DE2746323A1

DE2746323A1 - Verfahren zur herstellung von 3a alpha-h-4alpha- eckige klammer auf 3'-propionsaeure eckige klammer zu -7a beta-methylhexahydro-1,5-indandion

Info

Publication number: DE2746323A1
Application number: DE19772746323
Authority: DE
Inventors: Candice Brenda Biggs; Thomas Richard Pyke; Merle Gene Wovcha
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1976-11-26
Filing date: 1977-10-14
Publication date: 1978-06-01
Also published as: NL7712280A; IL53156A0; GB1571143A; FR2372137B1; FR2372137A1; HU176627B; PL202380A1; MX4849E; US4062729A; JPS5369885A; IL53156A; JPS6155953B2; DE2746323C2; PL112030B1

Description

Verfaliren zur Herstellung von 5aa-H-4a-i 3'-Propionsäure ;-7aß-methylhexahydro-1₁ 5-indandion

Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen vnirde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937 "Berichte", 70, 470 und "Berichte", 70, 2079. AaO wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17ß-IIydroxysteroiden mit Hilfe von Gärhefe berichtet. Im Jahre 1952 (vgl. US-PS 2 G02 769) berichten Peterson und Murray über die Ha-Hydroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 3 6'6h 657) berichten Kraychy und Hitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 3 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkyl sei tenke tte mit Mycobacterium sp. IiRRL B-36Ö3 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst-1,4-dien-3,17-dion und 20a-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-^-on.

Dr.F/rm

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1973 (vgl. US-PS 3 759 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-5,17-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp, NRRL B-3ÖO5.

Die nach den Verfahren gemäß der Erfindung herstellbare Verbindung der Formel I, nämlich 3aa-H-4a-[3'-PropionsäureJ-7aß-methylhexahydro-1,5-indandion, stellt eine von Sih und V/ang in "Mechanisms of steroid oxidation by microorganisms" II beschriebene bekannte Verbindung dar. Über die Isolierung und Charakterisierung von 5aa-H-4ct-[3'-PropionsäureJ-7aß-methylhexahydro-1,5-indandion finden sich Angaben in "J. Am. Chem. Soc», Band 85, Seiten 2135 bis 2137 (1963). Sih und V/ang beschreiben die Bildung der Verbindung der Formel I als Zwischenprodukt beim Abbau von Androst-4-en-3,17-dion durch Uocardia restrictus.

Ferner ist auch noch K. Schubert, K.H. Böhme und C. Ilorhold "Formation of low molecular degradation products from progesterone by microorganisms" in "Steroids", Band 4, Seiten 581 bis 586 (1964) von Interesse. Die genannten Autoren beschreiben die Bildung tricyclischer Zwischenprodukte beim Abbau von Progesteron durch Mycobacterium smegmatis.

Die Züchtung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismusmutante Mycobacterium fortuitum DSM 775 ist in der DT-OS 2 652 377 beschrieben. Die aaO beschriebenen Verfahrensbedingungen führen jedoch nicht zur Bildung der Verbindung der Formel I.

Mutanten, die durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis

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einschließlich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet sind und in der Gärbrühe vornehmlich eine Verbindung der Formel I anhäufen, erhält man nach den im folgenden näher erläuterten Mutationsmaßnahmen oder sonstigen Mutationsmaßnahmen aus Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, vorzugsweise Mycobacterium. Beispiele für Arten dieser Gattungen sind M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum, M. fortuitum und M. butyricum, insbesondere Mycobacterium fortuitum DSM 775.

Beispiele für erfindungsgemäß brauchbare Steroidsubsträte sind Sitosterine, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin und ähnliche Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen, sowie Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,A-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron. Diese Steroidsubstrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.

Neben der Verbindung der Formel I entstehen in der Gärbrühe (bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung) untergeordnete Mengen an 3a<x-H-4a-[3^l-Propanol]-7aß-methylhexahydro-1,5-indandion, Hemiketal der Formel:

Il

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-72,

? 7 /. S 3 2

und Spuren 3aa-II-4a-|

, Hemiacetal der Formel:

Il I

3aa-H-4a-[3'-Propionsäure ]-5a-hydroxy-7aß-methylhexahydro-1-indanon-<$-lakton der Formel:

IV

und 3aa-II-4a-1 3' -Propanol ]-5cc-hydroxy-7aß-methylhexahydro-1-indanon der Formel:

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ORIGINAL INSPECTED

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Wie bereits erwähnt, erhält man durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnete und vornehmlich eine Verbindung der Formel I in der Gärbrühe anhäufende Mutanten durch Mutation von Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacter.iura, Ilycobacterium, Uocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.

Für den Erfindungszweck wurde in der später beschriebenen Weise die Art Ilycobacteriun fortuitum ATCC 6^42 zu einer Laboratoriums-Mikroorganifimenmutante mutiert.

Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: "J.C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Hed. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 90 37C". H. fortuitum ATCC 6342 baut Sterine nicht-selektiv zu niedrigmoScularen Verbindungen, beispielsweise COp+HpO, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.

Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 mittels Uitrocoguanidin erhält man eine Mutante, die selektiv Steroide mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der Gärbrühe zu hauptsächlich einer Verbindung der Formel I abzubauen vermag. Diese Mikroorganismusmutante wurde am 16. November 1976 bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung m.b.H., München, Grisebachstraße 8, D-3400 Göttingen unter der Hinterlegungsbezeichnung DSM 775 hinterlegt. Eine Subkultur dieser Mikroorganismusmutante ist auf Anfrage von dieser Hinterlegungsstelle frei erhältlich. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die

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Verfügbarkeit bzv/. Aushändigung der Kultur keine Lizenz an einem auf die vorliegende Patentanmeldung etwa erteilten Patent begründet.

Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenempfindlichkeit von H. fortuitum DSH 775 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsart M. fortuitum ATCC 6842 nicht zu unterscheiden. Beide II.-fortuitum-Kulturen stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-sporenbildende Bazilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyon¹sehen Klassifizierung (vgl. E.H. Runyon "Med. Clin. Worth America», 43, 273 (1959)) handelt es sich um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d.h. es wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht-pigmentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien.

M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum DSM 775 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nichtselektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum DSM 775 erfolgt dagegen ein selektiver Abbau der Steroide. Diese Eigenschaft von M. fortuitum DSM 775 stellt eine in hohem Maße wertvolle Eigenschaft dar.

Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 zu M. fortuitum DSM 775 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmaßnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Muta-

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tionsmaßnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und Umv/andlungs- bzw. Traneformationsmaßnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch auch ohne weiteres möglich, ähnliche oder äquivalente Maßnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.

Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum DSM 775 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem liährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt v/erden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/l. Die Kultur wird in einem liährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlehydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glukose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstoff lief eranten sind Maisquellflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Kasein, Fischmehl,*Brennereirückstände, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle , z.B. Zink, Magnesium, Mangan,

* Harnstoff

Ö 0 9 R ? ? I 0 5 7 6

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Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt zu v/erden, da vor der Sterilisation des Mediums Leitungswasser und. ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.

Vor der Sterilisation des Mediums wird der pH-Wert auf über 7, vorzugsweise auf einen pPI-Wert im Dereich von etwa 7 bis etwa 9, eingestellt. Die pH-Werteinsteilung läßt sich mit einer starken Base, beispielsweise IJaOII, YSM und dergleichen, erreichen.

Ein kritisches Merkmal des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht in der Aufrechterhaltung des pH-V/er ts auf einem Wert oberhalb 7 während der Fermentation. Hur auf diese V/eise läßt sich sicherstellen, daß vornehmlich die Verbindung der Formel I gebildet wird. Der pH-Wert des IJährmediums läßt sich in üblicher bekannter Weise, beispielsweise unter Verwendung von CaCO, oder eines Phosphatpuffers im Medium oder durch Steuerung des pH-Werts mittels einer Base, z.B. Hatriumhydroxid, Ammoniumhydroxid und dergleichen, aufrechterhalten.

Das Umwandlungsverfahren dauert etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur während des Umwandlungsverfahrens reicht von etwa 25° bis etwa 37°C und beträgt vorzugsweise 31⁰C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus bewegt. Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.

Nach Beendigung des Umwandlungsverfahrens, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus

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60:40:1 (Volumenverhältnis) Äthylacetat/Cyclohexan/Eisessip:, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert. So wird beispielsweise das Gär- bzw. Fermentationsoder Umwandlungsgeüiisch einschließlich der Gärbrühe und der Zellen mittels einer starken Base der angegebenen Art oder mittels einer Pufferlösung, beispielsweise einer gesättigten Lösung von Natriumbicarbonat und dergleichen, auf einen pH-Wert von 8 gebracht und dann mit einem mit V/asser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert. Geeignete Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichlorethylen, Äther, Amylacetat, Benzol und vorzugsweise Methylenchlorid. Die Verbindung der Formel I erhält man mit guter Ausbeute, indem man den pH-Wert des mit Bicarbonat behandelten Reaktionsgemischs mit einer konzentrierten Mineralsäurelösung, beispielsweise konzentrierter Salzsäurelösung, auf einen pH-Wert von etwa 2 einstellt. Dann wird das Reaktionsgemisch mit einem der genannten Lösungsmittel extrahiert. Der Extrakt enthält die Verbindung der Formel I. Bei langsamer Zugabe von Cyclohexan zu dem erhaltenen Extrakt erhält man die kristalline Verbindung der Formel I mit einem Fp von 107° bis 110⁰C.

Die Verbindung der Formel I eignet sich als Zwischenprodukt bei der chemischen Synthese geeigneter Steroide. So kann sie beispielsweise in ein bei dem aus der US-PS 3 330 384 bekannten Verfahren zur Totalsynthese wertvoller 19-Norsteroide verwendeten Ausgangsmaterial umgewandelt werden. Diese Umwandlung in ein aaO genanntes Ausgangsmaterial läßt sich in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Behandeln mit Essigsäureanhydrid und Ilatriumacetat, bewerkstelligen (vgl. beispielsweise "J. Am. Chem. Soc." 85, Seiten 2135 bis 2137).

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Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veranschaulichen, Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben "Gev/ichtsprozente". Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nicht anders angegeben, "Volumina".

Beispiel 1

Herstellung der Iiutante H. fortuitum DSM 775 aus II. fortuitum ATCC 6342:

a) I Jitrosoguanidin-Iiutagenese:

Zellen von M. fortuitum ATCC 6042 v/erden bei einer Temperatur von 2J⁰C in einem sterilen ,
sammensetzung wachsen gelassen:

tür von 2J⁰C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zu

ilährbrühe 3 g/l

Ilefeextrakt 1 g/l

Ilatriumpropionat 0,5 g/l

mit destilliertem V/asser aufgefüllt auf 1 1

Der pH-V/ert des Mediums wird mit in-LfaOH vor einer 20-minütigen Sterilisation bei 121⁰C auf 7,0 eingestellt.

Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5 x 10 /ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen 0,Im-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpufier resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schließlich wird IJitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 ug/ml

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zugesetzt. Die Zellensuspension v:ird in einem Wasserbad Ϊ0 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, worauf erneut ein aliquotem Te:'l zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der liest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen O,1m-Kaliumphosphats eines ρΙΐ-Werts von 7,0 gev;aschen. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen IliniifialsalzKiedium ohne Kohlenstofflieierant der folgenden Zusammensetzung:

IiIl₄IiO₃ 1,0 g/l

K₂IIPO₄ 0,25 g/l

KgSO₄-7H₂O 0,25 g/l

UaCl 0,005 g/l

FeSO₄-7H₂O 0,001 g/l

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1

resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20-minütigen Sterilisieren bei 121⁰C nit In-IICl auf 7,0 eingestellt. Endlich v/erden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet.

b) Auswahl und Isolierung der Mutante II. fortuitum DSM 775:

Die in der geschilderten Weise mutierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fräser, und Jerrel, 1963 "J. Biol. Chem.», 205, 291 bis 295):

Glyzerin 10,0 g/l

Ua₂IIPO₄ 0,4 g/l

KII₂PO₄ 4,5 g/l

InI₄Cl 2,0 g/l

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7H₂O 0,3 g/l

FeCl-.61I₂O 0,05 g/l

mit destillierten Wasser aufgefüllt auf 1 1

iiach Zugabe von 15 g/l Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 121⁰C erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch dos Mutationsverfahren gebildeten ilührauxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7-tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 2o°c werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G.E. Peterson, H.L. Lewis und J.R. Davis "Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media", J. Lipid Research 3, 275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/l Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstoff lief eranten v/erden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121⁰C im Autoklaven erhitzt wird. Das sterile, heiße Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäß gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schließlich in sterile Petrischalen gegossen. Bei diesen Maßnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmischen des heißen Gemischs und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstoff-

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-Vr- ?74 6 3 23

lief eranten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird.

Die auf den Kor.trollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Festplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf ilährogarplatten gereinigt, Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 2J°C v/erden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den llähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterfiter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen PhenotypuG aufweisen, v/erden denn in Schüttelf laschen ausgewertet.

c) Schüttelflaschenauswertunß:

Es werden 5CO ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glyzerin 10,0 g/l

Ha₂HPO₄ 3,4 g/l

KII₂PO₄ 4,5 g/l

IiH₄Cl 2,0 g/l

MgSO₄-7H₂O 0,3 g/l

FeCl₃-6H₂O 0,05 g/l mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1

Hierauf v/erden in das Medium 1 g/l Sojamehl und dann 10 g/l Sitosterin eingemischt. Nach 20-minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklaven auf 121⁰C werden sie auf 26⁰C

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abgekühlt und dann ir it 10 ml eines v:ie folgt hergestellten Saatguts beimpft:

Die vereinigten Isolate aus Stufe b) werden bei einer Temperatur von 2o°C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung:

iiahrbrühe ü g/l

Hefeextrakt 1 g/l

Glyzerin 5 g/l

mit destilliertem V/asser aufgefüllt auf 1 1

wird eine von einem geneigten Agar entnommene Use voll Zellen verwendet.

Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 20-minütigen Erhitzen der Flaschen auf 121⁰C in einem Autoklaven mit In-IJaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28⁰C inkubiert.

Wie bereits erwähnt, v/erden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30°C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d.h. 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von Ver-

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- Vr - ? '/ Λ 6 3 2

bindungen der Formeln II und V bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch die durch Mutation des Kutter-I-Iycobacterium fortuitum ATCC 6342 erhaltene Hutante.

Aul" die Herstellung der Hutante wird hier kein Wert gelegt.

Beispiel 2

Umwandlung von Sitosterin in die Verbindung der Formel I:

Im vorliegenden Falle wird ein entsprechendes Ilährmedium v:ie im Beispiel 1c) verwendet, jedoch mit der Ausnahme, daß sein pH-Wert mit 4n-NaOH auf etwa 7,5 eingestellt wird. Danach wird das Ilährmedium durch 30-minütiges Erhitzen auf eine Temperatur von 121⁰C sterilisiert, liach dem Abkühlen auf eine Temperatur von 28°C wird es mit 10 Teilen einer Saatkultur der Mutante H. fortuitum DSH 775, die entsprechend Beispiel 1c) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegen zur Förderung eines submersen Wachstums 168 h lang bei einer Temperatur von 28°C inkubiert. Erforderlichenfalls wird der pH-Wert durch Zugabe von WaOH zwischen 7 und 9 gehalten. Das Fortschreiten der biologischen Umwandlung wird durch Ansäuern eines Teils des Reaktionsgemischs auf einen pH-Wert von 2 mit konzentrierter Salzsäurelösung, Extrahieren mit 4 Volumina Methylenchlorid und Chromatographieren des Extrakts auf dünnr.chichtchromatographischen Silikagel-Platten unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 60:40:1 (Volumina) Äthylacetat/Cyclohexan/Eisessig verfolgt.

Nach beendeter biologischer Umwandlung werden die gebildeten Reaktionsprodukte auf folgende V/eise isoliert. Zunächst wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe einer ge-

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? 7 ^ R 3 2 3

sättigten Ilatriumbicarbonatlösung aui" einen pll-l/ert von Ö gebracht und dann mit Iiethylcnchlorid exxrahiert. Dieser Extrakt, der die Verbindungen der Formeln II bis V, jedoch nicht die Verbindung der Formel I, enthält,wird durch Diatomeenerde filtriert, worauf das Filtrat zur Trockene eingedampft wird. Der Verdampfungsrückstand wird in Chloroform aufgenommen und auf Silikagel chromatographiert. Als Entwickler bedient man sich des handelsüblichen Lösungsmittels Gkellysolve B und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen an Äthylacetat. Hierbei werden die Verbindungen der Formeln II, III und IV, jedoch nicht der Formel V, eluiert. Letztere wird aus der Säule mit 5^ Methanol enthaltendem Äthylacetat ausgetrieben. Die Reihenfolge des Eluierens der Verbindungen ist II—)III—^IV—>V. Die einzelnen Produkte erhält man durch Sammeln von durch Dünnschichtchromatographie als geeignet erkannten Fraktionen und Eindampfen derselben zur Trockene. Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat erhält man die Verbindung II in Form eines 1:1-Gemischs aus zv/ei Epimeren eines Fp von 100° bis 112°C, die Verbindung der Formel IV eines Fp von 122° bis 124°C und die Verbindung V eines Fp von Λ^° bis 150⁰C.

Die Verbindung der Formel I erhält man in guter Ausbeute durch Einstellen des pH-Jerts des Bicarbonat-behandelten Reaktionsgemische auf 2 mit konzentrierter Salzsäurelösung, erneute Extraktion mit Chloroform oder Hethylenchlorid und Auskristallisieren des Produkts durch langsame Zugabe von Cyclohexan. Die Verbindung der Formel I besitzt einen Fp von 107° bis 110⁰C.

Beispiel 3

Bei Ersatz des Sitosterins des Beispiels 2 durch Cholesterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

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Beispiel 4

Bei Ersatz des Sitosterins von Beispiel 2 durch Stigmasterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel 5

Bei Ersatz des Sitosterins von Beispiel 2 durch Campesterin erhält man ebenfalls die Verbindung; der Formel I.

Beispiel 6

Bei Zusatz einer Korabination aus den Steroiden der Beispiele ■3 bis 5 zu Sitosterin oder bei Verwendung einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 3 bis 5 anstelle von Sitosterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel 7

Durch Ersatz von Ilycobacterium fortuitum ATCC 6^A2 durch einen sterinabbauenden Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Hocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptorayces erhält man Ilikroorganisnusmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und durch Bildung von hauptsächlich der Verbindung I in der Gärbrühe auszeichnen.

Beispiel 8

Durch Ersatz der Hutante M. fortuitum DSU 775 in Beispielen 2 bis 6 durch die gemäß Beispiel 7 hergestellten Hutanten erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

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BAD

Beispiel 9

Durch Ersatz des Ii. f or tu i turn AxCC 6ü42 in Beispiel 1 durch einen nterinabbr.uenden hikroorganismus der Gruppe Hycobacteriun phlei, I -iyc ο bacterium snegmatis, Ilycobrcterium rhodochrous, Hycobacterium rnicosum oder Iiycobacteriuni butyricum erhält man lükroorganismusmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und durch Bildung von hauptsächlich Verbindungen der Formel I in der Gärbrühe auszeichnen.

Beispiel 10

Durch Ersatz der Iuutante Hycobacterium fortuitum DSH 773 in Beispieler 2 bis 6 durch die gemäß Beispiel 9 hergestellten iiutanoen erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel 11

Durch Ersatz der. Sitosterins im Beispiel 2 durch Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron oder Testosteron erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel 12

Durch Ersatz des Sitosterins von Beispiel 2 durch zwei oder mehrere Verbindungen, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

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Beispiel Λ-j

Durch Ersatz der 1-iU.tante Mycobacterium fortuitura DoIi 11b in Beispielen 11 und 12 durch die gemäß Beispiel 7 hergestellten i-iuuC'.nten erhalt man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel 14

Durch Ersatz der Ilutante II. fortuitura ÜSII 775 in Beispielen Ti unc 12 durch die gemäß Beispiel 9 hergestellten Mutanten erhält man ebenfal]s die Verbindung der Formel I.

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Claims

Patentansprüche

dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 9 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dlen-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron oder Testosteron verwendet.

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ORIGINAL INSPECTED
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androste-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einem pH-Wert des Mediums von etwa 7,5 durchführt.
6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:

dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mikroorganismusmutante aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Ansammlung von vornehmlich 3act-H-4a-[3'-Propionsäure J-7aß-methylhexahydro-1,5-indandion

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in der Gärbrühe auszeichnen, in einem wäßrigen Ilährmedium bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 9 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseltenkette mit 2 bis einschließlich 10 Koh-1ens to ffa tomen züchte t.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismusmutante in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron oder Testosteron verwendet .
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,i7-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, verwendet.
10. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:

HOOC

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dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mycobacteriummutante, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von hauptsächlich 3aa-H-4a-[3'-Propionsäure ]-7aß-methylhexahydro-1,5-indandion in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wäßrigen Nährmedium bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 9 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorgani smusmu tan te in einem v/äßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron oder Testosteron verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, verwendet.
14. Verfahren zur Herstellung einer vornehmlich eine Verbindung der Formel:

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enthaltenden Gärbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium bei einem plWWert von etwa 7 bis etwa 9 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron oder Testosteron verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemische aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-βη-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, verwendet.
18. Verfahren zur Herstellung einer vornehmlich eine Verbindung der Formel:

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?^r/z,f,323

enthaltenden Gärbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mikroorganismusmutante aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Ijocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Ansammlung von vornehmlich 3aa-H-4cc- [3' -Propionsäure ]-7aßmethylhexahydro-1,5-indandion in der Gärbrühe auszeichnen, in einem wäßrigen Uährmedium bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 9 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismusmutante in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.
20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron oder Testosteron verwendet.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsia -1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, verwendet.
22. Verfahren zur Herstellung einer vornehmlich eine Verbindung der Formel:

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enthaltenden GärbrUhe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mycobacterium-Mutante, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von hauptsächlich 3aa-H-4a-[3'-Propionsäure]-7aß-methylhexahydro-1,5-indandion in der GärbrUhe auszeichnet, in einem wäßrigen Nährmedium bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 9 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen suchtet.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorgjanismusmutante in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemische aus zwei oder mehreren Steroiden zUchtet.

2k. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron oder Testosteron verwendet.

23. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin,

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Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, verwendet.

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