JPS5910792B2 - 新規な微生物 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
微生物によるステロイド類の転化は広く研究され、記録
され℃いる。
され℃いる。
明らかに、最初のこのような研究は、1937年のマモ
リ( Mamoli )とヴエルセローネ( Verc
ellone )、Ber.70巻470頁及びBe
r.70巻2079頁によるものである。
リ( Mamoli )とヴエルセローネ( Verc
ellone )、Ber.70巻470頁及びBe
r.70巻2079頁によるものである。
彼らは酵母発酵による17一ケトステロイド類からl7
β−ヒドロキシステロイド類への還元を明らかにした。
β−ヒドロキシステロイド類への還元を明らかにした。
より最近では、ビーターソン( Peterson )
及びマレー( Murray )が、カビのリゾプス・
ニグリカンス( Rhizopusnigricans
)によるグロゲステロンのl1α−ヒドロキシル化を
明らかにした。
及びマレー( Murray )が、カビのリゾプス・
ニグリカンス( Rhizopusnigricans
)によるグロゲステロンのl1α−ヒドロキシル化を
明らかにした。
合衆国特許第2602769号( 1 952年)を参
照。
照。
また最近では、クレーキー( Kraychy)らが合
衆国特許第3684657号(1972年)で、アンド
口スト−4−エンー3,17−ジオン、アンドロス}−
1.4−ジエンー3,l7−ジオン、及び20α−ヒド
ロキシメチループレグt−1.4−ジエンー3−オンを
製造するため17−アルキル側鎖中に少なくとも8個の
炭素を含有するステロイド類をミコバクテリウム・スペ
シーズ ( Mycobaclerium sp, ) NR
RL B − 3 6 8 3によって発酵させること
による、ステロイドの17−アルキル側鎖の選択的な微
生物的減成分解を明らかにし℃いる。
衆国特許第3684657号(1972年)で、アンド
口スト−4−エンー3,17−ジオン、アンドロス}−
1.4−ジエンー3,l7−ジオン、及び20α−ヒド
ロキシメチループレグt−1.4−ジエンー3−オンを
製造するため17−アルキル側鎖中に少なくとも8個の
炭素を含有するステロイド類をミコバクテリウム・スペ
シーズ ( Mycobaclerium sp, ) NR
RL B − 3 6 8 3によって発酵させること
による、ステロイドの17−アルキル側鎖の選択的な微
生物的減成分解を明らかにし℃いる。
もつと最近では、マーシエツク( Marsheck
)らが合衆国特許第3759791号(1973年)で
、17−アルキル側鎖中に少な《とも8個の炭素を含有
するコレスタン又はスチグマスタン系のステロイドをミ
コバクテリウム・スペシーズNRRLB−3805によ
って発酵させることによる、アンドロストー4−エンー
3,17−ジオンの選択的な微生物学的製造を明らかに
している。
)らが合衆国特許第3759791号(1973年)で
、17−アルキル側鎖中に少な《とも8個の炭素を含有
するコレスタン又はスチグマスタン系のステロイドをミ
コバクテリウム・スペシーズNRRLB−3805によ
って発酵させることによる、アンドロストー4−エンー
3,17−ジオンの選択的な微生物学的製造を明らかに
している。
本発明の化合物■は、1963年( Biochem,
2巻IZ38−1243頁)にワン(Wang)及びシ
ー(Sih)が、ノカルディア・レストリクッス( N
ocardia restrictus)によるアンド
ロストー4−エンー17β−オール−3−オンの減成分
解における一中間体として開示され℃いる。
2巻IZ38−1243頁)にワン(Wang)及びシ
ー(Sih)が、ノカルディア・レストリクッス( N
ocardia restrictus)によるアンド
ロストー4−エンー17β−オール−3−オンの減成分
解における一中間体として開示され℃いる。
化合物■の開環型である7α−メチルーパーヒドロイン
ダンジオン−(1.5)−1:β−プロビルアルコール
ー(4),lは、ミコバクテリウム・スメグマチ,;Z
. ( Mycobacterium smegmat
is )によるグロゲステロンの減成分解における中間
体として、1964年(「ステロイド類」4巻581〜
586頁)シューベルト( Schubert )らに
よって開示された。
ダンジオン−(1.5)−1:β−プロビルアルコール
ー(4),lは、ミコバクテリウム・スメグマチ,;Z
. ( Mycobacterium smegmat
is )によるグロゲステロンの減成分解における中間
体として、1964年(「ステロイド類」4巻581〜
586頁)シューベルト( Schubert )らに
よって開示された。
突然変異株は、2〜10個の炭素原子の17−アルキル
側鎖を伴った、又は伴わないステロイド類を選択的に減
成分解させ、発酵液中に次の化合物類を蓄積する能力に
よって特徴づけられる。
側鎖を伴った、又は伴わないステロイド類を選択的に減
成分解させ、発酵液中に次の化合物類を蓄積する能力に
よって特徴づけられる。
3aα一H−40−〔3′一プロパノール〕−7aβ−
メチルへキサヒドロー1,5−インダンジオンへミケタ
ール (以下化合物■と称する)、 3aα−H−40一〔3′−プロバナール〕−50−ヒ
ドロキシ−7aβ−メチルへキサヒド口−1−インダノ
ンへミアセタール (以下化合物■と称する)、 3 a CX − H − 4 CX − [ 3’−
プロピオ7rl!3−50−ヒドロキシ−7aβ−メチ
ルへキサヒドロ−1−インダノンーδ−ラクトン (以下化合物■と称する)、及び 3aα−H−40一〔3′−グロパノール〕−50−ヒ
ドロキシ−7aβ−メチルへキサヒトロ−1−インダノ
ン (以下化合物■と称する) これらの突然変異株は、本明細書に明らかにされている
突然変異化手順又はその他の突然変異化手順を使用して
、次の属のステロールを減成分解させる微生物から得る
ことができる。
メチルへキサヒドロー1,5−インダンジオンへミケタ
ール (以下化合物■と称する)、 3aα−H−40一〔3′−プロバナール〕−50−ヒ
ドロキシ−7aβ−メチルへキサヒド口−1−インダノ
ンへミアセタール (以下化合物■と称する)、 3 a CX − H − 4 CX − [ 3’−
プロピオ7rl!3−50−ヒドロキシ−7aβ−メチ
ルへキサヒドロ−1−インダノンーδ−ラクトン (以下化合物■と称する)、及び 3aα−H−40一〔3′−グロパノール〕−50−ヒ
ドロキシ−7aβ−メチルへキサヒトロ−1−インダノ
ン (以下化合物■と称する) これらの突然変異株は、本明細書に明らかにされている
突然変異化手順又はその他の突然変異化手順を使用して
、次の属のステロールを減成分解させる微生物から得る
ことができる。
アースロバクター( Arthrobacter)、バ
チルス( Bacillus )、プレヴイバクテリウ
ム( Brevibacterium )、コリネバク
テリウ,IA ( Corynebacterium
)、ミコバクテリウ,IA ( Mycobacte
rium )、ノカルディア( Nocardia
)、グロトアミノバクター( Protoaminob
acter )、セラテイア( Serratia)及
びストレプトミセス( Slreptomyces )
。
チルス( Bacillus )、プレヴイバクテリウ
ム( Brevibacterium )、コリネバク
テリウ,IA ( Corynebacterium
)、ミコバクテリウ,IA ( Mycobacte
rium )、ノカルディア( Nocardia
)、グロトアミノバクター( Protoaminob
acter )、セラテイア( Serratia)及
びストレプトミセス( Slreptomyces )
。
好ましい属はミコバクテリウムである。
この属の例示的ナ種ハエム・フレイ( M .phle
i ) 、エム・スメグマテス( M , smegm
atis )、エム・ロードクロウス( M , r
hodochrous )、エム・ムコスム( M.m
ucosum)、エム・フオルトウイトウム( M ,
fortuitum )及びエム・ブチリクム( M
1butyricum )である。
i ) 、エム・スメグマテス( M , smegm
atis )、エム・ロードクロウス( M , r
hodochrous )、エム・ムコスム( M.m
ucosum)、エム・フオルトウイトウム( M ,
fortuitum )及びエム・ブチリクム( M
1butyricum )である。
本明細書に特定的に例示されているのは、新規な突然変
異株の微生物ミコバクテリウム・フオルトウイトウム(
Mycobacterium fortuitum
)、−NRRL B−8128である。
異株の微生物ミコバクテリウム・フオルトウイトウム(
Mycobacterium fortuitum
)、−NRRL B−8128である。
これは2〜10個の炭素原子を含有する17−アルキル
側鎖を伴った、又は伴わないステロイド類を選択的に減
成分解させて化合物■、■、■及び■を得るのに用いら
れる。
側鎖を伴った、又は伴わないステロイド類を選択的に減
成分解させて化合物■、■、■及び■を得るのに用いら
れる。
適当なステロイド類の例は、シトステロール、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロール、等の
、2〜10個の炭素原子の17−アルキル側鎖をもった
ステロイド類、それにアンドロストー4−エンー3,1
7−ジオン、アンドロスター1,4−ジエンー3,17
−ジオン、デヒドロエビアンドロステロン、及びテスト
ステロンである。
ロール、スチグマステロール、カンペステロール、等の
、2〜10個の炭素原子の17−アルキル側鎖をもった
ステロイド類、それにアンドロストー4−エンー3,1
7−ジオン、アンドロスター1,4−ジエンー3,17
−ジオン、デヒドロエビアンドロステロン、及びテスト
ステロンである。
これらのステロイド基質は精製型又は粗製型でありうる
。
。
微生物
上記のようにステロイド類を選択的に減成分解させ、発
酵液中に化合物■、■、■及び■を蓄積する能力によっ
て特徴づけられる突然変異株をζ次の属すなわちアース
ロバクター、バチルス、プレヴイバクテリウム、コリネ
バクテリウム、ミコバクテリウム、ノカルディア、グロ
トアミノバクター、セラチア、及びストレプトミセスの
、ステロールを減成分解させる微生物を突然変異させる
ことによって得られる。
酵液中に化合物■、■、■及び■を蓄積する能力によっ
て特徴づけられる突然変異株をζ次の属すなわちアース
ロバクター、バチルス、プレヴイバクテリウム、コリネ
バクテリウム、ミコバクテリウム、ノカルディア、グロ
トアミノバクター、セラチア、及びストレプトミセスの
、ステロールを減成分解させる微生物を突然変異させる
ことによって得られる。
本明細書に記載のとおりにミコバクテリウム・フオルト
ウイトウムATCC6842を突然変異させると、新規
な実験室的突然変異株の微生物を生ずる。
ウイトウムATCC6842を突然変異させると、新規
な実験室的突然変異株の微生物を生ずる。
1974年度ATCCカタログは、ATCC68420
名簿と共に以下を明らかにしている。
名簿と共に以下を明らかにしている。
ジエイ・シー・クルス( J.C,Cruz )2、C
old abscess.ActaMed, Rio
de Janeiro 1巻1頁(1936年)。
old abscess.ActaMed, Rio
de Janeiro 1巻1頁(1936年)。
Medium 9 0 3 7 COM ,フオルトウ
イトウムATCC6842はステロール類を小分子量の
化合物類、例えばCO2+H20へ非選択的に減成分解
させる。
イトウムATCC6842はステロール類を小分子量の
化合物類、例えばCO2+H20へ非選択的に減成分解
させる。
このためこの微生物は選択的なステロイド減成生物とし
℃適当ではない。
℃適当ではない。
二トロソグアニジンを使用するM.フオルトウィトウム
ATCC 6 8 4 2の突然変異化は、本明細書に
定義されたとおりに、ステロイド類を選択的に減成分解
させて化合物類■、■、■及び■をつ《るよ5な新規な
突然変異株の産生をもたらした。
ATCC 6 8 4 2の突然変異化は、本明細書に
定義されたとおりに、ステロイド類を選択的に減成分解
させて化合物類■、■、■及び■をつ《るよ5な新規な
突然変異株の産生をもたらした。
これが永久保存株中に寄託されている合衆国イリノイ州
ピオリアの合衆国農務省北部地域研究所により、M.フ
オルトウィトウムのこの突然変異株の微生物はNRRL
B−8 1 2 8という受入れ番号を与えられた。
ピオリアの合衆国農務省北部地域研究所により、M.フ
オルトウィトウムのこの突然変異株の微生物はNRRL
B−8 1 2 8という受入れ番号を与えられた。
この微生物の二次培養基は、ここへ要求すればこの寄託
所から自由に入手できる。
所から自由に入手できる。
父上記突然変異株は、日本におい又は昭和51年11月
12日に工業技術院微生物工業技術研究所に保管委託申
請した。
12日に工業技術院微生物工業技術研究所に保管委託申
請した。
微生物受託番号は第3804号である。
二次培養基が入手できるからといって、政府命令によっ
て証書と共に授与される特許権を侵害して本発明を実施
するという実施権を構成するものではないことを理解す
べきである。
て証書と共に授与される特許権を侵害して本発明を実施
するという実施権を構成するものではないことを理解す
べきである。
M.フオルトウィトウムNRR’L B − 8 1
2 8の形態及び薬剤感受性は親のM.フオルトウイト
ウムATCC 6 8 4 2のそれと区別できない。
2 8の形態及び薬剤感受性は親のM.フオルトウイト
ウムATCC 6 8 4 2のそれと区別できない。
双方のM.フオルトウイトウムの培養基はアクチノマイ
セタレス( Actinomycetales )目
のミコバクテリアセア( Mycobacteriac
eae )科に属する耐酸性で非自動型の、胞子を形成
しない杆菌である。
セタレス( Actinomycetales )目
のミコバクテリアセア( Mycobacteriac
eae )科に属する耐酸性で非自動型の、胞子を形成
しない杆菌である。
ラニョンの分類(ラニョン・イー・エイチ( Runy
on , E, H, )、1959年Med , C
Iin,North Arnerica 4 3巻27
3頁)によると、これは非色素群■のミコバクテリウム
である。
on , E, H, )、1959年Med , C
Iin,North Arnerica 4 3巻27
3頁)によると、これは非色素群■のミコバクテリウム
である。
すなわち低温で急速に生育して、比較的簡単な培地上で
色素をもたない集落をつくる。
色素をもたない集落をつくる。
ステロイド分子に対する作用においては、M.フオルト
ウイトウムATCC6 842とM.フオルトウイトウ
ムNRRL B−8 1 2 8は明瞭に区別できる。
ウイトウムATCC6 842とM.フオルトウイトウ
ムNRRL B−8 1 2 8は明瞭に区別できる。
上に明らかにされたように、M.フオルトウイトウムA
TCC6842はステロイド類の非選択的な減成分解生
物であるのに反し、M.フォルトウイトウムNRRL
B−812 8は選択的な減成分解生物である。
TCC6842はステロイド類の非選択的な減成分解生
物であるのに反し、M.フォルトウイトウムNRRL
B−812 8は選択的な減成分解生物である。
M.フオルトウイトウムNRRL B−8 1 2 8
のこの性状によって、これは本明細書で明らかにされた
ように非常に有用なものとなっている。
のこの性状によって、これは本明細書で明らかにされた
ように非常に有用なものとなっている。
M.フオルトウイトウムNRRL B−8 1 2 8
をつくるためのM.フオルトウイトウムATCC684
2の突然変異化は、ニトロソグアニシンを用い℃達成さ
れる。
をつくるためのM.フオルトウイトウムATCC684
2の突然変異化は、ニトロソグアニシンを用い℃達成さ
れる。
手順の詳細はあとに記載され℃いる。
突然変異の手順は概し又この技術に知られているが、こ
の突然変異の手順を用いて得られる突然変異株の種類を
教示したり、或は示唆したりさえするような既知の技術
はまだない。
の突然変異の手順を用いて得られる突然変異株の種類を
教示したり、或は示唆したりさえするような既知の技術
はまだない。
また本明細書に明らかにされた突然変異化及び転化手順
はミコバクテリウムに対し℃詳細に記載されているが、
同様な又は同等の手順を本明細書に明らかにされている
ようにその他の属の微生物に対して使用できることを理
解すべきである。
はミコバクテリウムに対し℃詳細に記載されているが、
同様な又は同等の手順を本明細書に明らかにされている
ようにその他の属の微生物に対して使用できることを理
解すべきである。
転化方法
本発明の選択的転化は、培養期間中に選ばれたステロイ
ド基質を培養基へ加えるか、又は接種に先立って栄養培
地へこれを混入させることによって、M.フオルトウイ
トウムNRRL B−8128の生育している培養基中
で実施できる。
ド基質を培養基へ加えるか、又は接種に先立って栄養培
地へこれを混入させることによって、M.フオルトウイ
トウムNRRL B−8128の生育している培養基中
で実施できる。
ステロイドを単独で、又は他のステロイドと組合わせ℃
添加できる。
添加できる。
限定はしないが培養基中のステロイドの好ましい濃度範
囲は、リットル当り約0.1ないし約101である。
囲は、リットル当り約0.1ないし約101である。
炭素源、例えば同化できる炭水化物、及び窒素源、例え
ば同化できる窒素化合物又は蛋白質材料を含有する栄養
培地中で培養基を生育させる。
ば同化できる窒素化合物又は蛋白質材料を含有する栄養
培地中で培養基を生育させる。
好ましい炭素源は萄葡糖、黒砂糖、蔗糖、グリセロール
、殿粉、コーンスターチ、乳糖、デキストリン、糖蜜等
である。
、殿粉、コーンスターチ、乳糖、デキストリン、糖蜜等
である。
好ましい窒素源はコーンスチープリカー、酵母、固形乳
を加え自己消化されたビール酵母、大豆粉、棉実粉、コ
ーンミール、固形乳、カゼインのすい液消化物、魚粉、
デイスチラーズソリッド、動物ペプトン液、肉と骨の砕
片、アンモニウム塩等を包含する。
を加え自己消化されたビール酵母、大豆粉、棉実粉、コ
ーンミール、固形乳、カゼインのすい液消化物、魚粉、
デイスチラーズソリッド、動物ペプトン液、肉と骨の砕
片、アンモニウム塩等を包含する。
これらの炭素源と窒素源の組合わせを有利に使用できる
。
。
痕跡の金属類、例えば亜鉛、マグネシウム、マンガン、
コバルト、鉄等は発酵培地に加える必要がない。
コバルト、鉄等は発酵培地に加える必要がない。
というのは、培地の滅菌前に培地の成分として水道水及
び未精製の成分を使用するからである。
び未精製の成分を使用するからである。
転化方法は約72時間から15日までの範囲である。
転化過程中の培養温度は約25℃ないし約37℃の範囲
であり、30゜Cが好ましい。
であり、30゜Cが好ましい。
転化容器の内容物に滅菌された空気を通してかきまぜ、
微生物の生育を容易ならしめかくして転化過程の有効度
を強める。
微生物の生育を容易ならしめかくして転化過程の有効度
を強める。
シリカゲル板(E,メルク社、ダルムシュタット)及び
2:3(容量比)の酢酸エチルーシクロヘキサンからな
る溶媒系を使用する薄層クロマトグラフイによって証拠
立てられるように、転化方法の終了後、望んでいる転化
されたステロイド類はこの技術によく知られた手段によ
つ又回収される。
2:3(容量比)の酢酸エチルーシクロヘキサンからな
る溶媒系を使用する薄層クロマトグラフイによって証拠
立てられるように、転化方法の終了後、望んでいる転化
されたステロイド類はこの技術によく知られた手段によ
つ又回収される。
例えば発酵液と菌体とを含んだ発酵(転化)反応混合物
をステロイド用の水と混ざらない有機溶媒で抽出できる
。
をステロイド用の水と混ざらない有機溶媒で抽出できる
。
適当な溶媒は塩化メチレン(好適)、クロロホルム、四
塩化炭素、塩化エチレン } IJクロロエチレン、エ
ーテル、酢酸アミル、ベンゼン等である。
塩化炭素、塩化エチレン } IJクロロエチレン、エ
ーテル、酢酸アミル、ベンゼン等である。
その代わりに、発酵液と菌体なまず慣用方法、例えばろ
過又は遠心分離によつ℃分離し、次に適当な溶媒で別々
に抽出する。
過又は遠心分離によつ℃分離し、次に適当な溶媒で別々
に抽出する。
菌体な水と混ざる、又は水と混ざらない溶媒で抽出でき
る。
る。
菌体な含んでいない発酵液を水と混ざらない溶媒で抽出
できる。
できる。
抽出液を硅藻土に通してろ過し、ろ液を乾固するまで真
空蒸留できる。
空蒸留できる。
望んでいる転化ステロイドを含有する残留物をスケリン
ルブB中のlθ%クロロホルム中に溶解し、スケリソル
ブB(異性体ヘキサン)及びそれと増加量の酢酸エチル
との混合物を展開溶媒として使用し℃、シリカゲル上の
クロマトグラフイにかける。
ルブB中のlθ%クロロホルム中に溶解し、スケリソル
ブB(異性体ヘキサン)及びそれと増加量の酢酸エチル
との混合物を展開溶媒として使用し℃、シリカゲル上の
クロマトグラフイにかける。
この手順により、化合物工、■、及び■が溶離される。
化合物■は例えば酢酸エチル中の5%メタノールで溶離
できる。
できる。
結晶生成物は溶媒、例えば酢酸エチルを用い℃得られる
。
。
望んでいる転化ステロイドも、残りの上澄液から、上澄
液中の溶媒蒸発によつ℃得られる。
液中の溶媒蒸発によつ℃得られる。
化合物工、■、■及び■は有用なステロイト゛類の化学
合成における中間体として有用である。
合成における中間体として有用である。
例えば、本化合物類は、有用な19−ノルステロイド類
の全合成法を明らかにした合衆国特許第3880884
号の方法に対する出発材料へ転化できる。
の全合成法を明らかにした合衆国特許第3880884
号の方法に対する出発材料へ転化できる。
出発材料へのこの転化は、この技術に知られた手順、例
えば酢酸中でクロム酸によって酸化させ、続いて無水酢
酸と酢酸ナトリウム処理によって行なわれる。
えば酢酸中でクロム酸によって酸化させ、続いて無水酢
酸と酢酸ナトリウム処理によって行なわれる。
B i ochem 2巻1238〜1243頁及び
J.A.C.S,85巻2135〜2137頁を参九 以下の実施例は本発明の方法と生成物の例示であるが、
限定的に考えられ又はならない。
J.A.C.S,85巻2135〜2137頁を参九 以下の実施例は本発明の方法と生成物の例示であるが、
限定的に考えられ又はならない。
他に注意がなげれば百分率はすべ℃重量によるものであ
り、またあらゆる溶媒混合物の割合は容量による。
り、またあらゆる溶媒混合物の割合は容量による。
実施例 I
M.フオルトウイトウムATCC6842から突然変異
株M.フオルトウイトウムNRRL B−8128の調
製 a)二トロングアニジンによる突然変異種の生成M。
株M.フオルトウイトウムNRRL B−8128の調
製 a)二トロングアニジンによる突然変異種の生成M。
フオルトウイトウムATCC6842の菌体を28℃で
次の無菌的な種菌培地中で生育させる。
次の無菌的な種菌培地中で生育させる。
栄養培養液(ディフコ) 8 ?/11酵母エキス
1 ?/1プロビオン酸ナトリウム
0.5f/A蒸 留 水 1lとするに十
分な量IN NaOHでpnを7.0に調整L,”!
−ら、121℃で20分滅菌する。
1 ?/1プロビオン酸ナトリウム
0.5f/A蒸 留 水 1lとするに十
分な量IN NaOHでpnを7.0に調整L,”!
−ら、121℃で20分滅菌する。
菌体な約5X108/一の密度まで生育させ、遠心分離
によつ℃ペレット化し、次いで同量の無菌的な0,IM
<えん酸ナトリウム(pH5.6)で洗う。
によつ℃ペレット化し、次いで同量の無菌的な0,IM
<えん酸ナトリウム(pH5.6)で洗う。
洗った菌体を同量のくえん酸緩衡液に再懸濁し、滴定(
菌の計数)のため試料を除き、二トロングアニジンを5
0μv/7!の最終濃度まで加える。
菌の計数)のため試料を除き、二トロングアニジンを5
0μv/7!の最終濃度まで加える。
菌の懸濁液を37゜Cの水浴中で30分温だめ、次いで
一試料を滴定のため除去し、残りを遠心分離し、同量の
無菌的な0. 1 M燐酸カリウム(pH7.0)で洗
う。
一試料を滴定のため除去し、残りを遠心分離し、同量の
無菌的な0. 1 M燐酸カリウム(pH7.0)で洗
う。
最後に以下からなる炭素源をもだない無菌的な最少の塩
媒質中に菌体を再懸濁させる。
媒質中に菌体を再懸濁させる。
NH4No3 1.0 t/IK2H
PO40.2 5 f/l! MgSO,−7H20 0.25 t/INaC
I 0.O05f/lFeS04・7
H20 0.001v/l蒸 留 水 1lと
するのに十分な量INHCIでpHを7.0に調整して
から、121℃で20分滅菌する。
PO40.2 5 f/l! MgSO,−7H20 0.25 t/INaC
I 0.O05f/lFeS04・7
H20 0.001v/l蒸 留 水 1lと
するのに十分な量INHCIでpHを7.0に調整して
から、121℃で20分滅菌する。
次に突然変異株を選び出すために菌体なプレート上へ広
げる。
げる。
b)突然変異株M.フオルトウィトウムNRRLB−8
128の選択と単離 上記のとおりに突然変異化された菌体を希釈し、次のも
のからなる培地(フレーザー( Fraser )及び
ジエL//L/( Jerrel )、1963年、
J.Biol, Chem.2 0 5巻291〜29
5頁から変更したもの)を含有するプレート上へ広げる
。
128の選択と単離 上記のとおりに突然変異化された菌体を希釈し、次のも
のからなる培地(フレーザー( Fraser )及び
ジエL//L/( Jerrel )、1963年、
J.Biol, Chem.2 0 5巻291〜29
5頁から変更したもの)を含有するプレート上へ広げる
。
グリセロール 10.0 t/INa H
PO48.4 t/1 2 KH2P0, 4.5 t/INH
4Cl 2.0 f/13MgSO
,− 7H20 0.3 fit/11Fe
C l,− 6H20 0.0 5 f/l蒸
留 水 1lとするに十分な量寒天(15v
/l)を加え、培地を121℃で30分間オートクレー
プ処理し、次いで無菌のべトリ皿に注ぐ。
PO48.4 t/1 2 KH2P0, 4.5 t/INH
4Cl 2.0 f/13MgSO
,− 7H20 0.3 fit/11Fe
C l,− 6H20 0.0 5 f/l蒸
留 水 1lとするに十分な量寒天(15v
/l)を加え、培地を121℃で30分間オートクレー
プ処理し、次いで無菌のべトリ皿に注ぐ。
この培地上の生育は、突然変異種生成手順によつ又つく
られるほとんどの栄養作用物質を排除し℃いる。
られるほとんどの栄養作用物質を排除し℃いる。
例えば化学的に定義された培地上での生育のためにビタ
ミン類、生長要素等を必要とする培養基は排除される。
ミン類、生長要素等を必要とする培養基は排除される。
28℃で約7日間培養後、生ずる集落を突然変異の選定
に適した試験プレート上へ複製し、次いでグリセロール
基盤の培地を含有する対照プレート上へ戻す。
に適した試験プレート上へ複製し、次いでグリセロール
基盤の培地を含有する対照プレート上へ戻す。
試験プレートはビーターンン・ジー・イー( Pete
rson, G, E. )、エイチ・エル・ルイス(
H, L, Lewis )及びジエイ・アール−デ
ービス( J.R,Davis ) 1962年「寒天
培地中におけるコレステロールその他の水に溶けない炭
素源の均一分散物の調製」( J . Lipid R
esearch 3巻275〜276頁)に記載のとお
りにつくられる。
rson, G, E. )、エイチ・エル・ルイス(
H, L, Lewis )及びジエイ・アール−デ
ービス( J.R,Davis ) 1962年「寒天
培地中におけるコレステロールその他の水に溶けない炭
素源の均一分散物の調製」( J . Lipid R
esearch 3巻275〜276頁)に記載のとお
りにつくられる。
これらのプレート中の最少塩培地は、実施例1の(am
K−記載されたとおりである。
K−記載されたとおりである。
寒天( 1 5 ’if/l )と、シトステロール又
はアンド口ステンジオン( A’D )のような適当な
炭素源( l.o y/13 )を加え、生ずる懸濁液
な121℃で30分オートクレープ処理する。
はアンド口ステンジオン( A’D )のような適当な
炭素源( l.o y/13 )を加え、生ずる懸濁液
な121℃で30分オートクレープ処理する。
次に滅菌された熱い混合物を無菌の配合容器に注ぎ、数
分間配合し、次いで無菌のペトリ皿へ注ぐ。
分間配合し、次いで無菌のペトリ皿へ注ぐ。
この手順で発泡が問題となりがちであるが、混合物が熱
いうちに配合することと、溶融寒天のプレート表面に炎
を当てることによって減少できる。
いうちに配合することと、溶融寒天のプレート表面に炎
を当てることによって減少できる。
この方法で水に溶けない炭素源の均質分散が得られる。
これは非常に均質であるが不透明な寒天プレートの調製
を容易ならしめる。
を容易ならしめる。
対照プレート上で生育するが、唯一の炭素源としてAD
を含有する試験プレート上では生育しない集落をζ栄養
寒天プレート上の画線分離によつ又精製される。
を含有する試験プレート上では生育しない集落をζ栄養
寒天プレート上の画線分離によつ又精製される。
28℃で生育後、個々の集落を滅菌したつまようじで栄
養寒天グレートから取上げ、炭素源としてADを含有す
るプレートヘ穿刺によって接種し℃再試験をする。
養寒天グレートから取上げ、炭素源としてADを含有す
るプレートヘ穿刺によって接種し℃再試験をする。
親培養基とは異なる表現型を示す精製された単離物は、
振と5フラスコで評価される。
振と5フラスコで評価される。
C)振と5フラスコ評価法
振と5フラスコ( 5 0 0yd)は以下の成分から
なる生物転化培地100rrll.を含有する。
なる生物転化培地100rrll.を含有する。
グリセロール 10.O fI/INa H
PO48.4 ?/l 2 KI{2PO44.5 t/11 NH4C l 2.O f//IMg
S04.7HO O.3 t/12 FeC l3− 6H20 0.0 5 f/
it蒸 留 水 1lとするに十分な量大豆粉
( 1 ?/l )を培地へ配合し、次にシトステロー
ル( 1 0 r/l)を培地に配合する。
PO48.4 ?/l 2 KI{2PO44.5 t/11 NH4C l 2.O f//IMg
S04.7HO O.3 t/12 FeC l3− 6H20 0.0 5 f/
it蒸 留 水 1lとするに十分な量大豆粉
( 1 ?/l )を培地へ配合し、次にシトステロー
ル( 1 0 r/l)を培地に配合する。
フラスコを121’Cで20分オートクレープ処理して
から、28℃に冷却し、次いで以下のようにして調製さ
れた種菌生育物10−を接種する。
から、28℃に冷却し、次いで以下のようにして調製さ
れた種菌生育物10−を接種する。
b瑯からの精製された単離菌を28℃で寒天斜面培地に
生育させる。
生育させる。
斜面培地からの一すくいの菌体を取って、次の成分から
なる滅菌した種菌培地100−を含有する500−フラ
スコに接種するために使用する。
なる滅菌した種菌培地100−を含有する500−フラ
スコに接種するために使用する。
栄養培養液(ディフコ) 8”i/1酵母エキス
1t/11グリセロール
5 ?/13 蒸 貿 水 1lとするに十分な量IN N
aOHでpHを7.0に調整してから、フラスコを12
1℃で20分オートクレープ処理する。
1t/11グリセロール
5 ?/13 蒸 貿 水 1lとするに十分な量IN N
aOHでpHを7.0に調整してから、フラスコを12
1℃で20分オートクレープ処理する。
種菌フラスコを28℃で72時間培養する。上に明らか
にされたように、種菌生育物10mを使用して、滅菌し
た転化培地100−を含有する各々の500−フラスコ
を接種する。
にされたように、種菌生育物10mを使用して、滅菌し
た転化培地100−を含有する各々の500−フラスコ
を接種する。
次にフラスコを回転振と5機上で28℃ないし30℃で
培養し、種々の間隔で試料を採取する。
培養し、種々の間隔で試料を採取する。
107!試料を除去し、3倍量の塩化メテレンと共に振
と5することによつ℃抽出する。
と5することによつ℃抽出する。
抽出液の一部はシリカゲル及び上記の溶媒系すなわち2
:3(容量比)の酢酸エテルーシクロヘキサンを使用す
る薄層クロマトグラフィ、及び気液クロマトグラフイに
よって分析される。
:3(容量比)の酢酸エテルーシクロヘキサンを使用す
る薄層クロマトグラフィ、及び気液クロマトグラフイに
よって分析される。
化合物類■、■、■及び■が存在する証拠は、親M.フ
オルトウィトウムATCC6842からつ《られる新規
突然変異株によるシトステロールの選択的減成分解を確
証している。
オルトウィトウムATCC6842からつ《られる新規
突然変異株によるシトステロールの選択的減成分解を確
証している。
実施例 2
シトステロールから化合物L H、I[及び■への転化
使用の培地は実施例i(c)におけるものと同じである
。
。
この培地を121゜Cで30分加熱することによって滅
菌する。
菌する。
次いでこれを30゜Cに冷却し、実施例1(c)に記載
されたとおりに調製された突然変異株のミコバクテリウ
ムM.フオルトウィトウムNRRL B−8 1 2
8の種菌培養基10部を接種する。
されたとおりに調製された突然変異株のミコバクテリウ
ムM.フオルトウィトウムNRRL B−8 1 2
8の種菌培養基10部を接種する。
接種された混合物は水面下の生育を促進するためかきま
ぜながら、30゜Cで336時間培養される。
ぜながら、30゜Cで336時間培養される。
培養後、混合物を塩化メチレンで抽出する。
抽出液を硅礫土に通し℃ろ過し、ろ液を乾固するまで真
空蒸留する。
空蒸留する。
残留物をスケリソルブB中の10%クロロホルム中に取
上げ、シリカゲル上で展開剤としてスケリンルブB及び
それと増加量の酢酸エチルとの混合物を使用し又クロマ
トグラフイ処理にかける。
上げ、シリカゲル上で展開剤としてスケリンルブB及び
それと増加量の酢酸エチルとの混合物を使用し又クロマ
トグラフイ処理にかける。
この手順で化合物工、■及び■が溶離される。
化合物■は酢酸エチル中の5%メタノールによりカラム
から溶離される。
から溶離される。
化合物の溶離順序は■→■→■→■である。
薄層クロマトグラフイでのこれらの化合物のRf値は以
下のとおりである(シクロヘキサンー酢酸エテル3:2
)。
下のとおりである(シクロヘキサンー酢酸エテル3:2
)。
I=0.37
fI=0.28
III=0.16
IV=0.05
TLCで決定されるとおりに適当なフラクションを一緒
にして乾固するまで蒸発させると、化合物I、■、■及
び■の良好な収量を与える。
にして乾固するまで蒸発させると、化合物I、■、■及
び■の良好な収量を与える。
(収率各々4.0%,5.0%,8.0%,及び12.
0%)酢酸エチルから再結晶後、化合物■は二つのエビ
マー類の工:l混合物である。
0%)酢酸エチルから再結晶後、化合物■は二つのエビ
マー類の工:l混合物である。
化合物■は100〜112℃で溶融する。
化合物■は油である。
化合物■は融点122〜124℃である。
化合物■は融点148〜150℃である。
実施例 3
実施例2のシトステロールの代わりにコレステロールを
使用して、化合物I1■、■及び■が得られる。
使用して、化合物I1■、■及び■が得られる。
実施例 4
実施例2においてシトステロールの代わりにステグマス
テロールを使用して、化合物I、II、■及び■が得ら
れる。
テロールを使用して、化合物I、II、■及び■が得ら
れる。
実施例 5
実施例2のシトステロールの代わりにカンペステロール
を使用して、化合物■、■、■及び■が得られる。
を使用して、化合物■、■、■及び■が得られる。
実施例 6
実施例2においてシトステロールの外に、又はシトステ
ロールの代わりに、実施例2〜5のステロイド類の任意
のものの組合せを加えて、化合物■、■、■及び■が得
られる。
ロールの代わりに、実施例2〜5のステロイド類の任意
のものの組合せを加えて、化合物■、■、■及び■が得
られる。
参考例 7
ミコバクテリウム・フオルトウイトウムATCC684
20代わりに実施例1におい℃、アースロバクター(
Arthrobacter )、バチルス( Baci
llus )、プレヴイバクテリウム( Brevib
acterium )、コリネバクテリウム( Cor
ynebacterium )、ノカルディア( No
cardia )、グロトアミノハクター( Prot
aminobacter )、セラティア( Ser
ratia)及びストレプトミセス( Strepto
myces )属からのステロールを減成分解させる微
生物を使用して、2〜10個の炭素原子の17−アルキ
ル側鎖をもった又はもたないステロイド類を選択的に減
成分解させて、発酵液中に化合物類工、■、■及び■を
蓄積する能力によって特徴づけられる突然変異株の微生
物が得られる。
20代わりに実施例1におい℃、アースロバクター(
Arthrobacter )、バチルス( Baci
llus )、プレヴイバクテリウム( Brevib
acterium )、コリネバクテリウム( Cor
ynebacterium )、ノカルディア( No
cardia )、グロトアミノハクター( Prot
aminobacter )、セラティア( Ser
ratia)及びストレプトミセス( Strepto
myces )属からのステロールを減成分解させる微
生物を使用して、2〜10個の炭素原子の17−アルキ
ル側鎖をもった又はもたないステロイド類を選択的に減
成分解させて、発酵液中に化合物類工、■、■及び■を
蓄積する能力によって特徴づけられる突然変異株の微生
物が得られる。
参考例 8
実施例2〜60M.フオルトウイトウムNRRLB−8
128の代わりに参考例7で得られる突然変異株を使用
して、化合物■、■、■及び■が得られる。
128の代わりに参考例7で得られる突然変異株を使用
して、化合物■、■、■及び■が得られる。
参考例 9
実施例10M.フオルトウイトウムATCC68420
代わりに、ミコバクテリウム・フレイ( Mycoba
cterium phlei )、エム・スメグマチス
( M +smegmatis )、エム●ロードク
ロウス( M , rhodo chrous )、エ
ム●ムコスム(M.mucosum )及びエム・ブチ
リクス( M , butyricum)を使用して、
2〜10個の炭素原子の17−アルキル側鎖をもった、
又はもたないステロイド類を選択的に減成分解させて発
酵液中に化合物工、■、■及び■を蓄積する能力によっ
て特徴づけられる突然変異株の微生物が得られる。
代わりに、ミコバクテリウム・フレイ( Mycoba
cterium phlei )、エム・スメグマチス
( M +smegmatis )、エム●ロードク
ロウス( M , rhodo chrous )、エ
ム●ムコスム(M.mucosum )及びエム・ブチ
リクス( M , butyricum)を使用して、
2〜10個の炭素原子の17−アルキル側鎖をもった、
又はもたないステロイド類を選択的に減成分解させて発
酵液中に化合物工、■、■及び■を蓄積する能力によっ
て特徴づけられる突然変異株の微生物が得られる。
参考例 10
実施例2〜60M.フオルトウイトウムNRRLB−8
128の代わりに参考例9で得られる突然変異株を使用
して、化合物■、■、■及び■が得られる。
128の代わりに参考例9で得られる突然変異株を使用
して、化合物■、■、■及び■が得られる。
実施例 l1
実施例2のシトステロールの代わりにアンドロストー4
−エンー3,17−ジオン、アンドロスター1,4−ジ
エンー3,17−ジオン、デヒドロエビアンドロステロ
ン、及びテストステロンからなる群から選ばれる化合物
を使用して、化合物■、■、■及び■が得られる。
−エンー3,17−ジオン、アンドロスター1,4−ジ
エンー3,17−ジオン、デヒドロエビアンドロステロ
ン、及びテストステロンからなる群から選ばれる化合物
を使用して、化合物■、■、■及び■が得られる。
実施例 12
実施例2のシトステロールの代わりにシトステロール、
コレステロール、スチグマステロール、アンドロストー
4−エンー3,17−ジオン、アンドロスター1,4−
ジエンー3,17−ジオン、デヒドロエビアンド口ステ
ロン、及びテストステロンからなる群から選ばれる2種
又はそれ以上の化合物類の組合せを使用して、化合物類
■、■、■及び■が得られる。
コレステロール、スチグマステロール、アンドロストー
4−エンー3,17−ジオン、アンドロスター1,4−
ジエンー3,17−ジオン、デヒドロエビアンド口ステ
ロン、及びテストステロンからなる群から選ばれる2種
又はそれ以上の化合物類の組合せを使用して、化合物類
■、■、■及び■が得られる。
参考例 13
実施例11と120M.フオルトウイトウムNRRL
B−8 1 2 8の代わりに参考例7で得られる突然
変異株を使用して、化合物類l、■、■及び■が得られ
る。
B−8 1 2 8の代わりに参考例7で得られる突然
変異株を使用して、化合物類l、■、■及び■が得られ
る。
参考例 14
実施例11と120M.フオルトウイトウムの代わりに
参考例9で得られる突然変異株を使用して、化合物■、
■、■及び■が得られる。
参考例9で得られる突然変異株を使用して、化合物■、
■、■及び■が得られる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 好気的条件下、水性栄養培地中で2〜10個の炭素
原子の、17−アルキル側鎖をもつ又いるか又はもつ℃
いないステロイド類を選択的に減成分解させ、発酵液中
に3aα−H−4α一〔3′一プロパノール,]−7a
β−メチルへキサヒドロー1 . 5−インダンジオン
へミケタール、3aα一H−4α一〔3′−グロパナー
ル〕−5α−ヒドロキシ−7aβ−メチルへキサヒド口
−1−インダノンヘミアセタール、3aα一H−4α−
〔3′一プロビオンU−5α−ヒドロキシー7aβ−メ
チルへキサヒドロ−1−インダノンーδ−ラクトン及び
3aα−H−4α−〔3′一プロパノール〕−5α−ヒ
ドロキシ−7aβ−メチルへキサヒドロ−1−インダノ
ンを蓄積する能力により特徴づけられる微生物ミコバク
テリウム フオルトウイトウム( Mycobacte
rium fortouitum )。
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