PL106350B1 - Sposob wytwarzania pochodnych 3 alfa-h-7a beta-metyloszesciowodoroindanonu-1 - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 30.09.1980,( 106350 Int. CL* C07D 311/78 //C12D 13/00 C07C 35/32 CZYTELNIA Ur-c-du Patentowego J f t| IzcezttHfifMj Utat| Twórcy wynalazku: John Costain Knight, Merle Gene (Wovcha) Uprawniony z patentu: The Upjohn Company, Kalamazoo (Stany Zjed¬ noczone Ameryki) Sposób wytwarzania pochodnych 3<*-H-7aP-metyloszesciowodoroindanonu-l iFrzedmiotem wynalazku jest sposób wyttowairza- nia pochodnych 3a^-7a£-metylosze^owodoxoin- dainonu-il o wzorze 1, 2, 3 i 4, stosowanych jako produkty posrednie do wytwairzamiLa uzytecznych steroidów.

Przeksztalcanie steroidów przeprowadzane przy uzyciu drobnoustrojów jest szeroko znanie i opisa¬ ne w literaturze. Jednymi z najwczesniej opulbflri- kowanych prac sa publikacje Mamoli i Vercello- ne z 1937 roku Ber. 70, 470 i Beir. 70, 207i9. Au¬ torzy ci opisali proces redukcji 17-ketosteroidów do 17-p-hydroksysteroidów, przeprowadzany przy uzyciu drozdzy fermentacyjnych. W pózniejszej pracy Patarsona i Murraya opisano proces lla-hy- droksylaejii progesteronu, prowadzony jprzy uzyciu grzybów Rhizepus ntigricans (opis patentowy St. Zjedn, Ameryki nr 2 602 709).

Równiez ostatnio w opisie 'patentowym St. Zjedn.

Ameryki aur 3 684 657 opisano selektywmy mikrobio¬ logiczny proces rozkladu 1.7-alkiloste.roiklów, w których grupa 17^alkliilowa oznacza girupe o co naj¬ mniej 8 atomach wegla, przeprowadzany w celu uzyskania andxoist€no-4-dioinu-3^17,andiroBtadieno- - -l,4-onu-3, przy uzyciu Mycobacterium sp MRRL B-3686,,. W jeszcze pózniejszym opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3 759791 otpliisano selektyw¬ ne, mikrobiologiczne wytwarzanie andirosteno-4- -dionu^3yl7 za pomoca fermentacji steroidu z serii cholastanu lub stigmastanu, posiadajacego, w polo- zeniu 17 girupe alkilowa o co najmniiej 8 atomach wegla, przeprowadzane przy uzyciu Mycobacterium sp. NlfcRL B-3806.

Zwiazki o wzorze 1 i o wzorze 2 sa nowe.

Wprawdzie Schubert i in. opisali w 1964 r (Ste- roid!s 4, 5®1—(586) zwiazek o wzorze 1, ale byla to postac z otwartym pierscieniem, czyli 7a-metylo- -perhydroindanodiono-4£-/p-propylol-4/, który po¬ wstal jako produkt posredni rozkladu progesteronu przy uzyciu Myoabaoterium smegmatis.

Zwiazek o wzorze 3, wytwarzany sposobem we¬ dlug wynalazku zosstal opisany w 1963 roku (Wang i Siih Biochem. 2, 1.23(8-^1243), jako produkt posredni rozkladu andirosteno-4-ol-»17p-onlu-3, przy uzyciu szczepu Necardia restrictus.

Sposób wedlug wynalazku polega na stosowaniu do rozkladu! steroidów mutantów zdolnych do se¬ lektywnego' rozkladu steiroidiów ewentualnie za¬ wierajacych w polozeniu 17 alkilowy lancuch bocz¬ ny o 2^10 aitomach wegla i gromadzenia w brze¬ czce fermentacyjnej zwiazku o wzorze 1, czyli he- mnketalu 3aa-H-4a-/3,Hnydroksypropylo/-7afjHmety- -loszesciowodoroindanodionuHl,5, zwiazku o wzorze 2, czyli hemiacetalu 3aa-H-4a-/3,-ihydroksypropy- le/-5awhydTOksy-7ap-^metylosize'sciowcdorodndanonu- -1, zwiazku o wzorze 3, czyli 5-laktonu 3act-H-a-/2'- -karboksyetylo/^5aHhydiroksy-7ap-m doroindanonu-1 oraz zwiazku o wzorze 4, czyli 3aa- ^-^V;3/^ydrc)il^ypropylo/-i5a-nydxoksy-7ap-(me- tyloszeisciowodoroindainonem-l. 106 350106: 3 Mutanty stosowane w sposobie wedlug wynalaz- ku mozna uzyskac z nastepujacych rodzajów drobno¬ ustrojów rozkladajacych sterole, przy uzyciu spo¬ sobów przeprowadzania- mutacjii przedisftawionych w dalszej czesci opisu lufo ipnych sposobów muto- g waaiia dirobnoustrojów: ATtnirobacter, BaciiBus, BTe- vifoacteri!um, Corynebacteriuim, Mycrobacteriuiin, No- cardia, Protaminobacter, Serratia i Streptomyces.

Korzysifcnie stosuje sie rodzaj Mycofoacteriutm.

Przykladowymi szczepami tego rodzaju sa Myco- 10 bacteriuim phlei, Mycobacteriuim smegmatis, Myco¬ bacterium rhodochrous>, Mycobacteriuim miucosum, Mycobacterium fortuitum oraz Mycobacterium bu- tyrkuim. Szczególnie dokladnie opisano sposób we¬ dlug wynalazku prowadzony przy uzyciu nowego 15 mutanta szczepu Mycobacterium fortudltum NIRRiL B-81&8, który stosuje sie do selektywnego rozkla¬ du steroidów ewentualnie zawierajacycH w poloze¬ niu 17 boczny lancuch alkilowy o 2—'10 atomach wegla do zwiazków o wzorze 1, 2, 3 i 4. Przykla- 20 dowymi odpowiednliimi steroidami sa: sitosterole, cholesterol, stigmasterol, kampesterol i tym podob¬ ne steroidy zawierajace w polozemiu 17 alkilowy lancuch boczny o 2^-10 atomach wegla oraz andro- steno-4^dion.H3,17, andirostadieno-l,4-d}ion-3y1.7 dehy- ^ droepiaindrosteron i testesteron. Substraty steroido- we mozna stosowac zarówno w postaci czystej jak i w postaci surowej.

Mutanty charakteryzujace sie zdolnoscia do- se¬ lektywnego rozkladu wymienionych wyzej sterod- w dów oraz do gromadzenia zwiazków o wzorze 1, 2, 3, i 4 w brzeczce fermentacyjnej mozna uzy¬ skac przeprowadzajac mutacje drobnoustrojów, zdolnych do rozkladania steroli, z nastepujacych rodzajów: Antlhrobacter, Bacillus, Brevifoacterium, * Corynabacteriuirn, Mycobacterium, Nocardia, Pro- taiminobacter, Serratia i Streptomyces. Mycofoacte- nium fortuiitum ATCC 684i2, poddaje sie mutacji spo¬ sobem opisanym w dalszej czesci opisu uzyskujac no¬ wy, laboratoryjnie zmutowany drobnoustrój. W kata- *0 logu ATCC z roku 1974 obok hasla ATCC 6842 za¬ mieszczono informacje „J. C. Cruz 2. Goid aifoscess.

Acta Med. Rio>de Janeiro 1:1 (1986). Medium 90 37C". Szczep Myicobaicterium fortuitum ATCC 6842 rozklada sterole nieselektywnie do zwiazków * o niewielkim ciezarze czasteczkowym, na przyklad do dwutlenku wegla i wody. Tak wiec, drobno¬ ustrój ten nie nadaje sie do selektywnego rozkla¬ du steroidów. 50 Mutacja szczepu Mycobacterium fortuitum ATCC 6842, przeprowadzona przy uzyciu nitrozoguanidy- ny daje nowy mutant, który selektywnie rozklada wymienione poprzednio' steroidy z wytworzeniem zwiazków o wzorze L, 2, 3 i 4. Ten zmutowany a drobnoustrój szczepu Mycobacterium fortuitum uzyskal numer rejestru NHHRL B-8128 nadany przez Northern Regional Research Laboratory, Mtiinister- stwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych Ameryki, Peoria, Illinois, Stany Zjednoczone Ameryki, M gdzie mutant ten zdeponowano w trwalej kolekcji.

Na zyczenie, podhodowle tego mutanta latwo uzy¬ skuje sie z wymienionej kolekcji. Zroztuimiale jest, ze dostepnosc hodowli nie stanowi zezwolenia na stosowanie w praktyce sposobu wedlug wynalaz- w 4 ku i uszczuplenie praw patentowych w tym przed¬ miocie grozi wszczeciem postepowania sadowego.

Morfologia i wrazliwosc na leki szczepu- Myco¬ bacterium NRRL B-S128 nie róznia sie od odpo¬ wiednich cech szczepu rodzicielskiego Mycobacte¬ rium fortuitum ATCC 6842. Obydwa omawiane szczepy Mycobacterium fortulittumnie wytwarzaja kwasów tluszczowych, nie wytwarzaja sporów, naleza do rodziny Mycofoaoteriacese rzedu Actimo- mycetales. Zgodnie z klasyfikacja Rumyoma (Ru- nyon E. H., 1959 Med. Clin. North America 43, 273) stanowia miechromogeniczna grupe mycoba¬ cterium IV, to znaczy szczepy te szybko wzrasta¬ ja w niskiej temperaturze, dajac kolonie nieza- barwione na stosunkowo prostych pozywkach.

Szczepy Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 i Mycobacterium fortuiltum NRRL B-ai28, wyraz¬ nie róznia sie dzialaniem na czasteczki steroidów.

Jak opisano wyzej szczep Mycobacteriuim fortui¬ tum ATCC 6-842 rozklada steroidy nieselektywnie, podczas gdy szczep Mycobacteriuim fortuitum MRRL B-8128 rozklada te substancje selektywinie.

Ta wlasciwosc szczepu Mycobacterium fortuitum NRjRL B-&128 czyni ten szczep wysoce uzytecznym.

Mutacje szczepu Mycofoacteriimi^ortuitum ATCC 6842 w celu uzyskania szczepu- Mycobacterium for¬ tuitum NRRL B^8ll2i8 przeprowadza sie przy uzy¬ ciu nitrozoguanidyny.

Sposób przeprowadzenia mutacji szczególowo opisano w dalszej czesci opisu. Jakkolwiek sposo- by przeprowadzenia mutacji sa ogólnie znane, nie¬ znana jest obecnie teoria pozwalajaca, okreslic lub nawet zasugerowac typ mutanta, który ewentual¬ nie mozna uzyskac przy zastosowaniu odpowied¬ niego sposobu przeprowadzenia mutacji. Równiez, chociaz sposób przeprowadzenia mutacjii i prze¬ ksztalcen opisano szczególowo w odniesieniu do szczepu Mycobacterium, zrozumiale jest, ze podob¬ ny lufo równowazny sposób postepowania- mozna stosowac w odniesieniiu do drolbnoiustrojów innych rodzajów, wymienionych w opisie.

Sposób wedlug wynalazku przeprowadza sie za pomoca wzrastajacej hodowli szczepu Mycobacte¬ rium fortuitum NURL B-8128, dodajac do hodowli w czasie inkubacji subistrat steroidowy luib wpro¬ wadzajac suibsitrat steroidowy bezposrednio do- po¬ zywki przed zaszczepieniem. Steroid mozna doda¬ wac pojedynczo lufo w polaczeniiu z innymi steroi¬ dem. Korzystnie* lecz nie wylacznie, stereoid sto¬ suje sie w stezeniu okolo 0,1 do okolo 100 g w li¬ trze hodowli.

Hodowla wzrasta na pozywce wzrostóweji, która jako zródlo wegla zawiera na przyklad, przyswa¬ jalne weglowodory oraz jako zródlo azotu, na przy¬ klad przyswajalne zwiazki azotowe lub substancje bialkopodolbne. Jako zródla wejgla korzystnie sto¬ suje sie glikoze, melase, cukroze, gliceryne, skrobie, skrobie kukurydziana, laktoze, dekstryne, cukier bnu- natoiy i tym podobne. Jako zródla azotu korzyst¬ nie stosuje sie wyciag namokowy kukurydzy, droz¬ dze, autolizowane drozdze browarniane ze stalyimi substancjami uzyskanymi z mleka, make sojowa, make z ziaren bawelny, majke kukurydziana, sub¬ stancje stale uzyskane z mleka, pamkreatynowy wyciag z kazeiny, maczke rybna, gorzelniane sufo-106 350 6 stancje stale, wyciag peptonu zwierzecego, odpado¬ we mieso i kosci, sole. amonowe i tym podobne.

Wytnienioale zaródto azotu manna dowolnie laczyc.

Do pozywki fermentacyjnej nie potrzeba doda¬ wac..v motali w ilosciiach sladowych, na przyklad cyniku, magmezti, mangatnu, kobaltu, zelaza i tym podo^alych, ppmdewiaz. jako skladniki pozyjwki, przed jej wyjafe*wiajniemv stosuje sie wode wodociagowa i nieoczyszczone inne skladniki.

Proces przeksztalcenia przeprowadza sie w cia¬ gu okolo 7)2 godziin do 15 dini. W czasie procesu utrzymuje sie temperature inkubacji w granicach °^37°C, korzystnie 30°C. Zawartosc naczynia, w którym przeprowadza sie przeksztalcenia w ce¬ lu ulatwienia wzrostu drobnoustroju i tym samym zwiekszenie skutecznosci procesu przeksztalcenia, napowietrza sie wyjalowionym powietrzem i wstrza¬ sa. Po zakonczeniu procesu przeksztalcania, oo stwierdza sde za pomoca chrornatogirafii cienkowar¬ stwowej przy uzyciu plytek pokrytych zelem krzemionkowym (E. Merck, Dairmstadt) oraz ukia- etylu i cykloheksanju w stosunku objetosciowym 2:3, przeksztalcone steroidy wyodrebnia sie w zna¬ ny sposób.

Na przyklad brzeczke fermentacyjna po prze¬ ksztalceniu, skladajaca sie z cieczy fermentacyjnej i komórek drobnoustroju moana ekstrahowac or¬ ganicznym rozpuszczalnikiem steroidów nde mie¬ szajacych sie z woda. Jako odpowiednie rozpusz¬ czalniki stosuje sie chlorek metylenu (korzystnie), chloroform, czterochlorek wegla, chlorek etylenu, trójchloroetylen, eter, octan amylu, benzen i tym podobne.

Alternatywnie, ciecz fermentacyjna i komórki drobnousitroju oddziela sie najpierw w anany spo¬ sób, np. przez saczenie lub odwirowanie, po czym ciecz i ciak> stale oddzielnie ekstrahuje sie odcpo- wiednim rozpuszczalnikiem.

Komórki mozna ekstrahowac zarówno rozpusz¬ czalnikiem mieszajacym sie jak i nie mieszajar cym sie z woda. Pozbawiana komórek ciecz fer¬ mentacyjina mozna ekstrahowac rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda.

Ekstrakty mozna saczyc przez warstwe ziemi okrzemkowej i z przesaczu calkowicie oddestylo¬ wac rozpuszczalnik pod zmniejszonyim cisnieniem.

Pozostalosc zawierajaca przeksztalcone stereoidy, rozpuszcza sie nastepnie w 10% roztworze chloro¬ formu w Skellysolve B i poddaje chromatografii na zelu krzemionkowym przy uzyciu jako eluenta Skellysolve B (izomeryczna mieszanina heksanów) oraz jego mieszaniny ze wzrastajaca iloscia octanu etylu. W ten sposób wymywa sie zwiazki o wzo¬ rach 1, 2 i 3. Zwiazek o wiziorze 4 mozina wymy¬ wac na przyklad za pomoca 5% roztworu metanolu w octanie etylu. Krystaliczne produkty uzyskuje sie przy zastosowaniu jako rozpuszczalnika, na przyklad octanu etylu. Przeksztalcone steroidy moana równiez -uzyskac po odparowaniu rozpusz¬ czalnika z roztworów pozostajacych po dekanta- cji.

Zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 4 stosowane sa jako substancje posrednie w chemicznej syntezie uzy¬ tecznych steroidów. Na przyklada wymienione 40 45 50 59 zwiazki mozna przeksztalcac w substancje wyj¬ sciowa stosowana w procesie opisanym w opisie patentowym St. Zjedm. Ameryki nr 3 880 084, do¬ tyczacym -sposobu przeprowadzania totalnej syn¬ tezy uzytecznych l^Hnorsteroiidów. .Takie prze¬ ksztalcenie w substancje wyjsciowe mozna prze¬ prowadzic w znany sposób, na przyklad' przez utlenienie kwasem chromowym w kwasie . octo¬ wym i nastepnie poddanie dzialaniu bezwodnika octowego i ocitaniu sodowego (Biocheim. 2, 1£38— ^1243 oraz J. A. C. S. 85, 2135^2137).

Sposób wedlug wynalazku oraz produkty wy- twoinzone tym sposobem sa blizej odpisane w na¬ stepujacych przykladach. Jesli nie okreslono- ina¬ czej, wszystkie procenty podane w przykladach sa wagowe, a wszystkie stosunki okreslajace skla¬ dy mieszanin rozpuszczalników sa objetosciowe.

Przyklad I. Wytwarzanie mutanta Mycoba- oteriiuim fortuitum NRL B-1828 ze szczepu Mycoba- oterium fortuitum ATCC 6842. a) Mutageneza nitrozoguanidyna. Komórki szczepu Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 poddaje sie wzrostowi w temperaturze 28°C na wyjalowionej pozywce posiewowej o nastepujacym skladzie: Pozywka bulionowa (Di-fco) 8 g/litr BkstTsit drozdzy 1 g/litr Prcpcinian sodowy 0,5 g/litr Woda destylowana do objetosci 1 lif^ra Wartosc pH uzyskanego roztworu doprowadza sie do 71,0 za pomoca 1 n roztworu wodorotlenku sodowego', po ozym calosc wyjalawia sie w temperaturze 121°C w ciagu 20 minut.

Hodowle prowadzi sie do uzyskania gestosci .10 8 komórekAni, komórki oddziela sie przez od¬ wirowanie, po czym przemywa sie je równa oibcje- toscia wyjalowionego 0,1 molowego roztworu cy¬ trynianu sodowego o wartosci pH 5,6. Po prze¬ myciu komórki zawiesza sie w takiej samej ob¬ jetosci buforu- cy.trynianowego, z zawiesiny po¬ biera sie próbke w celu oznaczenia miana (licze¬ nie komórek), po ozym dodaje sie nitrozoguanidy- ne w ilosci wystarczajacej do uzyskania jej kon¬ cowego- stezenia 50 p, g^ml.

Zawiesine komórek, inkuibuje sie w temperatu¬ rze 37|0C w lazni wodnej, w ciagu 30 minut, po¬ nownie pobiera próbke w celu oznaczenia miana, zas pozostalosc wiruje i oddzielone komórki prze¬ mywa równa objetoscia wyjalowionego 0,1 molo¬ wego- roztworu fosforanu potasowego o wartosci pH 7,0. Nastepnie komórki zawiesza sie ponownie w wyjalowionym podlozu o minimalnej zawartosci soli, nie zawierajacym zródla wegla, o nastepuja¬ cym skladzie: NH4NO3 1,0 g/liitr K2HSPO4 0,25 g/iitT MgSC4-7 HgO 0,25 g/litr NaCl 0,005 g/litr FeSC4.7 H^O 0,001 g/litr Woda destylowana do objetosci 1 litra Nastepnie pH zawiesiny doprowadza sie do war¬ tosci 7,0 za pomoca 1 n kwasu solnego, po czym wyjalawia sie w temperaturze 121°C w ciajgiu minut i wylewa sie zawiesine na plyty w celu wybrania komórek zmutowanych.106 350 8 b) Selekcja i izolacja mutanta Mycobacterium fontuttum NIRRL B-8126.

Komórki znuuitowane jak opisano wyzej rozcien¬ cza sie i wysiewa na plyifckach zawierajacych po¬ zywke o nadtejpujjacym skladzie: (modyfikowana pozywka wedlug Firasera i Jerrela 1968, J. Bioi.

OheaiL 205, 291—005): gliceryna 10,0 g/liitor Na«HPC4 8,4 g/liltr KHiP04 4,5 g/liitr NH^Cl 2,0 g/litr NfeS047 H*Q 0,3 g/Mr FeGU.6Hfi 0,05 g/»r Woda destylowana do objetosci 1 liltira.

Do mieszaniny dodaje sie agar w ilosci 15 g/liltr i calosc wyjalawia sie w autoklawie w tamipera- touirze 1S1QC w ciagu 30 minut, po czym wylewa sie na wyjalowione plytki Petriego.

Hodowla na takiej pozywce eliminuje wiekszosc zywieniowych aiuksotrolów wytwarzanych w pro¬ cesie mutagenezy, na przyklad eliminuje sie ho¬ dowle, które wymagaja witamin, czynników wzro¬ stu i innych, celem prowadzenia hodowli W po¬ zywce zdefiniowanej chemk^ie.

Po przeprowadzeniu inkubacji w temperaturze 28°C, w ciagu 7 dni, uzyskane kolonie przenosi sie na plytki testowe odpowiednie dla celów se¬ lekcji irmitanitów, po czym ponownie przenosi na plytkikontrolne zawierajace pozywke przygo¬ towana w oparciu o gliceryne. Plytki testowe przygotowuje sie sposobem opisanym przez Pe- teirsona G, N, H. L. Lewisa i J. R. Davisa w 1962 roku w „Prepairation o£ uniform disgpeirsione of cholesterol and other water —. insolufole carbcn scurces in agar modia" J. Lipid Researcn 3, 275—276.

Na plytkach stosuje sie; pozywke o minimal¬ nej zawartosci soli, taka jak opisana powyzej w punkcie a) przykladu I. Do pozywki tej dodaje sie agair w ilosci 15 g/liltr oraz odpowiednie zródlo wegla., takie jak sjtosterol lub androstendion (AD) w ilosci 1,0 g/litr. Nastepnie uzyskana mie- sznine wyjalawia sie w autoklawie w ciagu 30 minut w temperaturze. 121°C. Wyjalowiona, go ca mieszanie wylewa sie do jalowego mieszalni¬ ka, miesza w ciagu kilku minut i nastepnie wy¬ lewa na wyjalowione plytki Petriego. W opisy¬ wanej metodzie pewna trudnosc stanowi tenden¬ cja pozywki do pienienia sie, która mozna ogra¬ niczyc, mieszajac goraca mieszanine i ogrzewajac plomieni e-m powierzchnie stopionego agaru na plyttce. W ten sposób uzyskuje sie jednorodna za¬ wiesine nierozipuszczalnych w wodzie zródel we¬ gla, która ulaltwia wytwarzanie bardzo jednorod¬ nych lecz opalizujacych plytek agarowych.

Kolonie, które wzrosly na plytkach kontrolnych, lecz nie na plytkach testowych zawierajacych AD jako jedyne ziródlo wegla, oczyszcza sie za pomo¬ ca wysiewu kreskowego na plytkach z pozywka agarowa. Po przeprowadzeniu hodowli w tempe¬ raturze 28°G, poszczególne klony wybiera sie z plytek z pozywka agarowa wyjalowiona lopatka dentystyczna i ponownie testuje za pomoca imotoulowania pokra^kowanych plytek zawieraja¬ cych AD jako zródlo wegla* Oczyszczone izolaty, które nadal wykazjuja imny fonotyp nóz hodowla rodzicielska ocenia sie w kolbach trzesawko- wych. c) Ocena hodowli w kolbaoh traejsawkowyicn^ Kolby trzesawkowe o pojemnosci 500 min napel¬ nia sie 100 ml porcjami pozywka sluzacej do prze¬ prowadzania biologicznego przeksztalcenia, zawie¬ rajacej nastepujace skladniki: gliceryna 10,0 g/litr NaaHPC4 8,4 g/liltr KHyP04 4,5 g/liitr NH^l 2,0 g/litr MgS04.7HjO 0,3 g/Jatr Fe018.6 HjO 0,05 g/liitr Woda destylowana do oibjejtosci 1 litra Z pozywka miesza sie maczke sojowa w ilosci 1 g/liitr, po czym calosc miesza sie z sftosterolem w ilosci 10 g/litr. Nasfcejpnie koHby wyjalawia sie w autoklawie w ciagu 20 manuA w teimiperattuirze 121?C, oziebia do temjpferaftury 28°C i inokuluije ml hodowli posiewowej uzyskanej nastepuja¬ co: Oczyszczone izolaty uzyskane jak opisano wy¬ zej hoduje sie na skosach agarowych w tempe- raturze 28°C. Pobiera sie oczko komórek ze sko¬ su ,i stosuje do inokulacji kolb o pojemnosci 500 ml, zawierajacych wyjalowiona pozywke do hodowli posiewowej o nastepujacym skladzie: Pozywka bulionowa (Difico) 8 g/liitr Esktinait z dnozdzy 1 g^lffltr Glicaryma 5 g/iMlfer Woda destylowana do objetosci 1 litra Wai-tosc pH mieszaniny doprowadza sie do 7,0 za pomoca 1 n roztworu wodorotlenku sodowego i wyjalawia sie mieszanine w autoklawie5 w teim- peratiuirze 121°C w ciagtu 20 minut. Zaszczepione kolby inkuibuje sie w temperaturze 28°C w cia¬ gu 712 godzin.

Jak opisano wyzej, 10 mdhodowli posiewowej 40 stosuj sie do zaszczepienia kandej z kolb o po¬ jemnosci^ 500 ml zawierajacej 1(HT ml wyjalowio¬ nej pozywki sluzacej do przeprowadzania prze¬ ksztalcenia. Kolby te irffeubuje sie w teirupeTatiu- rze 28—30°C i wyitrzasa na wytrzajsatrce obroto- 45 wej, jednoczesnie pobierajac w róznych oktesach czasu próbki hodowli, kazda o pojemnosci 10 ml.

Plrc-blki te ekstrahuje sie wyltrzasagac je trzykrot¬ nie z cMóiTkaetm metyleniu.

Porcje ekstraktów bada sie metoda chroma- 50 togiriaidd cieinkowairstwowej przy uzyciu zelu kirze- mitonkowego oraz ukladu rozpuszczalników opisa¬ nego poprzednio, to znaczy mieszaniny octanu etylu i cykloheksanu w stosunku objetosciowym. 2:3, oraz metoda choromaitogiraiii gazowO-cieczo- 55 wej. Stwierdzenie obecnosci zwiazków o wzorze 1, 2, 3 i 4 potwierdza selektywny rozklad sito- steirolu praeprowadzony przez nowy mutamt wy¬ tworzony z ro/dzicieilsMego szczepu Mycobacte¬ rium forttuirtuip, ATOC 8842.

Przyklad IL Ptrzefesztalcenie sitosterolu w zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 4.

Stosuje sie pozywke taka sama jak w przy¬ kladzie I, w czesci dotyczacej oceny. hodowli w ^ kolbach tirzejsawkowychL Pozywke te wyjalawia 60106 350 1# sie w terniperaturze 12l°C w ciagu 30 minut, na- stejpnde oziebia sie do temperatury 30°C, po czym zaszczepia sie 10 czesciami. hodowli posiewowej mutanta Myicobactenium fortuiitum NRfRiL B-8128, która uzyskuje sie sposobem opisanym w przysia¬ dzie I. Po zaszczepieniu w celu ulatwienia ho¬ dowli glebinowej, mieszanke inkulbuje sie w tem¬ peraturze 30°C w ciagu 336 godtziiin prizy jednocze¬ snym mieszaniu. Po pnzeprowadzeniu inkubacji caJos6 ekstrahuje sie chlorkiem metylenu.

Ekstrakt saczy przez warstwe ziemi okrzemko¬ wej, zas przesacz odparowuje sie do socha pod zmniejszonym cisnieniem.

Pozostalosc rozpuszcza sie w 10% roztworze chdorc&rmu w Skellysolve B i poddaje chroma- togcrafii na zelu kiizemdloinkowyiin, przy uzyciu ja¬ ko eluartu Sk«HysoLve B i jego mieszanin z octa¬ nem etydu o wzrastajacej ilosci octanu etyki.

Mieszaninami tymi elufuje sie zwiazki o wzorze 1, 2 i 3. Zwiazek o wzorze 4 efluuje sie z- kolumny % roztworem metanolu w octanie etylu. Zwiaz¬ ki eLuiuije sie w nastejpuoacej kolejnosci: zwiazek o wzorze 1 ->• zwiazek o wzorze 2 -> zwiazek o wzorze 3 -> zwiazek o wzorze 4. Wymttenione zwiatzki wykazuja nastepujace wartosci Rf na chtromatogramach cienkowarsrtwowych (cykiothek- sain — octan etylu w stosunku 3:2):: zwiazek o wzorze 1 R£ = 0^7) zwiazek o wzorze 2 !Rf = 0,28 zwiazek o wzorze 3 Rf = 04*6 zwiazek o wzorze 4 Rf = 0,05j Sklad odpowiednich frakcji oznacza sie metoda chromatografii cienkowarstwowej, laczy sie firak- . cje o podobnym skladzie-, odparowuje do sucha, otrzymujac z dobra wydajnoscia zwiazki o wzo¬ rach 1, 2, 3 i 4, Po przekrystaMzowamiu z octanu etylu otrzy¬ muje sie zwiazek o wzorze 1, bedacy mieszanina dwóch epimerów w stosunku 1:1, o temperaturze topnienia 100M112oC; zwiazek o wzorze 2 w po¬ staci oleju, zwiazek o wzorze 3 o temperaturze topnienia 122—124°C oraz zwiazek o wzorze 4 o temperaturze topnienda 148M150°C.

Przyklad IIL Postepujac jak w przykla¬ dzie II i stosujac zamiast sitosterolu cholesterol, otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 4.

Przyklad IV. Postepujac jak w przykladzie Id i stosujac zamiast sdtosteroHu stigimasterol, otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 4.

Przyklad V. Postepujac jak w przykladzie II i stosujac zamiast sitosterolu kampesterol, otrzymuje sie zwiazki- o wzorach I, 2, 3 i 4.* Przyklad VI. Postepujac jak w przykladzie II i stosujac zamiast sitosterolu mieszanine aito- sterohi* z którymkolwiek ze steroidów wymienio¬ nych w przykladach H<—V, otrzymiuje sie zwiaz¬ ki o wzorach 1, 2, 3 i 4..

Przyklad VII. Postepujac jak w przykladzieI stosujac zamiast szczepu Mycobacteriuim fortuiltum ATOC 6642 drobnoustrój zdolny do rozkladlu ste¬ roli wybrany sposób (rodzajów: Arthrobacter, Ba- ciflUus, Brevibaeteri)Uin% Corynobacteriuim, Nocar- dia, ProtamSnobaoter, Serratia i Streptomycen, uzyskuje sie mutanty tych drobnoustrojów, oha- rakiteryzujace sie zdotoodcia do selektywnego roo- kladu steroidów, ewentualnie zawierajacych w czasteczce w polozeniu 17 aUriflowy lancuch bocz¬ ny o 2—d0 atomfcch wegla ona zdolnych do gro- madzenia zwiaafltów o wzorach 1, 2, 3 i 4 w brze¬ czce fermentacyjnej.

(Przyklad VIII. Postepujac }ak w przykla- II1—VI i stosujac zamiast mutanta Mycobacterium forfcuiitum NIRRL B-6108 odpowiedni mutant uzy- sikany sposobem opisanym w przykladowe VH, otrzymiuje sie zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 4j Przyklad IX. Postepujac jak w przykla¬ dzie I i stosujac zamiast szczepu Mycobacterium fortuiltum ATCOC 6042 drobnoustrój rozkladajacy sterole wybrany sposród: Mycofcactertuum phlei, Mycobacterium smegmatisy Mycobacterium rhodo- ohrous, Mycobacterium imucosum i Mycobacterium butyricum, otrzymuje sie mutant, który charakte¬ ryzuje sie zdolnoscia do selektywnego rozkladcl steroidów ewenltualnie zawierajacych w czastecz¬ ce w polozeniu 17- alknJowy lancuch boczny o 2—40 atomach wegla i zdolny do gromadzenia zwiazków o wzorach 1, 2, 3 i 4 w brzeczce fer¬ mentacyjnej.

Przyklad! X. Postepujac jak w przykla¬ dach IF—VI i stosujac zamiast mutanta Mycoba¬ cterium fortufttum NRRL 6-8128 odpowiedni mu¬ tant uzyskany jak opisano w przykladzie IX, otrzymanie sie zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 4. ao Przyklad XI. Ro&tejpujac jak w przykla¬ dzie n i stosujac zamiast sitosterolu taki zwia¬ zek jak androsteiKH4-dion^347, androstadieno-il,4^ Hdkm-3,17, dehydroepiandro steron lub testosteron, otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i i Przyklad XII. Postejpujac jak w przykla¬ dzie II i stosujac zamiast sitosteroBu dwa lub wie¬ cej zwiazków takich jak sitosterol, cholesterol, sti<- gmaeterol, androsteno-44dionH3,(r7, androstadieno- -.l,4-dion-l3J17, dehydroeptiandrosteron i testosteron, 46 otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 4.

Przykladi XXII. Postepujac jak w przykla¬ dzie XI i XII i stosujac zamiast mutanta Myco- baeteriium fortuituim NRRL B-8128 odpowiedni mutant, uzyskany jak opisano w przykladne VII, 45 otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 1 Przyklad XIV. Postepujac jak w przykla¬ dzie XI i XXI, stosujac zamiast mutanta Mycoba¬ cterium fortuiitum B^8128 odpowiedni mutant, uzyskany jak opisano w przykladzie IX, otrzymu¬ je sie zwiazki o wzorach 1, 2, 3 i 4j

Claims (12)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania pochodnych 3a-H-7ap- HmetyOoszesciowodoroindanonu-4 o wzorach 1, 2, 3 i 4, znamienny tym, ze hoduje sie Mycobacte¬ rium fortuitum NIRRL B-8128 w pozywce wod¬ nej w warunkach tlenowych, w obecnosci steroidu ewentualnie zawierajacego w polozeniu 17 alkilo¬ wy lancuch boczny o 2^h10 atomach wegfla, i wy¬ odrebnia sie z pozywek wytworzone zwiazki.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie sitosterol, dholesterod, g5 stigmasterol, kampesterol, androsteno-4-dion-3,17, 60106 350 11 12 andrastaddeno- hrb testosteron*

3. Sposób wytwarzania pochodnych Za-^--^^^ Hmcftyloszescdowodoroil^^ o wzorach 1, 2, 3 i 4, znamienny tym, ze hoduge sie Mycofoacte- rium fortuitum NRRL B-8128 w pozywce wodnej w warunkach tlenowych, w obecnosci mieszaniny dwóch lub wiecej steroidów, i wyodrebnia sie z pozywki, wytworzone zwiazki.

4. Sjposób wedlug, zastirz. 3, znamienny tym, ze jiako .skladniki,mieszaniny steroidów stosuje sie so/tosterol, cibdejsteapol, stigaBasterol, kamtpesterol, andlroetenc--4-)dioin,t3i, 17-, .amdrostadienp ^1A e^hydro^piapd^^tercHn lub testosteron, -

5. Sposób wytwarzania pochodnych 3cnH-7ia(l- -^etylosize&cicwade^oWK^ & wzorach 1, 2, 3 i ¦ 4,: znamienny: &», ze hoduje sie mistand; takiego drobnoustroju jaik Arthcobaeltar, BaciiBuis, Rreviba- cteóum, Corynekacl^uim, Nbcardia, Pratairiiinoba- cteir^ SerratLa lub Streptomyces, charakteryizaijacy sie zdolnoscia do selektywnego rozkladu steroidów, ewentualnie zawnarajacych w powozeniu 17 alkilowy lancuch boczny a 2—^10 atomach wegla i do gro¬ madzenia w brzeczce fermentacyjnej hemilkettalu 3aa^-4aV3/nhydro»k3yprc^ylo/-7apHmeityIosze wodoroindanodionu-1,5, hemiacetalu 3aa-H-4a-/3'- . -nydroksyproipyio/-^-nydroksy-7a(l-metyloszescio- wodoroiindanoou 1, S-llaktonu 3aa-H-4 boik:sye*tylo/-6a-thydrroksy-7ap-metyloszescdcwodoro- inclanonu-1 oras 3aa^-to-/3'^ydrc>iksypropylo/- - ^5a-hydroksy-7a^HmeAydo(szescic)wc paszy czym hodowle prowadizi sie w pozywce wod¬ nej w, wariunikach tkino roidy ewentualnie zawiierajacego w polozeniu 17 alkilowy lancuch boczny o 12-rdOatomach wegla, i wyodrebnila sie z pozywki wyitiworzone ziwiajz- ki*, ¦

6. . 6. Sposób wedlug zasto. 5, znamienny tym, ze mutant drobnoustroju hoduge sie w pozywce wod¬ nej w warunkach tlenowych w obecnosci miesza¬ niny dwóch lioib wiiecej steroidów.

7. Sposób wedlug zasitcrz. 5, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie sitoslterol, holesterol, stigmasterol, kairrupesterol!, androsteno^-dion-S^, androstadieno-il,4-dion-i3,l7, denyKJroepiandrosite- ron lub testosteron.

8. Spoisób wedlug zastirz. 6, znamienny tym, ze jako skladniki mieszaniny steroidów stosuje sie 5 takie steroidy jak jsitosterol, cholesterol, stigma- sterol, kam|pesterol, and;rosteno-4-dion^3,(17<, andro- stadiieno--J,4-dioin-3,17l, den^roepianjcBrosteron7 i te¬ stastteron,

9. Sposób wytwarzania pochodnyeh ScHH^afJ-

10. -imetylosize^iowodoroiiindanoinu^l o wzorach 1, 2, 3 i 4, znamienny tym, ze 'hoduje sie mutant My- cobacterium, charakteryzujacy sie zdolnoscia do se¬ lektywnego rozfkladu steroidów, ewentualnie za¬ wierajacych., w polozeniu 17 alkilowy lancuch 15 boczmy o 2—/10 atomach wegla i do' gromadzenia w brzeczce feaTmentacyjnej hemliketalu 3aa-H- -Aa-/3'-ihydroiksyipropylo/-7a{l-metyloszeisciowodoro- indanodionu-1,5, hemiacetalu 3aa-H-4a-/3'-hydro- k syproipylo/-5a-'hydrolksy-7>apnmetyloszesciowodoro- 20 indanonu-d, S^laiktoinu 3aaJH-4a-/2'-(karboksyloety- lo/-^-liydroiksy-7ap-metylo'Szesci!owodoToalndanoinu>- -4 oraz 3a-H-4a^/3'-lhyorciksy1proipylo/^5a-hydiro- ksy-7a|p-metyloszesciowodoroindanonu-l, przy czym hodowle prowadzi sie w pozywce wodnej 2s w warunkach tlenowych, w obecnosci ste¬ roidu, ewentiuatlnlie zawierajacego w polozeniu 17 alkilowy lancuch boczny o 2—<10 atomach weg¬ la, i wyodrebnia sie z, pozywki wytworzone zwiaz¬ ki. ; . , - 30 10. Sjposób wedlug zastrz. 9, znamienny tym, ze hoduje isie imutamt drobnoustroju w pozywce wod¬ nej w warunikach tlenowych, w obecnosci miesza¬ niny dwóch lub wiecej, stereoidów.

11. Sposób wedlug zastrz. 9, znamienny tym, ze ^5 jako steroid stosuje sie sitosterol, cholesterol, sti- gmasterol, kampesteirol, amd'rosteino-4-dioin-3,17, am- drestad(ieriO- lub testosteron.

12. Spoisób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze 40 jako skladniki mtiestzainiiny steroidów stosuje sie takie steroidy jak sito&terol, cholesterol, stigma- sterol, kampesterol, amdro6teno-4-dicin-3,17, andro- stiadieinoHl,4-d,ioin-3yl7, dehydroepiand/rosteron i te¬ stosteron.106 350 "6^ «zór1 HO Wtór3 HO' Ka5r4