DE3215065C2

DE3215065C2 -

Info

Publication number: DE3215065C2
Application number: DE3215065A
Authority: DE
Inventors: Merle Gene Wovcha; John Costain Knight; Alfred Benjamin Kalamazoo Mich. Us Garcia
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1981-05-11
Filing date: 1982-04-22
Publication date: 1989-11-30
Also published as: HU189135B; US4429041A; GB2098218A; FR2505360A1; IT1189273B; CH650803A5; IE821109L; JPH0157960B2; NL8201874A; IT8248374A1; GB2098218B; FR2505360B1; IE53238B1; DE3215065A1; DD202308A5; IT8248374A0; JPS57198099A

Description

Aus der US-PS 40 29 549 ist die Verwendung von Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 zur Herstellung von 9-Hydroxy-3-oxo-4-pregnen-20-carbonsäure[9-hydroxybisnoracid] bekannt. Dieselbe Mutante dient gemäß der US-PS 40 35 236 zur Herstellung von 9-Hydroxy-4-andro sten-3,17-dion[9-hydroxyandrostendion] bzw. gemäß der US-PS 42 14 051 zur Herstellung von 9-Hydroxy-3-oxo-4- pregnen-20-carbonsäuremethylester[9-hydroxybisnoracidmethylester].

Aus der EP-Patentanmeldung 79 104 372.2 ist ein zweistufiges Fermentationsverfahren zur Herstellung der als Zwischenprodukt bei der Synthese wertvoller Corticoide wertvollen 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)pregnadien-20-Carbonsäure bekannt. Bei dem bekannten Verfahren erfolgt zunächst eine Umwandlung von Sterinen in 3-Oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure durch Fermentation mit dem Mycobacteriumstamm NRRL B-8054. Danach wird diese Verbindung durch Inkubation mit irgendeinem zur Einführung einer Hydroxylgruppe in 9α-Stellung befähigten Mikroorganismus in 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure überführt.

Gegenstand der Erfindung ist demgegenüber ein einstufiges Fermentationsverfahren zur Herstellung des wertvollen Zwischenprodukts 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure. Dieses Verfahren wird mit Hilfe einer neuen Mutante von M. fortuitum NRRL B-8119, nämlich M. fortuitum NRRL B-12 433, durchgeführt.

Das erfindungsgemäße einstufige Fermentationsverfahren stellt eine deutliche Verbesserung des aus der genannten EP-Patentanmeldung bekannten zweistufigen Fermentationsverfahrens dar.

Im folgenden wird die Herstellung des im Rahmen des erfindungsgemäßen einstufigen Fermentationsverfahrens einsetzbaren und als Hauptprodukt eines Sterinabbaus 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure bildenden neuen Stammes M. fortuitum NRRL B-12 433 erläutert.

Mycobacterium fortuitum NRRL B-8199 (vgl. Beispiel 1 der US-PS 40 29 549) wird in einem Medium aus (pro Liter) 8 g Nährbrühe, 1 g Hefeextrakt, 5 g Glyzerin, 0,1% (w/v) Tween 80 (vgl. Römpps Chemie Lexikon, 7. Auflage 1977, Franckh'sche Verlagshandlung Stuttgart, Stichwort "Tween", Seite 3710) und destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 31°C wachsen gelassen. Das Medium wird durch 20minütiges Erhitzen in einem Autoklaven unter einem Druck von 103 kPa sterilisiert. Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5×10⁸ pro ml wachsen gelassen und dann auf einem sterilen 0,2-µm-Filter gesammelt. Nachdem die Zellen mit einem gleichen Volumen eines sterilen 0,1 M-Natriumcitratpuffers eines pH-Werts von 5,6 mit 0,1% Tween 80 gewaschen und dann in dem halben Volumen desselben Puffers resuspendiert wurden, wird N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von 100 µg/ml zugesetzt, worauf die Zellensuspension 1 h bei 31°C inkubiert wird. Nun werden die Zellen mit zwei Volumina eines sterilen 0,1 M-Kaliumphosphatpuffers eines pH-Werts von 7 mit 0,1% Tween 80 gewaschen und dann in einem Volumen desselben Puffers resuspendiert.

Ferner wird ein Medium aus (pro Liter) 8 g Nährbrühe, 5 g NaCl und 5 g Glyzerin und destilliertem Wasser zubereitet. Nach Zugabe von Agar in einer Menge von 15 g/l wird das Medium 20 min lang unter einem Druck von 103 kPa einer Autoklavenbehandlung unterworfen und dann in sterile Petrischalen gegossen. Danach werden die mutierten Zellen auf dem geschilderten Medium gezüchtet. Die auf den Platten gewachsenen Kolonien werden danach im Rahmen von Versuchsfermentationen auf ihre Fähigkeit zur Umwandlung von Sterinen in 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure getestet. Der Nachweis der gewünschten Verbindung erfolgt durch Dünnschichtchromatographie von Methylenchloridextrakten der Versuchsfermentationen unter Verwendung von Silicagel und Methylenchlorid/Aceton/Essigsäure (212/38/1) als Lösungsmittelsystem. Auf diese Weise läßt sich die zur Ansammlung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure als Hauptprodukt der biologischen Umwandlung von Sterinen anhäufende Mutante NRRL B-12 433 isolieren.

Der Schlüssel für die Isolierung der beschriebenen Mutante ist, daß man mit einer Mutante, z. B. NRRL B-8119, die hinsichtlich des Steroidringabbaus bereits derart blockiert ist, daß sie 9α-Hydroxyandrostendion liefert, beginnt und diesen Mikroorganismen einer zweiten Mutation, die dann einen Einfluß auf den Sterinseitenkettenabbau besitzt, unterwirft.

Die die geschilderte biologische Umwandlung herbeiführende Mutante unterscheidet sich von ihrer Mutterkultur, beispielsweise Mycobycterium fortuitum NRRL B-8119 lediglich in ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle. In sämtlichen sonstigen Eigenschaften, z. B. der Morphologie und der Chemikalienempfindlichkeit, entspricht sie der Mutterkultur, wenn sie mit dieser nicht sogar identisch ist. Beide M.-fortuitum-Kulturen sind säurefeste, nicht bewegliche, nicht sporenbildende Bazillen, die zur Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales gehören. Nach der Klassifizierung von Runyon (vgl. E. H. Runyon in "Med. Clin. North America", Bd. 43, S. 273 [1959]) handelt es sich um ein nicht chromogenes Mycobacterium der Gruppe IV, d. h. um ein bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht pigmentierter Kolonien auf relativ einfachen Medien wachsendes Mycobacterium.

M. fortuitum NRRL B-8119 und NRRL B-12 433 sind in der Dauersammlung von Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt und auf Anfrage von dieser Hinterlegungsstelle erhältlich.

9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure eignet sich als Zwischenprodukt bei der Herstellung wertvoller Corticoide. So läßt es sich beispielsweise gemäß den Lehren der EP-Patentanmeldung 79 104 372.2 in Hydrocortisonaacetat überführen.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher erläutern. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Angaben "Prozente" - "Gewichtsprozente". Sämtliche Verhältnisse bei Lösungsmittelgemischen stellen, soweit nicht anders angegeben, "Volumenverhältnisse" dar.

Beispiel 1 Fermentation von rohem Sitosterin

Das biologische Umwandlungsmedium bzw. Biotransformationsmedium enthält (pro Liter) 8,0 g Ucon, 5,0 g Cerelose, 3,0 g NH₄Cl, 3,0 g CaCO₃, 3,0 g Na₃(citrat) · 2 H₂O, 2,0 g Tween 80, 1,0 g Sojamehl, 0,5 g KH₂PO₄, 0,5 g Harnstoff und 30,0 g rohes Sitosterin in Leitungswasser. Der pH-Wert des Mediums ist auf 7,0 eingestellt. Mit jeweils 100 ml dieses Mediums gefüllte Kolben werden mit 10 ml Saatkulturen von bei 28°C in einem Medium aus (pro Liter) 8,0 g Nährbrühe, 5,0 g Glyzerin, 1,0 g Hefeextrakt und 1,0 g Tween 80 in destilliertem Wasser (pH-Wert: 7,0) gezüchtetem M. fortuitum NRRL B-12 433 beimpft. Danach werden die Kulturen 336 h lang bei einer Temperatur von 28°C auf einem Drehrüttler inkubiert. Nach der Inkubation wird entsprechend Beispiel 3 das Gemisch extrahiert und das Produkt isoliert.

Beispiel 2

Entsprechend Beispiel 1 werden anstelle von Sitosterin andere Sterinsubstrate in roher oder reiner Form, z. B. Sitosterin und/oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.

Beispiel 3 Isolierung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure aus M.-fortuitum-NRRL B-12 433-Fermentation

1200 ml Fermentationsbrühe aus der mit Hilfe von M. fortuitum NRRL B-12 433 durchgeführten biologischen Sitosterinumwandlung werden angesäuert und zweimal mit gleichen Volumina Methylenchlorid extrahiert, wobei 29,2 g bzw. 8,9 g Rohextrakt erhalten werden.

Der erste Extrakt wird erneut in Methylenchlorid gelöst, worauf die alte Lösung mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen wird. Die wäßrigen Waschwässer werden gesammelt, mit verdünnter (4-N) HCl angesäuert und mit Methylenchlorid rückextrahiert. Der Extrakt wird über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Beim Verdampfen des Lösungsmittels erhält man einen gelben Feststoff, der mit Methylenchlorid verrieben wird. Hierbei erhält man ein fahlgelbes Pulver. Dieses wird aus einem Gemisch aus Methylenchlorid und Methanol zur Kristallisation gebracht, wobei drei verschiedene Chargen, nämlich a) 3,8 g, b) 2,1 g und c) 2,8 g, erhalten werden. Aufgrund einer Untersuchung durch Kernresonanzspektralphotometrie ergibt sich, daß es sich hierbei um Gemische der Säuren mit der Δ ¹⁷⁽²⁰⁾-Dehydroverbindung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure in Konzentrationen von 90%, 35% und 10% handelt.

Beim dreimaligen Umkristallisieren der ersten Charge aus Methylenchlorid/Methanol erhält man 1,8 g 9-Hydroxy- 3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure eines Fp von 240° bis 242°C und einer Drehung [a]_D von 40,7° in Methanol. Das Massenspektrum zeigt ein Molekülion bei m/e 358 (C₂₂H₃₀O₄).

Claims

1. Mycobacterium fortuitum NRRL B-12 433.

2. Einstufiges Fermentationsverfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel: dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum NRRL B-12 433 unter aeroben Bedingungen in Anwesenheit eines Steroids mit C-17-Seitenkette in einem wäßrigen Nährmedium züchtet und das gewünschte Produkt reindarstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung des Stammes Mycobacterium fortuitum NRRL B-12 433 in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin und/oder Campesterin durchführt.