DE2802524C2

DE2802524C2 - Verfahren zur Herstellung von 3a alpha- H-4alpha- eckige Klammer auf 3'-Propanol eckige Klammer zu -7abeta-methylhexahydro- 1,5-indandion-hemiketal

Info

Publication number: DE2802524C2
Application number: DE2802524A
Authority: DE
Inventors: Thomas Richard Portage Mich. Pyke; Marion Patricia Kalamazoo Mich. Salmond
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1977-02-14
Filing date: 1978-01-20
Publication date: 1983-04-28
Also published as: MX4866E; DE2802524A1; FR2380342A1; JPS5435292A; NL7801087A; US4097335A; GB1570622A; JPS5730475B2; HU179647B; PL110996B1; FR2380342B1; IL53796A0; PL204613A1

Description

Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits untersucht 1972 (vgl. US-PS 36 84 657) berichten Kxaychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst-l,4-dien-3,17-dion und 20<x-Hydroxymethylpregna-l,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 37 59 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektiv mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,l7-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.

Interessant ist auch ein mit »Formation of low molecular degradation products from progesterone by microorganisms« betitelter Artikel von K. Schubert, K. H. Böhme und C. Horhold in »Steroids« 4, Seiten 581 bis 586 (1964). Diese Autoren beschreiben die Bildung tricyclischer Zwischenprodukte beim Abbau von Progesteron durch Mycobacterium smegmatis.

Die Züchtung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus-Mutante Mycobacterium fortuitum DSM 775 ist in den DE-OS 26 52 377 und 27 46 323 beschrieben. Die in den genannten DE-OS beschriebenen Verfahrensbed^;ngungen führen noch nicht zu einer optimalen Bildung der erfindungsgemäß gewünschten Verbindung, nämlich von 3a«-H-4«-[3'-PropanoI]-7aJS-methylhexahydro-l,5-indandion-hemiketal der Formel:

fahren gemäß der Erfindung wird eine Mutante zurr: Einsatz gebracht, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Ansammlung bzw. Anhäufung von vornehmlich Verbindung der Formel (I) in der Gärbrühe auszeichnet

Diese Mutanten erhält man nach den nachstehend näher erläuterten Mutationsmaßnahmen oder anderen Mutationsmaßnahmen aus Mycobacterium fortuitum.

Beispiele für erfindungsgemäß selektiv abbaubare Steroide sind Sitosterine, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin und ähnliche Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen, und Androst-4-en-3,l 7-dion, Androsta-l,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron, Testosteron und Bis-norsäure (3-Ketobisnorchol-4-en-22-oesäure). Diese Steroidsubstrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.

Neben der gewünschten Verbindung der Formel I entstehen in der Gärbrühe auch untergeordnete Mengen:

3a«-H-4«-[3'-Propanol]-5«-hydroxy-7a^-methylhexahydro-1-indanon-hemiacetal der Formel

30 HO

(Π)

3aa-H-4a-[3'-Propionsäure]-5aⁱ-hydroxy-7ayS-methylhexahydro-l-indanon-(5-lacton der Formel

40

45

3aa-H-4ff-[3'-Propanol]-5ir-hydroxy-7a/?-methylhexahydro-1-indanon der Formel

HO

(iv)

und 3aa-H-4a-[3'-Propionsäure]-7a/?-methylhexahydro-1,5-indandion der Formel

Bei dem neuen mikrobiologischen Umwandlungsver-

(V)

Für den Erfindungszweck wurde in der später beschriebenen Weise die Art Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 zu einer neuen Laboratoriums-Mikroorganismus-Mutante mutiert. Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: »J. C Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 90 37C«. M. fortuitum, ATCC 6842 baut Sterine nicht-selektiv zu niedrig-molekularen Verbindungen, beispielsweise CO₂+ H₂O, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.

Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 mittels Nitrosoguanidin erhält man die genannte neue Mutante, die selektiv Steroide mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der Gärbrühe zu hauptsächlich einer Verbindung der Formel 1 abzubauen vermag.

Die neue Mikroorganismus-Mutante ist in vermehrungsfähigem Zustand am 16. November 1976 bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft for Strahlen- und Umweltforschung M.B.H. München, Grisebachstr. 8, D-3400 Göttingen, unter der Hinterlegungsbezeichnung DSM 775 hinterlegt und mit Freigabeerklärung vom 1. Dezember 1976 freigegeben worden.

Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenempfindlichkeit von M. fortuitum DSM 775 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsart M. fortuitum ATCC 6842 nicht zu unterscheiden. Beide M. fortuitum-Kulturen stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-sporenbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyon'schen Klassifizierung (vgl. E. H. Runyon »Med. Clin. North America« 43,273 (1959)) handelt es sich um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d. h. es wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht pigmentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien.

M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum DSM 775 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steoridmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nicht-selektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum DSM 775 erfolgt dagegen ein selektiver Abbau der Steroide. Diese Eigenschaft von M. fortuitum DSM 775 stellt eine in hohem Maße wertvolle Eigenschaft dar.

Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 zu M. fortuitum DSM 775 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmaßnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmaßnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und Umwandlungs- bzw. Transformationsmaßnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder äquivalente Maßnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.

Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum DM 775 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsub- b5 strats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/L Die Kultur wird in einem Nähnr.edium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maisquellflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauuungsprodukte von Casein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze and dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt zu werden, da Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen. Vor der Sterilisation des Mediums wird dessen pH-Wert auf etwa 6,5 eingestellt Die pH-Werteinstellung kann mittels einer starken Base, beispielsweise NaOH, KOH und dergleichen erfolgen.

Das für eine erfolgreiche Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung zur Bildung von vornehmlich Verbindung der Formel I kritische Merkmal ist die Aufrechterhaltung eines pH-Werts von etwa 3,0 bis etwa 6,0, vorzugsweise von etwa 5,5 oder darunter. Die Aufrechterhaltung des pH-Werts läßt sich in üblicher bekannter Weise, beispielsweise mittels CaCO3 oder eines Phosphatpuffers in dem Medium oder durch pH-Wertsteuerung mittels einer Base, z. B. Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid und dergleichen, oder mit einer Säure, beispielsweise HCl, H₂SO₄ und dergleichen, bewerkstelligen. Weiterhin läßt sich der pH-Wert auf der gewünschten Höhe halten, indem man überschüssige Mengen an solchen Nährstoffen zusetzt, bei deren Metabolismus der pH-Wert gesenkt wird. Beispiele für solche Verbindungen sind lösliche Ammoniumsalze, Kohlenhydrate, wie Glucose und andere Mono- und Disaccharide, Stärke und sonstige Polysaccharide, sowie öle und Fette, wie Schweineschmalz und Sojabohnenöl.

Das Umwandlungsverfahren dauert etwa 72 h bis 15. Tage. Die Inkubationstemperatur während des Umwandlungsverfahrens reicht von etwa 25° bis etwa 37⁰C und beträgt vorzugsweise 31°C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus bewegt. Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.

Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschließlich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind Chloroform,

Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichlorethylen, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen, vorzugsweise Methylenchlorid.

Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in -!bücher bekannter ϊ Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbcren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- oder Fermentationsbrühe läßt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.

Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthaltende Rückstand kann dann in einem 10% Chloroform enthaltenden handelsüblichen Hexanisomerengemisch gelöst und auf Silikagel chromatographiert werden, wobei als Entwickle-lösungsmittel das handelsübliche Hexanisomerengemisch und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen an Äthylacetat verwendet werden. Hierbei läßt sich die Verbindung der Formel I eluieren. Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat erhält die Verbindung der Formel I, nämlich ein 1 :1-Gemisch der beiden Epimeren, einen Fp von 100° bis 112°C. Ein kristallines Produkt erhält man auch mit Hilfe eines Lösungsmittels, z. B. Äthylacetat Weiterhin erhält man das gewünschte umgewandelte Steroid auch aus der überstehenden Flüssigkeit nach jo Verdampfen des darin enthaltenen Lösungsmittels.

Die Verbindung der Formel I eignet sich als Zwischenprodukt bei der chemischen Synthese wertvoller Steroide. So können sie beispielsweise in die bei dem aus der US-PS 38 80 884 bekannten Verfahren zur Totalsynthese wertvoller 19-Norsteoride verwendeten Ausgangssubstanzen umgewandelt werden. Diese Umwandlung in die aaO genannten Ausgangssubstanzen läßt sich in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Oxidation mit Chromsäure in Essigsäure und anschließender Nachbehandlung mit Essigsäureanhydrid und Natriumacetat bewerkstelligen (vgl. »Biochem.« 2,1238 bis 1243 und »]. Am. Chem. Soc.« 85,2135 bis 2137).

Die Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes .angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben »Gewichtsprozente«. Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nichts anderes angegeben, »Volumina«.

Beispiel 1

einer 20minütigen Sterilisation bei 121°C auf 7,0 eingestellt

Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5XlO⁸ZmI wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kfigelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen O.lm-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewachsen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schließlich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugesetzt Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37° C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1 m-Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:

Herstellung der Mutante M. fortuitum DSM 775 aus fortuitum ATCC 6842

55

a) Nitrosoguanidin-Mutagenese

Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 28° C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen: mi

Nährbrühe 8 g/l

Hefeextrakt 1 g/l

Natriumpropionat 0,5 g/l mit destilliertem Wasser aufgefüllt hi

auf 1 1

Der DH-Wert des Mtdiums wird mit In NaOH vor

NH4NO3	1,0 g/l
K₂HPO₄	0,25 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,25 g/l
NaCI	0,005 g/l
FeSO₄ · 7 H₂O	0,001 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt

au!

11

resuspendiert Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20minütigen Sterilisieren bei 121^CC mit In HCI auf 7,0 eingestellt Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet.

b) Auswahl der Isolierung der Mutante M. fortuitum DSM 775

Die in der geschilderten Weise mutierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fräser und Jerrel, 1963 »J. Biol. Chem.«, 205,291 bis 295):

Glyzerin	10,0 g/l
Na₂HPO₄	8,4 g/l
KH₇PO₄	4.5 g/l
NH₄CI	2,0 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,3 g/l
FeCl₃ · 6 H₂O	0,05 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt
auf	11

Nach Zugabe von 15 g/l Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 121°C erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutationsverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28⁰C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G. E. Peterson, H. L. Lewis und J. R. Davis »Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in

agar media«, J. Lipid Research 3, 275 bis 276 (1062) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/l Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121 ° C im Autoklaven erhitzt wird. Das sterile, heiße Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäß gegossen, mehrere Minuten durchgemischt und schließlich in sterile Petrischalen gegos- ι ο sen. Bei diesen Maßnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmischen des heißen Gemischs und durch Abdämmen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird.

Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28° C werden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in Schüttelflaschen ausgewertet.

c) Schüttelflaschenauswertung

Es werden 500 ml Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung verwendet: r>

Glyzerin	10,0 g/I
Na₂HPO₄	8,4 g/l
KH₂PO₄	4,5 g/l
NH₄Cl	2,0 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,3 g/l
FeCl₃ ■ 6 H₂O	0,05 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt
auf	11

Hierauf werden in das Medium 1 g/l Sojamehl und dann 10 g/I Sitosterin eingemischt Nach 20minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklaven auf 121 °C werden sie auf 28° C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Sattguts beimpft:

Die vereinigten Isolate aus Stufe b) werden bei einer Temperatur von 28° C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung: :

Nährbrühe	8 g/I
Hefeextrakt	lg/1
Glyzerin	5 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt
auf	11

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wird eine von einem geneigten Agar entnommene Öse voll Zellen verwendet.

Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dein 20minütugen Erhitzen der Flaschen auf 121°C in einem Autoklaven mit In NaOH auf 7,0 eingestellt Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28° C inkubiert.

Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500 ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30° C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d. h. 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von Verbindungen der Formeln I und V bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch die neue Mutante aus dem Muttermycobacterium fortuitum ATCC 6842.

Beispiel 2

Umwandlung von Sitosterin in die Verbindung
der Formel I

Es wird ein entsprechendes Medium wie in Beispiel Ic) verwendet jedoch mit der Ausnahme, daß sein pH-Wert mit 4n NaOH auf etwa 6,5 eingestellt wird. Dieses Medium wird durch 30minütiges Erhitzen auf eine Temperatur von 121°C sterilisiert, danach auf eine Temperatur von 28° C abgekühlt und schließlich mit 10 Teilen einer Saatkultur der entsprechend Beispiel la) gewonnenen Mutante M. fortuitum DSM 775 beimpft. Das beimpfte Gemisch wird 168 h bei einer Temperatur von 28°C unter Bewegen zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Sofern erforderlich, wird der pH-Wert des Mediums durch Zugabe von NaOH oder einer Säure, beispielsweise HCl, auf etwa 5,0 gehalten. Das Fortschreiten der Biotransformation läßt sich auf chromatographischem Wege durch Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten mittels eines Lösungsmittelsystems auf 3:2 Volumina Cyclohexan/Äthylacetat verfolgen.

Nach beendeter biologischer Umwandlung wird das gewünschte Produkt wie folgt isoliert: Das Reaktionsgemisch wird zunächst mit Methylenchlorid extrahiert, worauf der erhaltene Extrakt durch Diatomeenerde filtriert und das Filtrat zur Trockene destilliert wird. Der hierbei erhaltene Destillationsrückstand wird in 10% Chloroform enthaltendem Hexanisomerengemisch aufgenommen und auf Silikagel chromatographiert. Als Entwickler werden ein Hexanisomerengemisch und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen Äthylacetat verwendet Bei dieser Maßnahme wird die gewünschte Verbindung der Formel I in einer Ausbeute von mindestens 90% der Theorie, bezogen auf das eingesetzte 1 g Sitosterin, eluiert Diese besitzt einen dünnschichtchromatographisch ermittelten Rf-Wert von 037 (Fließmittel: Cyclohexan/Äthylacetat = 3 :2). Die Verbindung der Formel I besitzt einen Fp von 100° bis 112°C

Beispiel 3

Bei Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Cholesterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel 4

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Stigmasterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel 5

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Campesterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel 6

Bei Zusatz einer Kombination aus den Steroiden der Beispiele 3 bis 5 zu Sitosterin oder bei Verwendung einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 1 bis 5 anstelle von Sitosterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel 7

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron, Testosteron oder Bis-norsäure erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiele

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch zwei oder mehrere Verbindungen, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-l,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron, Testosteron und Bis-norsäure erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 3ae-H-4ff-[3'-Propanol] - 7aj? - methylhexahydro -1,5 - indandionhemiketal der Formel:

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durch Züchten von Mycobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeoroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Züchtung einen pH-Wert des Nährmediums von etwa 3,0 bis etwa 6,0 einhält

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses mit Sitosterin bei einem pH-Wert des Nährmediums von etwa 5 durchführt.