DE2660011C2

DE2660011C2 - Unter Verwendung von Mikroorganismus-Mutanten durchgeführtes Verfahren zur Herstellung neuer 7 a ß - Methylhexahydro-1,(5)indan(di)on-Verbindungen

Info

Publication number: DE2660011C2
Application number: DE2660011A
Authority: DE
Inventors: John Costain Knight; Merle Gene Wovcha
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1975-11-17
Filing date: 1976-11-17
Publication date: 1980-05-14
Also published as: NL169502C; JPS5742316B2; JPS5264488A; PL106350B1; JPS56131396A; IE44876B1; GB1523970A; FR2344628B1; DE2652376A1; JPS56131382A; DE2660011B1; CH634351A5; MX5355E; JPS584552B2; IL50893A0; IE44876L; NL7612754A; DD128802A5; JPS5910792B2; IL50893A

Description

(II)

(III)

HO

(IV)

HO

dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismen-Mutanten aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, der sich durch seine Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenkette mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von

3a«-H4Ä-[3'-Propanol]-7a0-methyl-

hexahydro-l,5-indandion-Hemiketal:
3a«-H-4«-[3'-Propanal]-5«-hydroxy-

7a/?-methylhexahydro-1 -indanon-

Hemiacetal;
3a«-H-4a-[3'-Propionsäure]-5«-hydroxy-

7a/?-methylhexahydro-1 -indanon-

(5-lacton und
3a«-H-4a-[3'-Propanol]-5«-hydroxy-

7a/8-methylhexahydro-1 -indanon
in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit oder ohne 17'Aikylseilenkelte mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen züchtet.

2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst^en^.^dion, Androstan M-dienö.H'dionj Dehydroepiandrosteröri oder Testosteron verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Steroiden, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, verwendet.

IO

15

20 Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937, »Berichte« 70, 470 und »Berichte« 70, 2079. AaO wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17/?-Hydroxysteroiden mit Hilfe von Gärhefe berichtet Im Jahre 1952 (\jl US-PS 26 02 769) berichten Peterson und Murray über die lla-Hyciroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 36 84 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-AlkyIresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst-l,4-dien-3,17-dion und 20oc-HydroxymethyIpregna-l,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 37 59 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,17-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.

Die Verbindung III wird von Wang und Sih in »Biochem.« 2,1238 bis 1243 (1963) als Zwischenprodukt beim Abbau von Androst-4-en-17/?ol-3-on durch Nocardia restrictus beschrieben. Die offene Ringform der Verbindung I, nämlich 7«-Methylperhydroindandion-(l,5)-[j9-propylalkohoI-(4)], wird von Schubert und Mitarbeitern in »Steroids«, 4, 581 bis 586 (1964) als Zwischenprodukt beim Abbau von Progesteron durch Mycobacterium smegmatis beschrieben.

Mutanten, die durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet sind und in der Gärbrühe Verbindungen der folgenden Formeln:

3ii t - H -4>-[.V- Propiinol]·
1.5-inil.iiulion-Hcmikciiil:

(1Ί HO

7/.; mvilivlhexalivdm-

\.i\- H -4\ -| l - PropiiMiil] -S-hulmw
lic.xiiliydro-l-incliinon-llcmiacclal:

melhvl-

3ii\-H-4\-[3'-PropionsiiHre]-5\-hydro,xy-7ai;-methylhexahydro-Mndanon-fVlacian:

und

3a\-H-4\-[3'-Propanol]-5\-hydroxy-7a/j-methyI-hexahydro-I-indanon:

(IV)

HO

anhäufen, erhält man nach den im folgenden näher erläuterten Mutationsmaßnahmen oder anderen Mutationsmaßnahmen aus Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacteiium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, vorzugsweise Mycobacterium. Beispiele für Arten dieser Gattungen sind M. phlei, M. imegmatis, M. rhoouchrous, M. mucosum, M. fortuitum und M. butyricum.

Beispiele für zum Abbau gseignete Steroide sind Sitosterine, Cholesterin, Stigmasterin, ·"ampesterin und dergleichen mit 17-AlkyIseitenketten mit 2 bis einichließlich 10 Kohlenstoffatomen und Androst-4-en-3,17-dion, Androsta l,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron. Diese Steroidsubstrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.

Für den Erfindungszweck wurde als ein von vielen möglichen Beispielen in der später beschriebenen Weise die Art Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 zu einer neuen Laboratoriumsmikroorganismusmutante mutiert Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: »J. C. Cruz 2. Cold tbscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1 :1 (1936). Medium 90 37C«. M. forluitum ATCC 6842 baut Sterine nicht jelektiv zu niedrigmolekularen Verbindungen, beispielsweise CO? + HjO, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.

Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 mittels Nitrosoguanidin erhält man eine neue Mutante, die leiektiv Steroide mit oder ohne 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der Gärbrühe zu hauptsächlich Verbindungen der Formeln I bis IV abzubauen vermag.

Die neue Mikroorganismus-Mutante wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforsehung mbH München, Grisebachstraße 8, D'34ÖO Göttingen unter der Hinterlegungsnümmer DSM 774 hinterlegt.

Die Morphologie und die Chemikalien· bzw, Drogen·· empfindlichkeit von M, fortuitum DSM 774 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsart M, fortuitum ÄTCC 6842 nicht zu unterscheiden. Beide M. fortuitunvKulturen stellen säurefeste, unbewegliche, nichtsporenbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyon's Klassifizierung (vgl. E. H. Runyon »Med. Clin. North America«, 43, 273 [1959]) handelt es sich um ein nichtchromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d.h. es wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nichtpigmentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien.

M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum DSM 774 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nichtselektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum DSM 774 ertnlgt dagegen ein selektiver Steroidabbau. Diese Eigenschaft von M. fortuitum DSM 774 stellt eine in hohem Maße wertvolle Eigenschaft dar.

Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 zu M. fortuitum DSM 774 erfolgte mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmaßnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmaßnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und Umwandlungs- bzw. Transformationsmaßnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium

in beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder äquivalente Maßnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden. Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum DSM

j) 774 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit

•in einem anderen Steroid zugesetzt weräen. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche, Kor.zentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/l. Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, bei-

4) spielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glucose, brau-

■>n ncr Zucker, Rohrzucker, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autoiysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe,

ü Pankreas-Verdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz

wi gelangen. Den Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt Werden, da Vor der Sterilisation des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als

ij ■> Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.

Das Umwandlungsverfahren dauert etwa 72 h bis 15 Tage. Die !nkübationstetnperatur während des Umwandlungsverfahrens reicht von etwa 25° bis etwa 37° C

und beträgt vorzugsweise 30⁰C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus bewegt Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.

Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschließlich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischei. Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat Benzol und dergleichen, vorzugsweise Methylenchlorid.

Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- oder Fermantationsbrühe läßt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.

Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockne destilliert wird.

Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthaltende Destillationsrückstand kann in einem 10% Chloroform enthaltenden handelsüblichen Hexanisomerengemisch gelöst und auf Silikagel Chromatographien werden, wobei als Entwickler das handelsübliche Hexanisomerengemisch einerseits und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen Äthylacetats verwendet werden. Bei diesen Maßnahmen lassen sich die Verbindungen I, II und III eluieren. Die Verbindung IV läßt sich beispielsweise mit 5% Methanol enthaltendem Äthylacetat eluieren. Kristalline Produkte erhält man mit Hilfe eines Lösungsmittels, beispielsweise Äthylacetat. Die gewünschten umgewandelten Steroide erhält man auch aus der überstehenden Flüssigkeit nach dem Verdampfen des in der übersteherden Flüssigkeit enthaltenen Lösungsmittels.

Die Verbindungen der Formeln I, II. III und IV eignen sich als Zwischenprodukte bei der chemischen Synthese wertvoller Steroide. So lassen sich beispielsweise die • erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen in bei dem aus der US-PS 38 80 884 bekannten Verfahren zur Totalsynthese wertvoller 19-Norsteroide verwendeten Ausgangssubstanzen überführen. Diese Umwandlung zu den genannten Ausgangssubstanzen läßt sich in üblicher bekannter Weise durchführen, beispielsweise durch Oxidation mit Chromsäure in Essigsäure und anschließender Nachbehandlung mit Essigsäureanhydrid und Natriumacetat (vgl. »Biochem.« 2, 1238 bis 1243 und »J.A.C.S.« 85,2135 bis2137).

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche Prözerttangaben »Gewichtsprozente«.

Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nichts anderes angegeben. »Volumina«.

Beispiel 1

Herstellung der Mutanten M. fortuitum NRRL B-812S ( = DSM 774) aus M. fortuitum ATCC 6842:

a) Nitrosoguanidin-Mutagenese

Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 wurden bei einer Temperatur von 28° C in einem sterilen Saatmedium dor folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen:

Nährbrühe 8 g/l

Hefeextrakt 1 g'I

Natriumpropionat 0,5 g/I
mit destilliertem Wasser

aufgefüllt auf 1 1

Der pH-Wert des Mediums wurde mit 1 n-NaOH vor einer 20minütigen Sterilisation bei 121° C auf 7,0 eingestellt

Die Zellen wurden bis zu einer Dichte von etwa 5xlO^s/ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügeluhen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1 m-Natriuii,:itrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschene,! Zellen wurden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert worauf

j-, ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d. h. zur Zellenzählung) abgetrennt wurde. Schließlich wurde Nivosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugesetzt Die Zellensuspension wurde in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von

jo 37° C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wurae. Der Rest wurde abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1 m-Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schließlich wurden die Zellen in einem sterilen

υ Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:

NH₄NO,	1,0 g/l
K₂HPO₄	0,25 g/I
MgSO₄-7 H₂O	0 25 g/I
NaCl	0,005 g/I
FeSO₄? H₂O	0,001 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	1 1

•ι j resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wurde vor einem 20minütigem Sterilisieren bei 121°C mit 1 n-HCl auf 7,0 eingestellt. Endlich wurden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet

-_n b) Auswahl und Isolierung der Mutanten

M. fortuitum NRRL B-8128

Die in der geschilderten Weise mutagenisierten

Zellen wurden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthiel-

jj '«η (modifiziert nach Fräser und Jerrel, 1963 »J. Biol.

Chem.«, 205,29 Ibis 295):

Glyzerin 10,0 g/I

Na₂HPO₄ 8,4 g/l

KH₂PO₄ 4,5 g/l

"° NH₄Cl 2,0 g/I

MgSO₄-7 H₂O 0,3 g/l

FeCl₃-6H₂O 0,05 g/l
mit destilliertem Wasser

aufgefüllt auf 1 I

Nach Zugabe von 15 g/l Agar wurde das Medium 30 min lang in einem Autoklav auf eine Temperatur von 121⁰C erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen.

Das Wachse« bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminierte die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So wutderi beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tägiger Inkubation bei einer Temperatur Von 28°C wurden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glycerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten wurden entsprechend der Veröffentlichung von G. E. Peterson, H. L Lewis und J. R. Davis »Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media«, J. Lipid Research 3, 275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter (a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/l Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstofflieferanten wurden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121 "C im Autoklav erhitzt wurde. Das sterile, heiße Gemisch wurde hierauf in ein steriles Mischgefäß gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schließlich in sterile Pelrischalen gegossen. Bei diesen Maßnahmen konnte es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese ließen sich jedoch durch Durchmischen des heißen Gemischs und durch Abflarnmen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhielt man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wurde.

Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien, wurden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28⁰C wurden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Fhenotypus aulwiesen, wurden dann in Schüttelflaschen ausgewertet

45

c) Schüttelflaschenauswertung

Es wurden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glycerin	10,0 g/l
Na₂HPO₄	8,4 g/l
KH2PO4	4,5 g/l
NH₄Cl	2,0 g/l
MgSO₄-7 H₂O	03 g/l
FeCl₃-6 H₂O	0,05 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	11

Hierauf wurden in das Medium 1 g/l Sojamehl und dann 10 g/l Sitosterin eingemischt Nach 20minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklav auf 121°C wurden sie auf 28" C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft:

Die gereinigten Isolate aus Stufe (b) wurden bei einer

Temperatur von 28° C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung:

Nährbrühe	8 g/l
Hefeextrakt	lg/l
Glyzerin	5 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	1 1

wurde eine von einem geneigten Agar entnommene öse voll Zellen verwendet.

Der pH-Wert des Saatmediums wurde vor dem 20minütigen Erhitzen der Flaschen auf 12PC in einem Autoklav mit 1 n-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen wurden 72 h lang bei einer Temperatur von 28° C inkubiert.

Wie bereits erwähnt, wurden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500 ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf wurden die Flaschen bei einer Temperatur von 28 bis 30⁰C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen wurden. Diese Proben umfaßten jeweils 10 ml und wurden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina MethylenchloriH extrahiert. Teile der Extrakte wurden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d. h. 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Flüssig-Chromatographie analysiert Ein Nachweis der Anwesenheit der Verbindungen der Formeln I, II, III und IV bestätigte den selektiven Abbau von Sitosterin durch die neuen Mutanten aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842.

Beispiel 2

Umwandlung von Sitosterin in die Verbindungen der Formeln 1, ii, iii und iV:

Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel 1 (c). Dieses Medium wird durch 30minütiges Erhitzen auf 121°C sterilisiert, dann auf 30°C abgekühlt und schließlich mit 10 Teilen einer Saatkultur des Mutanten-Mycobacterium M. fortuitum NRRL B-8128, die entsprechend Beispiel 1 (c) hergestellt worden war, beimpft Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h lang bei einer Temperatur von 30° C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert Der Extrakt wird durch Diatomeenerde filtriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockne destilliert wird. Der hierbei angefallene Destillationsrückstand wird mit einem handelsüblichen, 10% Chloroform enthaltenden Hexanisomerengemisch aufgenommen und auf Silikagel Chromatographien, wobei als Entwickler das handelsübliche Hexanisomerengemisch und Mischungen desselben mit zunehmenden Mengen an Äthylacetat verwendet werden. Hierbei lassen sich die Verbindungen I, II und ΠΙ eluieren. Die Verbindung IV läßt sich aus der Säule mit 5% Methanol enthaltendem Äthylacetat eluieren. Die Reihenfolge des Eluirens der betreffenden Verbindungen ist

IV.

030 220/253

26 60 Oil

IO

Die Rf-Werte dieser Verbindungen auf einem Dünnschichtchromatogramm unter Verwendung eines 3 :2-Cyclohexan/Äthylacetat-Gemischssind:

I = 0,37

II = 0,28

III = 0,16

IV = 0,05

Auf dGilnschichtchromatographischem Wege ermil· telte geeignete Fraktionen werden gesammelt Und zur Trockne eingedampft, wobei die Verbindungen I₁II, III und IV in guter Ausbeute erhalten werden.

Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat erhält man

die Verbindung I in Form eines 1 :1-Epimerengemischs eines Fp, von 100 bis 112"C;

die Verbindung II stellt ein öl dar;

die Verbindung III besitzt einen Fp. von 122 bis 124°C und

die Vsrbindun" !Y besitzt einen Fⁿ. von !48 bi^ 15O⁰C.

Beispiel 3

Beim Ersatz des im Beispiel 2 verwendeten Sitosterins durch Cholesterin erhält man ebenfalls die Verbindungen I, II, III und IV.

Beispiel 4

Beim Ersatz des im Beispie! 2 Verwendeten Sitosterins durch Stigmasterin erhält man ebenfalls die Verbindungen I₁II, III und IV.

Beispiel 5

Beim Ersatz des im Beispiel 2 verwendeten Sitosterins durch Campesterin erhält man ebenfalls die Verbindungen I₁II, III und IV.

Beispiel 6

Durch Zusatz einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 5 zu dem Sitosterin in Beispiel 2 oder durch Verwendung einer beliebigen Kombination der Steroide der Beispiele 2 bis 5 anstelle des Sitosterins in 2s;sp:c! 2 erhält ττ.ζχ ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 7

Bei Ersatz von Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 in Beispiel 1 durch einen Mikroorganismus der Gattung Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces erhält man Mikroorganismenmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne 17-AIkylseitenketten mit 2 bis

einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung von Verbindungen der Formeln I, II, MI und IV in der Gärbrühe auszeichnen^

Beispiel 8

Durch Ersatz der Mutanten M. fortüitürri NRRL B-8128 in den Beispielen 2 bis 6 durch die gemäß Beispiel 7 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV,

Beispiel 9

Durch Ersatz des M. fortuitum ATCC 6842 in Beispiel 1 durch einen sterinabbauenden Mikroorganismus der Gruppe Mycobacterium phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mueosum und M. butyricum erhält man Mikroorganismenmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit oder ohne i7-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Anhäufung von

zu Verbindungen der Formein I, ii, in und IV in der Gärbrühe auszeichnen.

Beispiel 10

Durch Ersatz der Mutanten M. fortuitum NRRL B-8128 in den Beispielen 2 bis 6 durch die gemäß Beispiel 9 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 11

ίο Durch Ersatz des Sitosterins im Beispiel 2 durch Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-l,4-dien-3,17-dion, Dehydroepiandrosteron oder Testosteron erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 12

Durch Ersatz des Sitosterins im Beispiel 2 durch eine Kombination aus zwei oder mehreren Sterinen, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin, Androst-4-en-3,l 7-dion, Androsta-1,4-dien-3,l 7-dion, Dehydroepiandrosteron und Testosteron, erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 13

Durch Ersatz der Mutanten M. fortuitum NRRL ·<■' B-8128 in den Beispielen 11 und 12 durch die gemäß Beispiel 7 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV.

Beispiel 14

><> Durch Ersatz der Mutanten M. fortuitum NRRL B-8128 in den Beispielen 11 und 12 durch die gemäß Beispiel 9 hergestellten Mutanten erhält man ebenfalls die Verbindungen der Formeln I, H, III und IV.

SSSJSScfciSSSSSÖiäSrc^^

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln:

HO

O J

(I)