JPS5910792B2 - 新規な微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 微生物によるステロイド類の転化は広く研究され、記録
され℃いる。

明らかに、最初のこのような研究は、１９３７年のマモ
リ（ Ｍａｍｏｌｉ ）とヴエルセローネ（ Ｖｅｒｃ
ｅｌｌｏｎｅ ）、Ｂｅｒ．７０巻４７０頁及びＢｅ
ｒ．７０巻２０７９頁によるものである。

彼らは酵母発酵による１７一ケトステロイド類からｌ７
β−ヒドロキシステロイド類への還元を明らかにした。

より最近では、ビーターソン（ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ）
及びマレー（ Ｍｕｒｒａｙ ）が、カビのリゾプス・
ニグリカンス（ Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉｇｒｉｃａｎｓ
）によるグロゲステロンのｌ１α−ヒドロキシル化を
明らかにした。

合衆国特許第２６０２７６９号（ １ ９５２年）を参
照。

また最近では、クレーキー（ Ｋｒａｙｃｈｙ）らが合
衆国特許第３６８４６５７号（１９７２年）で、アンド
口スト−４−エンー３，１７−ジオン、アンドロス｝−
１．４−ジエンー３，ｌ７−ジオン、及び２０α−ヒド
ロキシメチループレグｔ−１．４−ジエンー３−オンを
製造するため１７−アルキル側鎖中に少なくとも８個の
炭素を含有するステロイド類をミコバクテリウム・スペ
シーズ （ Ｍｙｃｏｂａｃｌｅｒｉｕｍ ｓｐ， ） ＮＲ
ＲＬ Ｂ − ３ ６ ８ ３によって発酵させること
による、ステロイドの１７−アルキル側鎖の選択的な微
生物的減成分解を明らかにし℃いる。

もつと最近では、マーシエツク（ Ｍａｒｓｈｅｃｋ
）らが合衆国特許第３７５９７９１号（１９７３年）で
、１７−アルキル側鎖中に少な《とも８個の炭素を含有
するコレスタン又はスチグマスタン系のステロイドをミ
コバクテリウム・スペシーズＮＲＲＬＢ−３８０５によ
って発酵させることによる、アンドロストー４−エンー
３，１７−ジオンの選択的な微生物学的製造を明らかに
している。

本発明の化合物■は、１９６３年（ Ｂｉｏｃｈｅｍ，
２巻ＩＺ３８−１２４３頁）にワン（Ｗａｎｇ）及びシ
ー（Ｓｉｈ）が、ノカルディア・レストリクッス（ Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ）によるアンド
ロストー４−エンー１７β−オール−３−オンの減成分
解における一中間体として開示され℃いる。

化合物■の開環型である７α−メチルーパーヒドロイン
ダンジオン−（１．５）−１：β−プロビルアルコール
ー（４），ｌは、ミコバクテリウム・スメグマチ，；Ｚ
． （ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔ
ｉｓ ）によるグロゲステロンの減成分解における中間
体として、１９６４年（「ステロイド類」４巻５８１〜
５８６頁）シューベルト（ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ）らに
よって開示された。

突然変異株は、２〜１０個の炭素原子の１７−アルキル
側鎖を伴った、又は伴わないステロイド類を選択的に減
成分解させ、発酵液中に次の化合物類を蓄積する能力に
よって特徴づけられる。

３ａα一Ｈ−４０−〔３′一プロパノール〕−７ａβ−
メチルへキサヒドロー１，５−インダンジオンへミケタ
ール （以下化合物■と称する）、 ３ａα−Ｈ−４０一〔３′−プロバナール〕−５０−ヒ
ドロキシ−７ａβ−メチルへキサヒド口−１−インダノ
ンへミアセタール （以下化合物■と称する）、 ３ ａ ＣＸ − Ｈ − ４ ＣＸ − ［ ３’−
プロピオ７ｒｌ！３−５０−ヒドロキシ−７ａβ−メチ
ルへキサヒドロ−１−インダノンーδ−ラクトン （以下化合物■と称する）、及び ３ａα−Ｈ−４０一〔３′−グロパノール〕−５０−ヒ
ドロキシ−７ａβ−メチルへキサヒトロ−１−インダノ
ン （以下化合物■と称する） これらの突然変異株は、本明細書に明らかにされている
突然変異化手順又はその他の突然変異化手順を使用して
、次の属のステロールを減成分解させる微生物から得る
ことができる。

アースロバクター（ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バ
チルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）、プレヴイバクテリウ
ム（ Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）、コリネバク
テリウ，ＩＡ （ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）、ミコバクテリウ，ＩＡ （ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ）、ノカルディア（ Ｎｏｃａｒｄｉａ
）、グロトアミノバクター（ Ｐｒｏｔｏａｍｉｎｏｂ
ａｃｔｅｒ ）、セラテイア（ Ｓｅｒｒａｔｉａ）及
びストレプトミセス（ Ｓｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）
。

好ましい属はミコバクテリウムである。

この属の例示的ナ種ハエム・フレイ（ Ｍ ．ｐｈｌｅ
ｉ ） 、エム・スメグマテス（ Ｍ ， ｓｍｅｇｍ
ａｔｉｓ ）、エム・ロードクロウス（ Ｍ ， ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ）、エム・ムコスム（ Ｍ．ｍ
ｕｃｏｓｕｍ）、エム・フオルトウイトウム（ Ｍ ，
ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ ）及びエム・ブチリクム（ Ｍ
１ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ）である。

本明細書に特定的に例示されているのは、新規な突然変
異株の微生物ミコバクテリウム・フオルトウイトウム（
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ
）、−ＮＲＲＬ Ｂ−８１２８である。

これは２〜１０個の炭素原子を含有する１７−アルキル
側鎖を伴った、又は伴わないステロイド類を選択的に減
成分解させて化合物■、■、■及び■を得るのに用いら
れる。

適当なステロイド類の例は、シトステロール、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロール、等の
、２〜１０個の炭素原子の１７−アルキル側鎖をもった
ステロイド類、それにアンドロストー４−エンー３，１
７−ジオン、アンドロスター１，４−ジエンー３，１７
−ジオン、デヒドロエビアンドロステロン、及びテスト
ステロンである。

これらのステロイド基質は精製型又は粗製型でありうる
。

微生物 上記のようにステロイド類を選択的に減成分解させ、発
酵液中に化合物■、■、■及び■を蓄積する能力によっ
て特徴づけられる突然変異株をζ次の属すなわちアース
ロバクター、バチルス、プレヴイバクテリウム、コリネ
バクテリウム、ミコバクテリウム、ノカルディア、グロ
トアミノバクター、セラチア、及びストレプトミセスの
、ステロールを減成分解させる微生物を突然変異させる
ことによって得られる。

本明細書に記載のとおりにミコバクテリウム・フオルト
ウイトウムＡＴＣＣ６８４２を突然変異させると、新規
な実験室的突然変異株の微生物を生ずる。

１９７４年度ＡＴＣＣカタログは、ＡＴＣＣ６８４２０
名簿と共に以下を明らかにしている。

ジエイ・シー・クルス（ Ｊ．Ｃ，Ｃｒｕｚ ）２、Ｃ
ｏｌｄ ａｂｓｃｅｓｓ．ＡｃｔａＭｅｄ， Ｒｉｏ
ｄｅ Ｊａｎｅｉｒｏ １巻１頁（１９３６年）。

Ｍｅｄｉｕｍ ９ ０ ３ ７ ＣＯＭ ，フオルトウ
イトウムＡＴＣＣ６８４２はステロール類を小分子量の
化合物類、例えばＣＯ２＋Ｈ２０へ非選択的に減成分解
させる。

このためこの微生物は選択的なステロイド減成生物とし
℃適当ではない。

二トロソグアニジンを使用するＭ．フオルトウィトウム
ＡＴＣＣ ６ ８ ４ ２の突然変異化は、本明細書に
定義されたとおりに、ステロイド類を選択的に減成分解
させて化合物類■、■、■及び■をつ《るよ５な新規な
突然変異株の産生をもたらした。

これが永久保存株中に寄託されている合衆国イリノイ州
ピオリアの合衆国農務省北部地域研究所により、Ｍ．フ
オルトウィトウムのこの突然変異株の微生物はＮＲＲＬ
Ｂ−８ １ ２ ８という受入れ番号を与えられた。

この微生物の二次培養基は、ここへ要求すればこの寄託
所から自由に入手できる。

父上記突然変異株は、日本におい又は昭和５１年１１月
１２日に工業技術院微生物工業技術研究所に保管委託申
請した。

微生物受託番号は第３８０４号である。

二次培養基が入手できるからといって、政府命令によっ
て証書と共に授与される特許権を侵害して本発明を実施
するという実施権を構成するものではないことを理解す
べきである。

Ｍ．フオルトウィトウムＮＲＲ’Ｌ Ｂ − ８ １
２ ８の形態及び薬剤感受性は親のＭ．フオルトウイト
ウムＡＴＣＣ ６ ８ ４ ２のそれと区別できない。

双方のＭ．フオルトウイトウムの培養基はアクチノマイ
セタレス（ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ ）目
のミコバクテリアセア（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃ
ｅａｅ ）科に属する耐酸性で非自動型の、胞子を形成
しない杆菌である。

ラニョンの分類（ラニョン・イー・エイチ（ Ｒｕｎｙ
ｏｎ ， Ｅ， Ｈ， ）、１９５９年Ｍｅｄ ， Ｃ
Ｉｉｎ，Ｎｏｒｔｈ Ａｒｎｅｒｉｃａ ４ ３巻２７
３頁）によると、これは非色素群■のミコバクテリウム
である。

すなわち低温で急速に生育して、比較的簡単な培地上で
色素をもたない集落をつくる。

ステロイド分子に対する作用においては、Ｍ．フオルト
ウイトウムＡＴＣＣ６ ８４２とＭ．フオルトウイトウ
ムＮＲＲＬ Ｂ−８ １ ２ ８は明瞭に区別できる。

上に明らかにされたように、Ｍ．フオルトウイトウムＡ
ＴＣＣ６８４２はステロイド類の非選択的な減成分解生
物であるのに反し、Ｍ．フォルトウイトウムＮＲＲＬ
Ｂ−８１２ ８は選択的な減成分解生物である。

Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ Ｂ−８ １ ２ ８
のこの性状によって、これは本明細書で明らかにされた
ように非常に有用なものとなっている。

Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ Ｂ−８ １ ２ ８
をつくるためのＭ．フオルトウイトウムＡＴＣＣ６８４
２の突然変異化は、ニトロソグアニシンを用い℃達成さ
れる。

手順の詳細はあとに記載され℃いる。

突然変異の手順は概し又この技術に知られているが、こ
の突然変異の手順を用いて得られる突然変異株の種類を
教示したり、或は示唆したりさえするような既知の技術
はまだない。

また本明細書に明らかにされた突然変異化及び転化手順
はミコバクテリウムに対し℃詳細に記載されているが、
同様な又は同等の手順を本明細書に明らかにされている
ようにその他の属の微生物に対して使用できることを理
解すべきである。

転化方法 本発明の選択的転化は、培養期間中に選ばれたステロイ
ド基質を培養基へ加えるか、又は接種に先立って栄養培
地へこれを混入させることによって、Ｍ．フオルトウイ
トウムＮＲＲＬ Ｂ−８１２８の生育している培養基中
で実施できる。

ステロイドを単独で、又は他のステロイドと組合わせ℃
添加できる。

限定はしないが培養基中のステロイドの好ましい濃度範
囲は、リットル当り約０．１ないし約１０１である。

炭素源、例えば同化できる炭水化物、及び窒素源、例え
ば同化できる窒素化合物又は蛋白質材料を含有する栄養
培地中で培養基を生育させる。

好ましい炭素源は萄葡糖、黒砂糖、蔗糖、グリセロール
、殿粉、コーンスターチ、乳糖、デキストリン、糖蜜等
である。

好ましい窒素源はコーンスチープリカー、酵母、固形乳
を加え自己消化されたビール酵母、大豆粉、棉実粉、コ
ーンミール、固形乳、カゼインのすい液消化物、魚粉、
デイスチラーズソリッド、動物ペプトン液、肉と骨の砕
片、アンモニウム塩等を包含する。

これらの炭素源と窒素源の組合わせを有利に使用できる
。

痕跡の金属類、例えば亜鉛、マグネシウム、マンガン、
コバルト、鉄等は発酵培地に加える必要がない。

というのは、培地の滅菌前に培地の成分として水道水及
び未精製の成分を使用するからである。

転化方法は約７２時間から１５日までの範囲である。

転化過程中の培養温度は約２５℃ないし約３７℃の範囲
であり、３０゜Ｃが好ましい。

転化容器の内容物に滅菌された空気を通してかきまぜ、
微生物の生育を容易ならしめかくして転化過程の有効度
を強める。

シリカゲル板（Ｅ，メルク社、ダルムシュタット）及び
２：３（容量比）の酢酸エチルーシクロヘキサンからな
る溶媒系を使用する薄層クロマトグラフイによって証拠
立てられるように、転化方法の終了後、望んでいる転化
されたステロイド類はこの技術によく知られた手段によ
つ又回収される。

例えば発酵液と菌体とを含んだ発酵（転化）反応混合物
をステロイド用の水と混ざらない有機溶媒で抽出できる
。

適当な溶媒は塩化メチレン（好適）、クロロホルム、四
塩化炭素、塩化エチレン ｝ ＩＪクロロエチレン、エ
ーテル、酢酸アミル、ベンゼン等である。

その代わりに、発酵液と菌体なまず慣用方法、例えばろ
過又は遠心分離によつ℃分離し、次に適当な溶媒で別々
に抽出する。

菌体な水と混ざる、又は水と混ざらない溶媒で抽出でき
る。

菌体な含んでいない発酵液を水と混ざらない溶媒で抽出
できる。

抽出液を硅藻土に通してろ過し、ろ液を乾固するまで真
空蒸留できる。

望んでいる転化ステロイドを含有する残留物をスケリン
ルブＢ中のｌθ％クロロホルム中に溶解し、スケリソル
ブＢ（異性体ヘキサン）及びそれと増加量の酢酸エチル
との混合物を展開溶媒として使用し℃、シリカゲル上の
クロマトグラフイにかける。

この手順により、化合物工、■、及び■が溶離される。

化合物■は例えば酢酸エチル中の５％メタノールで溶離
できる。

結晶生成物は溶媒、例えば酢酸エチルを用い℃得られる
。

望んでいる転化ステロイドも、残りの上澄液から、上澄
液中の溶媒蒸発によつ℃得られる。

化合物工、■、■及び■は有用なステロイト゛類の化学
合成における中間体として有用である。

例えば、本化合物類は、有用な１９−ノルステロイド類
の全合成法を明らかにした合衆国特許第３８８０８８４
号の方法に対する出発材料へ転化できる。

出発材料へのこの転化は、この技術に知られた手順、例
えば酢酸中でクロム酸によって酸化させ、続いて無水酢
酸と酢酸ナトリウム処理によって行なわれる。

Ｂ ｉ ｏｃｈｅｍ ２巻１２３８〜１２４３頁及び
Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ，８５巻２１３５〜２１３７頁を参九 以下の実施例は本発明の方法と生成物の例示であるが、
限定的に考えられ又はならない。

他に注意がなげれば百分率はすべ℃重量によるものであ
り、またあらゆる溶媒混合物の割合は容量による。

実施例 Ｉ Ｍ．フオルトウイトウムＡＴＣＣ６８４２から突然変異
株Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ Ｂ−８１２８の調
製 ａ）二トロングアニジンによる突然変異種の生成Ｍ。

フオルトウイトウムＡＴＣＣ６８４２の菌体を２８℃で
次の無菌的な種菌培地中で生育させる。

栄養培養液（ディフコ） ８ ？／１１酵母エキス
１ ？／１プロビオン酸ナトリウム
０．５ｆ／Ａ蒸 留 水 １ｌとするに十
分な量ＩＮ ＮａＯＨでｐｎを７．０に調整Ｌ，”！
−ら、１２１℃で２０分滅菌する。

菌体な約５Ｘ１０８／一の密度まで生育させ、遠心分離
によつ℃ペレット化し、次いで同量の無菌的な０，ＩＭ
＜えん酸ナトリウム（ｐＨ５．６）で洗う。

洗った菌体を同量のくえん酸緩衡液に再懸濁し、滴定（
菌の計数）のため試料を除き、二トロングアニジンを５
０μｖ／７！の最終濃度まで加える。

菌の懸濁液を３７゜Ｃの水浴中で３０分温だめ、次いで
一試料を滴定のため除去し、残りを遠心分離し、同量の
無菌的な０． １ Ｍ燐酸カリウム（ｐＨ７．０）で洗
う。

最後に以下からなる炭素源をもだない無菌的な最少の塩
媒質中に菌体を再懸濁させる。

ＮＨ４Ｎｏ３ １．０ ｔ／ＩＫ２Ｈ
ＰＯ４０．２ ５ ｆ／ｌ！ ＭｇＳＯ，−７Ｈ２０ ０．２５ ｔ／ＩＮａＣ
Ｉ ０．Ｏ０５ｆ／ｌＦｅＳ０４・７
Ｈ２０ ０．００１ｖ／ｌ蒸 留 水 １ｌと
するのに十分な量ＩＮＨＣＩでｐＨを７．０に調整して
から、１２１℃で２０分滅菌する。

次に突然変異株を選び出すために菌体なプレート上へ広
げる。

ｂ）突然変異株Ｍ．フオルトウィトウムＮＲＲＬＢ−８
１２８の選択と単離 上記のとおりに突然変異化された菌体を希釈し、次のも
のからなる培地（フレーザー（ Ｆｒａｓｅｒ ）及び
ジエＬ／／Ｌ／（ Ｊｅｒｒｅｌ ）、１９６３年、
Ｊ．Ｂｉｏｌ， Ｃｈｅｍ．２ ０ ５巻２９１〜２９
５頁から変更したもの）を含有するプレート上へ広げる
。

グリセロール １０．０ ｔ／ＩＮａ Ｈ
ＰＯ４８．４ ｔ／１ ２ ＫＨ２Ｐ０， ４．５ ｔ／ＩＮＨ
４Ｃｌ ２．０ ｆ／１３ＭｇＳＯ
，− ７Ｈ２０ ０．３ ｆｉｔ／１１Ｆｅ
Ｃ ｌ，− ６Ｈ２０ ０．０ ５ ｆ／ｌ蒸
留 水 １ｌとするに十分な量寒天（１５ｖ
／ｌ）を加え、培地を１２１℃で３０分間オートクレー
プ処理し、次いで無菌のべトリ皿に注ぐ。

この培地上の生育は、突然変異種生成手順によつ又つく
られるほとんどの栄養作用物質を排除し℃いる。

例えば化学的に定義された培地上での生育のためにビタ
ミン類、生長要素等を必要とする培養基は排除される。

２８℃で約７日間培養後、生ずる集落を突然変異の選定
に適した試験プレート上へ複製し、次いでグリセロール
基盤の培地を含有する対照プレート上へ戻す。

試験プレートはビーターンン・ジー・イー（ Ｐｅｔｅ
ｒｓｏｎ， Ｇ， Ｅ． ）、エイチ・エル・ルイス（
Ｈ， Ｌ， Ｌｅｗｉｓ ）及びジエイ・アール−デ
ービス（ Ｊ．Ｒ，Ｄａｖｉｓ ） １９６２年「寒天
培地中におけるコレステロールその他の水に溶けない炭
素源の均一分散物の調製」（ Ｊ ． Ｌｉｐｉｄ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ３巻２７５〜２７６頁）に記載のとお
りにつくられる。

これらのプレート中の最少塩培地は、実施例１の（ａｍ
Ｋ−記載されたとおりである。

寒天（ １ ５ ’ｉｆ／ｌ ）と、シトステロール又
はアンド口ステンジオン（ Ａ’Ｄ ）のような適当な
炭素源（ ｌ．ｏ ｙ／１３ ）を加え、生ずる懸濁液
な１２１℃で３０分オートクレープ処理する。

次に滅菌された熱い混合物を無菌の配合容器に注ぎ、数
分間配合し、次いで無菌のペトリ皿へ注ぐ。

この手順で発泡が問題となりがちであるが、混合物が熱
いうちに配合することと、溶融寒天のプレート表面に炎
を当てることによって減少できる。

この方法で水に溶けない炭素源の均質分散が得られる。

これは非常に均質であるが不透明な寒天プレートの調製
を容易ならしめる。

対照プレート上で生育するが、唯一の炭素源としてＡＤ
を含有する試験プレート上では生育しない集落をζ栄養
寒天プレート上の画線分離によつ又精製される。

２８℃で生育後、個々の集落を滅菌したつまようじで栄
養寒天グレートから取上げ、炭素源としてＡＤを含有す
るプレートヘ穿刺によって接種し℃再試験をする。

親培養基とは異なる表現型を示す精製された単離物は、
振と５フラスコで評価される。

Ｃ）振と５フラスコ評価法 振と５フラスコ（ ５ ０ ０ｙｄ）は以下の成分から
なる生物転化培地１００ｒｒｌｌ．を含有する。

グリセロール １０．Ｏ ｆＩ／ＩＮａ Ｈ
ＰＯ４８．４ ？／ｌ ２ ＫＩ｛２ＰＯ４４．５ ｔ／１１ ＮＨ４Ｃ ｌ ２．Ｏ ｆ／／ＩＭｇ
Ｓ０４．７ＨＯ Ｏ．３ ｔ／１２ ＦｅＣ ｌ３− ６Ｈ２０ ０．０ ５ ｆ／
ｉｔ蒸 留 水 １ｌとするに十分な量大豆粉
（ １ ？／ｌ ）を培地へ配合し、次にシトステロー
ル（ １ ０ ｒ／ｌ）を培地に配合する。

フラスコを１２１’Ｃで２０分オートクレープ処理して
から、２８℃に冷却し、次いで以下のようにして調製さ
れた種菌生育物１０−を接種する。

ｂ瑯からの精製された単離菌を２８℃で寒天斜面培地に
生育させる。

斜面培地からの一すくいの菌体を取って、次の成分から
なる滅菌した種菌培地１００−を含有する５００−フラ
スコに接種するために使用する。

栄養培養液（ディフコ） ８”ｉ／１酵母エキス
１ｔ／１１グリセロール
５ ？／１３ 蒸 貿 水 １ｌとするに十分な量ＩＮ Ｎ
ａＯＨでｐＨを７．０に調整してから、フラスコを１２
１℃で２０分オートクレープ処理する。

種菌フラスコを２８℃で７２時間培養する。上に明らか
にされたように、種菌生育物１０ｍを使用して、滅菌し
た転化培地１００−を含有する各々の５００−フラスコ
を接種する。

次にフラスコを回転振と５機上で２８℃ないし３０℃で
培養し、種々の間隔で試料を採取する。

１０７！試料を除去し、３倍量の塩化メテレンと共に振
と５することによつ℃抽出する。

抽出液の一部はシリカゲル及び上記の溶媒系すなわち２
：３（容量比）の酢酸エテルーシクロヘキサンを使用す
る薄層クロマトグラフィ、及び気液クロマトグラフイに
よって分析される。

化合物類■、■、■及び■が存在する証拠は、親Ｍ．フ
オルトウィトウムＡＴＣＣ６８４２からつ《られる新規
突然変異株によるシトステロールの選択的減成分解を確
証している。

実施例 ２ シトステロールから化合物Ｌ Ｈ、Ｉ［及び■への転化 使用の培地は実施例ｉ（ｃ）におけるものと同じである
。

この培地を１２１゜Ｃで３０分加熱することによって滅
菌する。

次いでこれを３０゜Ｃに冷却し、実施例１（ｃ）に記載
されたとおりに調製された突然変異株のミコバクテリウ
ムＭ．フオルトウィトウムＮＲＲＬ Ｂ−８ １ ２
８の種菌培養基１０部を接種する。

接種された混合物は水面下の生育を促進するためかきま
ぜながら、３０゜Ｃで３３６時間培養される。

培養後、混合物を塩化メチレンで抽出する。

抽出液を硅礫土に通し℃ろ過し、ろ液を乾固するまで真
空蒸留する。

残留物をスケリソルブＢ中の１０％クロロホルム中に取
上げ、シリカゲル上で展開剤としてスケリンルブＢ及び
それと増加量の酢酸エチルとの混合物を使用し又クロマ
トグラフイ処理にかける。

この手順で化合物工、■及び■が溶離される。

化合物■は酢酸エチル中の５％メタノールによりカラム
から溶離される。

化合物の溶離順序は■→■→■→■である。

薄層クロマトグラフイでのこれらの化合物のＲｆ値は以
下のとおりである（シクロヘキサンー酢酸エテル３：２
）。

Ｉ＝０．３７ ｆＩ＝０．２８ ＩＩＩ＝０．１６ ＩＶ＝０．０５ ＴＬＣで決定されるとおりに適当なフラクションを一緒
にして乾固するまで蒸発させると、化合物Ｉ、■、■及
び■の良好な収量を与える。

（収率各々４．０％，５．０％，８．０％，及び１２．
０％）酢酸エチルから再結晶後、化合物■は二つのエビ
マー類の工：ｌ混合物である。

化合物■は１００〜１１２℃で溶融する。

化合物■は油である。

化合物■は融点１２２〜１２４℃である。

化合物■は融点１４８〜１５０℃である。

実施例 ３ 実施例２のシトステロールの代わりにコレステロールを
使用して、化合物Ｉ１■、■及び■が得られる。

実施例 ４ 実施例２においてシトステロールの代わりにステグマス
テロールを使用して、化合物Ｉ、ＩＩ、■及び■が得ら
れる。

実施例 ５ 実施例２のシトステロールの代わりにカンペステロール
を使用して、化合物■、■、■及び■が得られる。

実施例 ６ 実施例２においてシトステロールの外に、又はシトステ
ロールの代わりに、実施例２〜５のステロイド類の任意
のものの組合せを加えて、化合物■、■、■及び■が得
られる。

参考例 ７ ミコバクテリウム・フオルトウイトウムＡＴＣＣ６８４
２０代わりに実施例１におい℃、アースロバクター（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）、バチルス（ Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ）、プレヴイバクテリウム（ Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ）、コリネバクテリウム（ Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）、ノカルディア（ Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ）、グロトアミノハクター（ Ｐｒｏｔ
ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ）、セラティア（ Ｓｅｒ
ｒａｔｉａ）及びストレプトミセス（ Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ）属からのステロールを減成分解させる微
生物を使用して、２〜１０個の炭素原子の１７−アルキ
ル側鎖をもった又はもたないステロイド類を選択的に減
成分解させて、発酵液中に化合物類工、■、■及び■を
蓄積する能力によって特徴づけられる突然変異株の微生
物が得られる。

参考例 ８ 実施例２〜６０Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬＢ−８
１２８の代わりに参考例７で得られる突然変異株を使用
して、化合物■、■、■及び■が得られる。

参考例 ９ 実施例１０Ｍ．フオルトウイトウムＡＴＣＣ６８４２０
代わりに、ミコバクテリウム・フレイ（ Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ ）、エム・スメグマチス
（ Ｍ ＋ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ）、エム●ロードク
ロウス（ Ｍ ， ｒｈｏｄｏ ｃｈｒｏｕｓ ）、エ
ム●ムコスム（Ｍ．ｍｕｃｏｓｕｍ ）及びエム・ブチ
リクス（ Ｍ ， ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を使用して、
２〜１０個の炭素原子の１７−アルキル側鎖をもった、
又はもたないステロイド類を選択的に減成分解させて発
酵液中に化合物工、■、■及び■を蓄積する能力によっ
て特徴づけられる突然変異株の微生物が得られる。

参考例 １０ 実施例２〜６０Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬＢ−８
１２８の代わりに参考例９で得られる突然変異株を使用
して、化合物■、■、■及び■が得られる。

実施例 ｌ１ 実施例２のシトステロールの代わりにアンドロストー４
−エンー３，１７−ジオン、アンドロスター１，４−ジ
エンー３，１７−ジオン、デヒドロエビアンドロステロ
ン、及びテストステロンからなる群から選ばれる化合物
を使用して、化合物■、■、■及び■が得られる。

実施例 １２ 実施例２のシトステロールの代わりにシトステロール、
コレステロール、スチグマステロール、アンドロストー
４−エンー３，１７−ジオン、アンドロスター１，４−
ジエンー３，１７−ジオン、デヒドロエビアンド口ステ
ロン、及びテストステロンからなる群から選ばれる２種
又はそれ以上の化合物類の組合せを使用して、化合物類
■、■、■及び■が得られる。

参考例 １３ 実施例１１と１２０Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ
Ｂ−８ １ ２ ８の代わりに参考例７で得られる突然
変異株を使用して、化合物類ｌ、■、■及び■が得られ
る。

参考例 １４ 実施例１１と１２０Ｍ．フオルトウイトウムの代わりに
参考例９で得られる突然変異株を使用して、化合物■、
■、■及び■が得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 好気的条件下、水性栄養培地中で２〜１０個の炭素
   原子の、１７−アルキル側鎖をもつ又いるか又はもつ℃
   いないステロイド類を選択的に減成分解させ、発酵液中
   に３ａα−Ｈ−４α一〔３′一プロパノール，］−７ａ
   β−メチルへキサヒドロー１ ． ５−インダンジオン
   へミケタール、３ａα一Ｈ−４α一〔３′−グロパナー
   ル〕−５α−ヒドロキシ−７ａβ−メチルへキサヒド口
   −１−インダノンヘミアセタール、３ａα一Ｈ−４α−
   〔３′一プロビオンＵ−５α−ヒドロキシー７ａβ−メ
   チルへキサヒドロ−１−インダノンーδ−ラクトン及び
   ３ａα−Ｈ−４α−〔３′一プロパノール〕−５α−ヒ
   ドロキシ−７ａβ−メチルへキサヒドロ−１−インダノ
   ンを蓄積する能力により特徴づけられる微生物ミコバク
   テリウム フオルトウイトウム（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
   ｒｉｕｍ ｆｏｒｔｏｕｉｔｕｍ ）。