DE2802524A1

DE2802524A1 - Verfahren zur herstellung von 3a alpha- h-4alpha- eckige klammer auf 3'-propanol eckige klammer zu -7abeta-methylhexahydro- 1,5-indandion-hemiketal

Info

Publication number: DE2802524A1
Application number: DE19782802524
Authority: DE
Inventors: Thomas Richard Pyke; Marion Patricia Salmond
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1977-02-14
Filing date: 1978-01-20
Publication date: 1978-08-17
Also published as: JPS5435292A; FR2380342B1; JPS5730475B2; MX4866E; PL204613A1; US4097335A; FR2380342A1; DE2802524C2; HU179647B; NL7801087A; IL53796A0; PL110996B1; GB1570622A

Description

Verfahren zur Herstellung von 3aa-H-4a-[3'-PropanolJ-7aß-methylhexahydro-1,5-indandion-hemiketal

Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde "bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937 "Berichte" 70, 470 und "Berichte" 70, 2079· AaO wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17ß-Hydroxysteroiden mit Hilfe von Qärhefe berichtet. Im Jahre 1952 (vgl. US-PS

2 602 769 berichten Peterson und Murray über die 11cc-Hydroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Ehizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 3 684 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. HEEIi B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3»17-dion, Androst-1,4-dien-3»17-dion und 20a-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS

3 759 791 berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektiv mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3»17-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. UERL B-3805.

Interessant ist auch ein mit "Formation of low molecular degradation products from progesterone by microorganisms" betitelter Artikel von K. Schubert» K.H.Böhme und C.Horhold in "Steroids" 4» Seiten 581 bis 586 (1964). Diese Autoren beschreiben die Bildung tricyclischer Zwischenprodukte beim Abbau von Progesteron durch Mycobacterium smegmatis.

Die Züchtung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus-Mutante Mycobacterium fortuitum DSM 775 ist in den DE-OSen 26 52 377 und 27 46 323 beschrieben. Die in den genannten DE-OSen beschriebenen Verfahrensbedingungen führen noch nicht zu einer optimalen Bildung der erfindungsgemäß gewünschten Verbindung der Formel;

(D

Bei dem neuen mikrobiologischen umwandlungsverfahren gemäß der Erfindung werden Mutanten zum Einsatz gebracht» die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Ansammlung bzw. Anhäufung von vornehmlich Verbindung der Formel (i) in der Gärbrühe auszeichnen.

Diese Mutanten erhält man nach den im folgenden näher erläuterten Mutationsmaßnahmen oder anderen Mutationsmaßnah— men aus Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter» Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium,

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Nocardia, Protaminobacter» Serratia und Streptomyces» vorzugsweise Mycobacterium. Beispiele für Arten dieser Gattungen sind M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum, M. fortuitum und M. butyricum.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird insbesondere eine neue Mikroorganismus-Mutante, nämlich Mycobacterium fortuitum DSM 775» zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen zu einer Verbindung der Formel I benutzt.

Beispiele für erfindungsgemäß selektiv abbaubare Steroide sind Sitosterine, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, und ähnliche Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen, und Androst-4-en-3»17-dion, Androsta-1,4-dien-3»17-dion, Dehydroepiandrosteron, [Testosteron und Bis-norsäure (3-Ketobisnorchol-4-en-22-oesäure). Diese Steroidsubstrate können entweder in reiner Form oder in ltohform zum Einsatz gelangen.

Neben der gewünschten Verbindung der Formel I entstehen in der Gärbrühe auch untergeordnete Mengen?

3aa-H-4ü--[ 3' -Propanol J-5a-hydroxy-7aß-methylhexahydro-1 indanon-hemiacetal der Formel

(II)

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3aa-H-4a-[ 5'-Propionsäure J-5o.-hydroxy-Yaß-methylhexaliydro-1-indanon-cT-lacton der Formel

(in)

3aa-II-4o--[3 '
indanon der Formel

und 3aa-H-4<x-[ 3' -PropionsäureJ-7aß-methylhex.ahydro-1,5-indandion der Formel

HOOC

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¥ie "bereits erwähnt» erhält man durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnete» vornehmlich die Verbindung der Formel I in der Gärbrühe anhäufende Mutanten durch Mutation von Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium» Mycobacterium, Nocardia» Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.

Für den Erfindungszweck wurde in der später beschriebenen ¥eise die Art Myeobacterium fortuitum ATCC 6842 zu einer neuen Laboratoriums-Mikroorganismus-Mutante mutiert. Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: "J.C. Cruz 2. Cold abscess. Aeta Med. Hio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 90 37C". M. fortuitum, ATCC 6842 baut Sterine nicht-selektiv zu niedrig-molekularen Verbindungen, beispielsweise COp+HpO, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.

Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 mittels Hitrosöguanidin erhält man die genannte neue Mutante, die selektiv Steroide mit oder ohne 17-Alkylseitenkatten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der Gärbrühe zu hauptsächlich einer Verbindung der Formel I abzubauen vermag.

Die neue Mikroorganismus-Mutante ist in vermehrungsfähigem Zustand am 16. November 1976 bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung M.B.H. München, Grisebachstr.8, D-3400 Göttingen, unter der Hinterlegungsbezeichnung DSM 775 hinterlegt und mit Freigabeerklärung vom 1. Dezember 1976 freigegeben worden.

Die Morphologie und die Chemikalien'- bzw. Drogenempfindlich-

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keit von M. fortuitum DSM 775 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsart M. fortuitum HOC 6842 nicht zu unterscheiden. Beide M. fortuitum-Kultüren stellen säurefeste» unbewegliche, nicht-sporenbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Mach der Eunyon¹sehen Klassifizierung (vgl. E.H. Runyon "Med. Clin. North America", 43» 273 (1959)) handelt es sich um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d.h. es wächst rasch "bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht pigmentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien.

M. fortuitum ATOC 6842 und M. fortuitum DSM 775 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. ¥ie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nichtselektiven Abbau von Steroiden» bei Einsatz von M. fortuitum DSM 775 erfolgt dagegen ein selektiver Abbau der Steroide. Diese Eigenschaft von M. fortuitum DSM 775 stellt eine in hohem Maße wertvolle Eigenschaft dar.

Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 zu M. fortuitum DSM 775 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmaßnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen lachgebiet keine lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmaßnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und TJmwandlungs- bzw. Transformationsmaßnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder äquivalente Maßnahmen · bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.

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Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum DM 775 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/l. Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maisquellflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpeptonflüssigkeiten, Heisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoff lief eranten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. ITermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt zu werden, da Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen. Vor der Sterilisation des Mediums wird dessen pH-Wert auf etwa 6,5 eingestellt. Die pH-Werteinstellung kann mittels einer starken Base, beispielsweise NaOH, KOH und dergleichen erfolgen.

Das für eine erfolgreiche Durchführung des Verfahrens gemäß

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der Erfindung zur Bildung von vornehmlich Verbindung der Formel I kritische Merkmal ist die Aufrechterhaltung eines pH-Werts von etwa 3,0 bis etwa 6, C, vorzugsweise von etwa 5,5 oder darunter. Die Aufrechterhaltung des pH-Werts läßt sich in üblicher bekannter Weise, beispielsweise mittels CaCO-z oder eines Phosphatpuffers in dem Medium oder durch pH-Wertsteuerung mittels einer Base, z.B. Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid und dergleichen, oder mit einer Säure, beispielsweise HCl, HpSO. und dergleichen, bewerkstelligen. Weiterhin läßt sich der pH-Wert auf der gewünschten Höhe halten, indem man überschüssige Mengen an solchen Nährstoffen zusetzt, bei deren Metabolismus der pH-Wert gesenkt wird. Beispiele für solche Verbindungen sind lösliche Ammoniumsalze, Kohlenhydrate, wie Glucose und andere Mono- und Disaccharide, Stärke und sonstige Polysaccharide, sowie CIe und .Fette, wie Schweineschmalz und Sojabohiienöl.

Das Umwandlungsverfahren dauert etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur während des ümwandlungsverfahrens reicht von etwa 25° bis etwa 37⁰C und beträgt vorzugsweise 31⁰C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus bewegt. Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.

Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen SiIikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschließlich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylen-

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Chlorid, Trichloräthylen, Äther, .Amylacetat, Benzol und dergleichen, vorzugsweise Methylenchlorid.

Andererseits können die Gär bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, voneinander getrennt und dann:getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder, mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gar- oder Fermentationsbrühe läßt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.

Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das FiItrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthaltende Bückst and kann dann in einem 10 $ Chloroform enthaltenden handelsübliehenHexanisomerengemisch gelöst und auf Silikagel Chromatograph!ert werden, wobei als Entwicklerlösungsmittel das handelsübliche Hexanisomerengemisch und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen an Äthylacetat verwendet werden. Hierbei läßt sich die Verbindung der Formel I eluieren. Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat erhält die Verbindung der Formel I, nämlich ein 1:1-Gemiseh der beiden Epimeren, einen Fp von 100° bis 112⁰C. Ein kristallines Produkt erhält man auch mit Hilfe eines Lösungsmittels, z.B. Äthylacetat. Weiterhin erhält man das gewünschte umgewandelte Steroid auch aus der überstehenden Flüssigkeit nach Verdampfen des darin enthaltenen Lösungsmittels.

Die Verbindung der Formel.. I eignet sich als Zwischenprodukt bei der chemischen Synthese wertvoller Steroide, So können sie beispielsweise in die bei dem aus der US-PS 3 880 884 bekannten Verfahren zur Totalsynthese wertvoller 19-Norsteroide verwendeten Ausgangssubstanzen umgewandelt

werden. Diese Umwandlung in die aaO genannten Ausgangssubstanzen läßt sich in üblicher bekannter Weise» beispielsweise durch. Oxidation mit Chromsäure in Essigsäure und anschließender Nachbehandlung mit Essigsäureanhydrid und Natriumacetat bewerkstelligen (vgl. "Biοehem." 2, 1238 bis 1243 und "J. Am. Chem. Soc." 85, 2135 bis 2137).

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben "Gewichtsprozente" . Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei lösungsmittelgemischen, sofern nichts anderes angegeben, "Volumina".

Beispiel 1

Herstellung der Mutante M. fortuitum. DSM 775 aus fortuitum ATCC 6842:

a) Nitrosoguanidin-Mutagenese:

Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 28⁰C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen:

Nährbrühe 8 g/l

Hefeextrakt 1 g/l

Natriumpropionat 0,5 g/l

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1

Der pH-Wert des Mediums wird mit 1n NaOH vor einer 20-minütigen Sterilisation bei 121⁰C auf 7,0 eingestellt.

Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5 χ 10 /ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in

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Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen O,1m~Natriumcitrat eines pH-Werts von 5»6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h.) zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schließlich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugesetzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37⁰C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1m-Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7»0 gewaschen. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:

NH₄NO₃	1,0	g/l
K₂HPO₄	0,25	g/l
MgSO₄-7H₂O	0,25	g/l
NaCl	0,005	g/l
P.eS0₄'7H₂0	0,001	g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt	auf 1 1

resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20-minütigen Sterilisieren bei 121⁰C mit 1n HCl auf 7»0 eingestellt. Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet.

b) Auswahl der Isolierung der Mutante M. fortuitum DSM 775:

Die in der geschilderten Weise mutierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Eraser und Jerrel, 1963 "J. Biol. Chem.", 205» 291 bis 295):

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Glyzerin	10,0	g/l
Na₂HPO₄	8,4	g/l
KH₂PO₄	4,5	g/l
NH₄Cl	2,0	g/l
MgSO₄-7H₂O	0,3	g/l
FeCl,-6HpO	0,05	g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf	1 1

Nach Zugabe von 15 g/l Agar wird das Medium JO min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 121⁰C erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutationsverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7-tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28⁰C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G.E. Peterson, H.L. lewis und J.ß.Davis' "Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media", J. Lipid Research 5» 275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/l Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121⁰C im Autoklaven erhitzt wird. Das sterile, heiße Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäß gegosaen, mehrere min lang durchgemischt und schließlich in sterile Petrischalen gegossen. Bei diesen Maßnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese las-

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sen sich jedoch durch Durchmischen des heißen Gemische und durch Ab flammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf .diese Weise erhält man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird»

Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden [Festplatten gewachsenen Kolonien,werden durch Ausstreichen auf Uähragarplatten gereinigt, lach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28⁰G werden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Hahragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in Sehüttelflaschen ausgewertet.

e) Schuttelflaschenauswertung:

Es werden 500 ml fassende Schuttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glyzerin .	1	auf	0,0	g/i
Ua₂HPO₄		8,4	g/i
KH₂PO₄		4,5	g/i
IH₄Gl		2,0	g/i
MgSO₄-TH₂O		0,5	g/i
JeCl '6H₂O		0,05	g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt	1 1

Hierauf werden in das Medium 1 g/l Sojamehl und dann 10 g/l Sitosterin eingemischt. Nach 20-minütigem Erhit-

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zen der !"laschen in einem Autoklaven auf 121⁰C werden sie auf 28⁰C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft:

Die vereinigten Isolate aus Stufe b) werden bei einer Temperatur von 28⁰C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit · 100 ml eines sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung:

Nährbrühe 8 g/l

Hefeextrakt 1 g/l

Glyzerin 5 g/l

mit destilliertem ¥asser aufgefüllt auf 1 1

wird eine von einem geneigten Agar entnommene Öse voll Zellen verwendet.

Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 20-minütigen Erhitzen der Flaschen auf 121⁰C in einem Autoklaven mit 1n NaOH auf 7-»0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28⁰C inkubiert.

Wie bereits erwähnt» werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500 ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30⁰C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittel syst ems, d.h. 2 Volumina A'thylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Pltissig-Chro-

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mätographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von Verbindungen der Formeln I und Y bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch die neue Mutante aus demMuttermacobacterium fortuitum ATCC 6842.

B e i s ρ i el

Umwandlung von Sitosterin in die Verbindung der Formel I

Es wird ein entsprechendes Medium wie in Beispiel 1c) verwendet» jedoch mit der Ausnahme, daß sein pH-Wert mit 4n NaOH auf etwa 6,5 eingestellt wird. Dieses Medium wird durch 30-minütiges Erhitzen auf eine Temperatur von 121⁰C sterilisiert» danach auf eine Temperatur von 28⁰C abgekühlt und schließlich mit 10 Teilen einer Saatkultur der entsprechend Beispiel 1a.) gewonnenen Mutante M. lOrtuitum DSM 775 beimpft. Das beimpfte Gemisch wird 168 h lang bei einer Temperatur von 28⁰C unter Bewegen zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Sofern erforderlich wird der pH-Wert des Mediums durch Zugabe von NaOH oder einer Säure» beispielsweise HCl, auf etwa 5,0 gehalten. Das Fortschreiten der Biotransformation läßt sich auf chromatographischem Wege durch DünnschichtChromatographie auf Silikagelplatten mittels eines Iiösungsmittelsystems auf 3:2 Volumina Cyclohexan/Äthylacetat verfolgen.

Nach beendeter biologischer Umwandlung wird das gewünschte Produkt wie folgt isoliert: Das Reaktionsgemisch wird zunächst mit Methylenchlorid extrahiert» worauf der erhaltene Extrakt durch Diatomeenerde filtriert und das Filtrat zur Trockene destilliert wird. Der hierbei erhaltene Destillationsrückstand wird in 10 # Chloroform enthaltendem Skellysolve B aufgenommen und auf Silikagel chromatographiert. Als Entwickler werden Skellysolve B und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen Äthylacetat verwendet. Bei dieser Maßnahme

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wird die gewünschte Verbindung der Formel I eluiert. Diese besitzt einen dünnschichtchromatographisch ermittelten E_f-Wert von 0,37 (Fließmittel; Cyclohexan/Äthylacetat = 3:2). Me Verbindung der Formel I besitzt einen Ep von 100° bis 112⁰C.

Beispiel

Bei Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Cholesterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel

Beispiel

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Stigmasterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel

Beispiel

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Campesterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel

Beispiel

Bei Zusatz einer Kombination aus den Steroiden der Beispiele 2 bis 5 zu Sitosterin oder bei Verwendung einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 1 bis 5 anstelle von Sitosterin erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel

Beispiel

Durch Ersatz von Mycobacterium fortuitum AICC 6842 durch

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einen sterinabbauenden Mikroorganismus der Gattungen Arthrobaeter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Hocardia, Protaminbacter, Serratia und Streptomyces erhält man Mikroorganismus-Mutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und durch Bildung von hauptsächlich Verbindung der Formel I in der Gärbrühe auszeichnen.

Beispiel 8 .*

Durch Ersatz der Mutante M. fortuitum DSM 775 der Beispiele 2 bis 6 durch die gemäß Beispiel 7 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel

Durch Ersatz des M. fortuitum ATCC 6842 in Beispiel 1 durch einen sterinabbauenden Mikroorganismus der Gattungen Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium rhodochrous, Mycobacterium Mucosum oder Mycobacterium butyricum erhält man Mikroorganismus-Mutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung von hauptsächlich Verbindung der Formel I in der Gärbrühe auszeichnen.

Beispiel 10

Durch Ersatz der Mutante Mycobacterium fortuitum DSM 775 in Beispielen 2 bis 6 durch die gemäß Beispiel 9 hergestellt e_n Mutant en erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

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Beispiel ti

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Androst-4-en-3 >17-dion, iAndrosta-1^4-dien-5,17-dion, Dehydroepiandrosteron, Testosteron oder Bis-norsäure erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel 1.

Beispiel 12

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch zwei oder mehrere Verbindungen» bestehend aus Sitosterin, Cholesterin» Stigmasterin, Androst-4-en.-J» 17-dion_t Ändrosta-1 *4-dien-3 >17-dion, Dehydroepiandrosteron» Testosteron und Bis-norsäure erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I,

Beispiel 13

Durch Ersatz der Mutante Myeobaeterium fortuitum- DSM 775 in Beispielen 11 und 12 durch die gemäß Beispiel 7 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

Beispiel 14

Durch Ersatz der Mutante Mycobacterium fortuitum DSM 775 in Beispielen 11 und 12 durch die gemäß Beispiel 9 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls die Verbindung der Formel I.

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Claims

Henkel, Kern, Feiler €r Hänzel Patentanwälte

Möhlstraße 37 D-8000 München

THE UPJOHN COMPAMY Tel, 089/982085-87

VaI amncnn Mi nh ν ς+ Δ Telex: 0529802 hnkld

Kalamazoo, Mich., V.St.A. Telegramme:ellipsoid

TUC 3357

PATENIANSPRÜCHE

,- Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

(D

dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium bei einem pH-Wert von etwa 3>0 bis etwa 6,0 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3>17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron, Testosteron oder Bisnorsäure verwendet.

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ORIGINAL INSPECTED
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, de£ man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Gampesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron, Testosteron und Bis-norsäure, verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismuszüchtung bei einem pH-Wert des Nährmediums von etwa 5»O durchführt.
6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mikroorganismus-Mutante aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebaeterium» Nocardia» Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von hauptsächlich 3aa-H-4cc-[j '-Propanol J-7aß-methylhe3rahydro-1, 5— indandion-hemiketal in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wäßrigen Nahrmedium bei einem pH-Wert von etwa 3»0 bis etwa 6,0 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante in einem wäßrigen Nahrmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.
8. Verfallren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, lndrost-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien~ 3,17-dion, Dehydroepiandrosteron, !Testosteron oder Bisnorsäure verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch, gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3»17-dion, Dehydroepiandrosteron, Testosteron oder Bis-norsäure verwendet.
10. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mycobacterium-Mutante, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoff atomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von hauptsächlich 3aa-H-4a-[3'-PropanolJ-7aß-methylhexahydro-t,5-indandion-hemiketal in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wäßrigen Nährmedium eines pH-¥er1s von etwa 3,0 bis etwa 6,0 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich TO Kohlenstoffatomen züchtet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante in einem wäßrigen Nahrmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemische aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterinj Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron, Testosteron oder Bisnorsäure verwendet.

«093.33/07*0
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepxandrosteron, Testosteron oder Bis-norsäure verwendet.
14. Verfahren zur Herstellung einer vornehmlich eine Verbindung der Formel:

(D

enthaltenden Gärbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß 'man Mycobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium bei einem pH-Wert von etwa 3>0 bis etwa 6,0 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3»17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron, Testosteron oder Bisnorsäure verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Myeobacterium fortuitum DSM 775 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemische aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.

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17. Verfahren nach. Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin» Cholesterin, Stigmasterin, Campesteriri, lndrost-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3»17-dion, Behydroepiandrosteron, Testosteron und Ms-norsäure» verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch. 14, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mkroorganismus-Mutante aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alfcylseitenkette mit 2 bis einschließlich. 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von hauptsächlich 5aa-H-4a-[3'-Propanolj-7aß-methylhexahydro-1,5-indandion-hemiketal in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wäßrigen Nährmedium bei einem pH-Wert von etwa 3,0 bis etwa 6,0 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.
20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3»17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron, Testosteron oder Bis-norsäure verwendet.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet,

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daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3>17-dion, Androsta-1,4-dien-5,17-dion, Dehydroepiandrosteron, !Testosteron oder Bis-norsäure verwendet.
22. Verfahren nach Anspruch 14> dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mycobaeterium-Mutante, die sich, durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von hauptsächlich 3aa-H-4ß-[5*—Propanol j^aß-methylhexahydro-i, 5-indandion-hemiketal in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wäßrigen Hahrmedium eines pE-Weris von etwa 3,0 bis etwa 6,0 unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden züchtet.
24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3>17-dion» Dehydroepiandrosteron, Testosteron oder Bis-norsäure verwendet.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion» Dehydroepiandrosteron, Testosteron oder Bis-norsäure verwendet.

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