未精製成分が培地
成分として使われるからである。培地の滅菌前に
７より上のPH、好ましくは約７ないし約９の範囲
のPHに調整する。PH調整は強塩基例えばNaOH、
KOH等で行なうことができる。
本発明方法の臨界的な特徴は、圧倒的に化合物
をつくるために発酵中に７より上のPHを維持す
ることにある。このPH維持は、この技術で知られ
た手順、例えば培地にCaCO3又は燐酸塩緩衝液
を使うか、又は塩基例えば水酸化ナトリウム、水
酸化アンモニウム等によるPH調節によつて行なえ
る。
転化手順は約72時間ないし15日まで変化しう
る。転化過程での培養温度は約25℃ないし約37℃
の範囲でありうるが、31℃が好ましい。微生物の
生育を容易にするため転化容器の内容物に滅菌さ
れた空気で曝気してかきまぜ、こうして転化方法
の有効性を高める。
シリカゲル板（イー・メルク社、ダルムシユタ
ツト）と酢酸エチル―シクロヘキサン―氷酢酸
（60：40：１容量比）からなる溶媒系を使用する
薄層クロマトグラフイによつて証拠立てられると
おりに転化方法が終了すると、望んでいる転化し
たステロイドはこの技術でよく知られた手段によ
つて回収される。例えば発酵液と菌体とを含む発
酵（転化）反応混合物を上のとおり強塩基で、又
は緩衝液溶液例えば、重炭酸ナトリウム飽和溶液
等で約８のPHに調整し、次に水と混ざらないステ
ロイド用の有機溶媒で抽出する。適当な溶媒は塩
化メチレン（好適）、クロロホルム、四塩化炭
素、塩化エチレン、トリクロロエチレン、エーテ
ル、アミルアセテート、ベンゼン等である。化合
物は、重炭酸塩処理された反応混合物のPHを濃
鉱酸溶液、例えば濃HCl溶液で約２に調整するこ
とによつて良好な収量で得られる。反応混合物を
上のとおりに抽出すると、化合物を含有する抽
出物を生ずる。この抽出物にシクロヘキサンを
徐々に添加すると、107゜〜110℃の融点範囲をも
つ結晶性化合物が得られる。
化合物は有用なステロイド類の化学合成にお
ける中間体として有用である。例えば有用な19―
ノルステロイド類の全合成方法を明らかにした合
衆国特許第3880884号に明らかにされている方法
の出発材料にこれを転化できる。出発材料へのこ
の転化は、この技術で知られた手順により、例え
ば無水酢酸と酢酸ナトリウムでの処置によつて行
なうことができる。J.A.C.S.85巻2135〜2137頁を
参照。
次の実施例は本発明方法の例示であるが、限定
的に考えられてはならない。他に注意がなけれ
ば、百分率はすべて重量、また溶媒混合物の割合
は容量による。
実施例 １ エム・フオルトウイツムATCC6842からの突然
変異株エム・フオルトウイツムNRRLB―8129
の製造 (a) ニトロソグアニジンによる突然変異生成 エム・フオルトウイツムATCC6842の菌体を
次の無菌的な種菌培地で28℃で生育させる。
栄養ブロス（デイフコ製） ８ｇ／ 酵母エキス １ｇ／ プロピオン酸ナトリウム 0.5ｇ／ 蒸留水 １とする量 PHを1N NaOHで7.0に調整してから、121℃
で20分間滅菌する。
菌を約５×108／mlの密度まで生育させ、遠
心分離によつてペレツト化し、次に無菌の
0.1Mくえん酸ナトリウム（PH5.6）の同量で洗
う。洗つた菌体を同じ量のくえん酸緩衝液中に
再懸濁し、試料を滴定（菌の計数）用に除き、
ニトロソグアニジンを50μｇ／mlの最終濃度に
加える。菌懸濁液を37℃の水浴中で30分培養
し、この後試料を再び滴定用に除去し、残りを
遠心分離し、同容量の無菌的0.1M燐酸カリウ
ム（PH7.0）で洗う。最後に菌を次のものから
なる、炭素源を含まない無菌の最低量の塩培地
中に再懸濁させる。
NH4NO3 1.0ｇ／ K2HPO4 0.25ｇ／ MgSO4・7H2O 0.25ｇ／ NaCl 0.005ｇ／ FeSO4・7H2O 0.001ｇ／ 蒸留水 １とする量 PHを1N HClで7.0に調整してから、121℃で
20分滅菌する。次に突然変異株の選定のため菌
をプレートに流す。
(b) 突然変異株M.フオルトウイツムNRRL Ｂ―
8129の選定と単離 上記のように突然変異化された菌体を希釈
し、次のものからなる培地（フレーザー
（Fraser）とジエレル（Jerrel）、1963年、J.
Biol.Chem.205巻291頁〜295頁から変更）を含
んでいるプレート上に広げる。
グリセロール 10.0ｇ／ Na2HPO4 8.4ｇ／ KH2PO4 4.5ｇ／ NH4Cl 2.0ｇ／ MgSO4・7H2O 0.3ｇ／ FeCl3・6H2O 0.05ｇ／ 蒸留水 １とする量 寒天（15ｇ／）を加え、培地を121゜で30
分オートクレーブにかけてから、無菌のペトリ
皿に注ぐ。
この培地上の生育は、突然変異生成手順によ
つてつくられるほとんどの栄養生長因子を要す
る変異体を排除する。例えば化学的に定義され
た培地上で生育するためビタミン、生長素等を
必要とする培養基は除かれる。28℃で約７日培
養後、生ずる集落は突然変異株の選定に適した
試験プレートへ、次にグリセロールを基盤とす
る培地を含む対照プレートへ複製される。試験
プレートは、ピーターソン・ジー・イー
（Peterson，G.E.）、エツチ・エル・ルイス
（H.L.Lewis）及びジエー・アール・デービス
（J.R.Davis）、1962年「寒天培地中におけるコ
レステロールその他の水に溶けない炭素源の均
一分散体の調製」J.Lipid Research3巻275〜
276頁に記載のとおりにつくられる。これらの
プレート中の最小限度の塩培地は、実施例１の
(a)部に述べたとおりである。寒天（15ｇ／）
とシトステロール又はアンドロステンジオン
（AD）のような適当な炭素源（1.0ｇ／）を
加え、生ずる懸濁液を121℃で30分オートクレ
ーブにかける。無菌の熱い混合物を無菌の配合
容器に注ぎ、数分間配合し、次いで無菌のペト
リ皿中に注ぐ。この手順では発泡が問題となり
がちであるが、混合物が熱い時に配合すること
溶融寒天プレート表面に焔を当てることによつ
て減少させることができる。このやり方で、非
常に均質であるが不透明な寒天プレートの製造
を容易にするような、水に不溶の炭素源の均一
分散物が得られる。
対照プレート上に生育するがADを唯一の炭
素源として含有する試験プレート上には生育し
ない集落を、栄養寒天プレートへの画線培養に
よつて精製する。28℃で生育後、個々の集落を
無菌のつまようじで栄養寒地プレートから取り
上げ、ADを炭素源として含有するグリデツド
プレートに接種することによつて集落の再試験
を行なう。親培養基とは違う表現型をまだ現わ
している精製された単離物を振とうフラスコ内
で検査する。
(c) 振とうフラスコ検査 振とうフラスコ（500ml）は次の成分からな
る生物転化用培地100mlを含有する。
グリセロール 10.0ｇ／ Na2HPO4 8.4ｇ／ KH2PO4 4.5ｇ／ NH4Cl 2.0ｇ／ MgSO4・7H2O 0.3ｇ／ FeCl3・6H2O 0.5ｇ／ 蒸留水 １とする量 培地に大豆粉（１ｇ／）を配合し、次にシ
トステロール（10ｇ／）も培地に配合する。
フラスコを121℃で20分オートクレーブにかけ
てから、これらを28℃に冷却し、以下のとおり
につくられる種菌生育物10mlを接種する。
(b)部からの精製された単離物を寒天斜面培地
上で28℃で生育させる。斜面培地から取つた一
すくいの菌体を使用して、次の成分からなる無
菌の種菌培地100mlを含有する500mlフラスコに
接種する。
栄養プロス（デイフコ製） ８ｇ／ 酵母エキス １ｇ／ グリセロール ５ｇ／ 蒸留水 １とする量 PHを1N NaOHで調整してから、フラスコを
121℃で20分オートクレーブにかける。種菌フ
ラスコを28℃で72時間培養する。
上に明らかにされたように、種菌生育物10mlを
使用して、無菌の転化用培地100mlを含んでいる
各々の500mlフラスコに接種する。次にフラスコ
を回転振とう機上で28℃ないし30℃で培養し、種
種の間隔で試料を採取する。10mlずつの試料を取
り、３容量の塩化メチレンと一緒に振とうする。
抽出物の一部を、シリカゲル及び上記溶媒系すな
わち２：３容量比の酢酸エチル―シクロヘキサン
を使つた薄層クロマトグラフイによつて、また気
液クロマトグラフイによつて分析する。化合物
との存在の証拠は、親株エム・フオルトウイツ
ムATCC6842からつくられる新規突然変異株によ
るシトステロールの選択的減成を確認するもので
ある。
実施例 ２ シトステロールの化合物への転化 使用培地は、4N NaOHで約7.5のPHに調整され
る以外は、実施例１(c)と同じである。この培地は
121℃で30分加熱することによつて滅菌され、そ
れから28℃に冷却される。次に実施例１(c)で述べ
たとおりにつくられる突然変異株エム・フオルト
ウイツムNPPL Ｂ―8129の種菌培養基10部を接
種する。接種された混合物を28℃で168時間、水
面下の生育を促進するためかきまぜながら培養す
る。必要に応じ、NaOHの添加によりPHを７から
９の間に保持する。生物転化の進行は、反応混合
物の試料を濃HCl溶液でPH２に酸性化し、４倍量
の塩化メチレンで抽出し、薄層シリカゲル板上で
60：40：１容量比の酢酸エチル―シクロヘキサン
―氷酢酸からなる溶媒系中で抽出液をクロマトグ
ラフイにかけることによつて追跡される。
生物転化の終了すると、生成した生成物を次の
手順で単離する。重炭酸ナトリウム飽和溶液の添
加により反応混合物をPH８に調整し塩化メチレン
で抽出する。化合物〜を含むが化合物を含
まないこの抽出液を珪藻土に通してろ過し、ろ液
を蒸発乾固させる。ろ液からの残留物をクロロホ
ルム中に取り上げ、シリカゲル上でスケリソルブ
Ｂ及びこれと増加量の酢酸エチルとの混合物を展
開溶媒として使用してクロマトグラフイにかけ
る。この手順は化合物，及びを溶離するが
を溶離しない。これを酢酸エチル中の５％メタ
ノールでカラムから取り出す。これらの化合物の
溶離の順序は→→→である。個々の生成
物は、薄層クロマトグラフイで検出されるとおり
に適当なフラクシヨンを一緒にしてこれらを乾固
するまで蒸発させることによつて得られる。酢酸
エチルから再結晶すると、二つのエピマーの１：
１混合物である化合物が得られこれは、融点が
100゜〜112℃である。化合物は融点122゜〜124
℃である。また化合物は148〜150℃で溶融す
る。化合物は濃HCl溶液で重炭酸塩処理された
反応混合物のPHを２に調整し、クロロホルム又は
塩化メチレンで再び抽出し、シクロヘキサンの緩
慢な添加によつて生成物を結晶化させることによ
り、良好な収量で得られる。化合物は107〜110
℃で溶融する。
実施例 ３ 実施例２でシトステロールの代わりにコレステ
ロールを使用して、化合物が得られる。
実施例 ４ 実施例２でシトステロールの代わりにスチグマ
ステロールを使用して、化合物が得られる。
実施例 ５ 実施例２でシトステロールの代わりにカンペス
テロールを使用して、化合物が得られる。
実施例 ６ 実施例２におけるシトステロールのほか、又は
シトステロールの代わりに、実施例２〜５のステ
ロールの任意のものの組合せを加えて、化合物
が得られる。
実施例 ７ 実施例１でエム・フオルトウイツムATCC6842
の代わりにミコバクテリウム・プレイ、エム・ス
メグマチス、エム・ロードクロウス、エム・ミユ
ーコスム、及びエム・ブチリクムからなる群から
選ばれるステロール減成性微生物を使用して、２
〜10個の炭素原子の17―アルキル側鎖をもつた、
又はもたないステロイド類を選択的に減成させ、
発酵液中に圧倒的に化合物を蓄積する能力によ
つて特徴づけられる突然変異株の微生物が得られ
る。
実施例 ８ 実施例２〜６でエム・フオルトウイツムNRRL
Ｂ―8129の代わりに実施例７で得られる突然変異
株を使用して、化合物が得られる。
実施例 ９ 実施例２でシトステロールの代わりにアンドロ
スト―４―エン―３，17―ジオン、アンドロスタ
―１，４―ジエン―３，17―ジオン、デヒドロエ
ピアンドロステロン及びテストステロンからなる
群から選ばれる化合物を使用して、化合物が得
られる。
実施例 10 実施例２でシトステロールの代わりにシトステ
ロール、コレステロール、スチグマステロール、
アンドロスト―４―エン―３，17―ジオン、アン
ドロスタ―１，４―ジエン―３，17―ジオン、デ
ヒドロエピアンドロステロン、及びテストステロ
ンからなる群から選ばれる二つ又はそれ以上の化
合物の組合せを使用して、化合物が得られる。
実施例 11 実施例９と10でエム・フオルトウイツムNRRL
Ｂ―8129の代わりに実施例７で得られる突然変異
株を使用して、化合物が得られる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 好気的条件下に２〜10個の炭素原子を含む17
    ―アルキル側鎖をもつた又はもたないステロイド
    の存在下、約７ないし約９のPHの水性栄養培地中
    で、２〜10個の炭素原子の17―アルキル側鎖をも
    つた又はもたないステロイドを選択的に減成し、
    発酵液中に圧倒的に3aα―Ｈ―４α―〔3′―プロ
    ピオン酸〕―７αβ―メチルヘキサヒドロ―１，
    ５―インダンジオンを蓄積するその能力によつて
    特徴づけられるミコバクテリウムの突然変異株を
    培養し 式 の化合物を採集することを特徴とする上記化合物
    （）の製法。 ２ ミコバクテリウムの突然変異株がミコバクテ
    リウム・フオルトウイツムNRRLB―8129である
    特許請求の範囲第１項の製法。 ３ ステロイドがシトステロール、コレステロー
    ル、スチグマステロール、カンペステロール、ア
    ンドロスト―４―エン―３，17―ジオン、アンド
    ロスタ―１，４―ジエン―３，17―ジオン、デヒ
    ドロエピアンドロステロン、及びテストステロン
    からなる群から選ばれる、前記第１又は２項によ
    る製法。 ４ 好気的条件下に二つ又はそれ以上のステロイ
    ドの混合物の存在下、水性栄養培地中で上記突然
    変異株を培養し上記式（）の化合物を採集する
    ことからなる、前記第１又は２項による製法。 ５ ステロイド混合物がシトステロール、コレス
    テロール、スチグマステロール、カンペステロー
    ル、アンドロスト―４―エン―３，17―ジオン、
    アンドロスタ―１，４―ジエン―３，17―ジオ
    ン、デヒドロエピアンドロステロン、及びテスト
    ステロンからなる群から選ばれる、前記第４項に
    よる製法。 ６ 培地のPHが約7.5である、前記第１又は２項
    による製法。 ７ 好気的条件下に２〜10個の炭素原子を含有す
    る17―アルキル側鎖をもつた又はもたないステロ
    イドの存在下、PH約７ないし約９の水性栄養培地
    中で、２〜10個の炭素原子の17―アルキル側鎖を
    もつた又はもたないステロイド類を選択的に減成
    し発酵液中に圧倒的に3aα―Ｈ―４α―〔3′―プ
    ロピオン酸〕―7aβ―メチルヘキサヒドロ―１，
    ５―インダンジオンを蓄積する能力によつて特徴
    づけられるミコバクテリウムの突然変異株を培養
    することからなる、 式 の化合物を含有する発酵液の製法。 ８ 突然変異微生物がミコバクテリウム・フオル
    トウイツムNRRL Ｂ―8129である特許請求の範
    囲第７項の製法。 ９ ステロイドがシトステロール、コレステロー
    ル、スチグマステロール、カンペステロール、ア
    ンドロスト―４―エン―３，17―ジオン、アンド
    ロスタ―１，４―ジエン―３，17―ジオン、デヒ
    ドロエピアンドロステロン、及びテストステロン
    からなる群から選ばれる、前記第７又は８項によ
    る製法。 １０ 好気的条件下の水性栄養培地中で二つ又は
    それ以上のステロイド類の混合物の存在下に上記
    突然変異微生物を培養することからなる、前記第
    ７又は８項に記載の製法。 １１ ステロイド混合物がシトステロール、コレ
    ステロール、スチグマステロール、カンペステロ
    ール、アンドロスト―４―エン―３，17―ジオ
    ン、アンドロスタ―１，４―ジエン―３，17―ジ
    オン、デヒドロエピアンドロステロン及びテスト
    ステロンからなる群から選ばれる、前記第１０項
    による製法。
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