CN103756940B - 偶发分枝杆菌及在发酵生产δ-内酯中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株发酵生产雌酚酮和雌二醇及其衍生物的中间体δ-内酯的偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M2013543。采用CCTCC M2013543可将植物甾醇降解为δ-内酯,并将其排除细胞外，积累下来，重量收率可达到32%~39%，可大量累集δ-内酯，并且杂质种类少，生产成本大幅降低。
Description
发明所属领域：
本发明涉及一株生产甾体激素的菌株，具体地说，本发明涉及一株发酵生产雌酚酮和雌二醇及其衍生物的中间体δ-内酯的偶发分枝杆菌株，含有菌株的菌剂及应用。
背景技术：
微生物在甾体化合物转化中的应用已有了大量的研究工作及文献记载。1937年，Mamoli和Vercellone发现，应用细菌发酵就可完成对17-酮类固醇到17β-羟基甾体的转化。接着Peterson与Murray发现，真菌Rhizopus nigricans可在黄体酮的羟基化中起作用（U.S.Pat.No.2602769(1952)）。之后，Kraychy等人在美国专利U.S.Pat.No.3684657(1972)）上公开了分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRLB-3683可选择性切除17-烷基甾体上8个碳原子以上的侧链，从而得到4-AD，ADD以及20α-羟甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮。1973年，Marsheck等人（U.S.Pat.No.3759791）发现4-雄烯-3，17-二酮的产生还有另一条途径，即利用分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRLB-3805对17侧链上含有8个碳原子以上的胆甾烷或豆甾烷进行微生物发酵。
Wang和Sih（Biochem.2:1238-1243,1963.）研究发现，δ-内酯（英文名sitolactone）是局限诺卡菌Nocardia restrictus在对4-雄烯-17β醇-3-酮进行微生物降解过程中产生的中间产物。同年，John C.Knight等在专利U.S.Pat.4042459中阐述了用偶发分枝杆菌株M.fortuitum NRRL B-8128制备δ-内酯的方法，但该方法得到的产物种类过多，杂质多，sitolactone收率低，重量收率仅为4.5%，生产成本高，难产业化。
δ-内酯，英文名sitolactone是合成雌酚酮和雌二醇及其衍生物的重要中间体，但转化过程中甾核A环，B环开环，非常容易降解，产品难以积累，从而难以达到产业化标准。
发明技术内容：
本发明的第一个目的是提供一株偶发分枝杆菌突变株，使用该突变株，可将植物甾醇转化为δ-内酯,且能有效的抑制δ-内酯甾核A环，B环开环，进而抑制了其降解，使δ-内酯得以积累。
本发明的第二个目的是提供一种含有偶发分枝杆菌突变株的液体菌剂。
本发明的第三个目的是提供偶发分枝杆菌突变株及菌剂在发酵生产δ-内酯中的应用。
本发明的第四个目的是提供发酵生产δ-内酯的方法。
本发明公开了一株偶发分枝杆菌（mycobacterium fortuitum）突变株NK-XHX-103，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M2013543，保藏日期是2013年11月04日。
本发明中公开的偶发分枝杆菌（mycobacterium fortuitum）突变株NK-XHX-103，CCTCC M2013543通过如下方式得到:
菌种分离：本发明人在堆积植物甾醇场地附近的土壤中取样，活化后使用含固体蛋白胨培养基划线培养，观察菌落形态，选择菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，显微观察菌体尺寸一般较其他细菌小的菌落再培养，使用液体的蛋白胨培养基在30℃，180rpm培养。
菌种诱导：当菌体密度生长至5×108个/ml，离心，菌体用无菌柠檬酸钠溶液冲洗，并用柠檬钠溶液将菌体稀释到原来的体积，再加入亚硝基胍，菌悬液37℃水浴半小时。再次离心，菌体用磷酸缓冲液冲洗。并重新在磷酸缓冲液中悬浮分散。
菌株筛选：将诱变后的菌悬液进行稀释涂布初筛固体培养基上，于30℃培养7天。挑取单菌落接种到复筛固体培养基中，凡是在复筛培养基中不能生长的菌体，用初筛培养基进行进一步的培养纯化，得到诱变后的菌株。
菌种摇瓶转化：将诱变后的菌株接种到液体种子培养基上，30℃，每分钟180rpm培养72小时,再接种到转化培养基中，接种量20%，在30℃，每分钟220rpm,转化培养72小时，取样送液相检测，根据液相结果确定目标菌株优劣。
经过以上诱变筛选工作，得到一株优秀的变异菌株，将之命名为偶发分枝杆菌（mycobacterium fortuitum）突变株NK-XHX-103，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M2013543，保藏日期是2013年11月04日。
偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103，CCTCC M2013543有如下特征：在不同生长环境下，菌体呈现不同形态，但基本上为杆状，菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，菌体尺寸一般较其他细菌小，通常为长0.7～1.0微米，宽0.3～0.4微米。可将植物甾醇降解为δ-内酯,并将其排除细胞外，积累下来，重量收率可达到32%～39%，达到产业化标准。
本发明的发酵反应如附图1所示。
本发明还公开了含有偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103，CCTCC M2013543的液体菌剂，按重量计，该菌剂的含生物量是0.5％～1％，余量为培养过偶发分枝杆菌突变株的培养基。
本发明还公开了制备偶发分枝杆菌突变株及其菌剂的方法。生产菌剂的方法包括下列步骤：
A斜面种子培养：将CCTCC M2013543接种到固体蛋白胨斜面培养基上，28-32℃培养；
B液体种子培养：从斜面刮取菌体，接种到蛋白胨液体培养基中，28-32℃培养；
C计数：按重量计，含菌生物量是0.5％～1％，余量为培养过CCTCC M2013543的培养基，得液体菌剂；
其中：斜面固体蛋白胨培养基组分是：蛋白胨3-7g/L，牛肉膏1.25-1.75g/L，酵母膏1.25-1.75g/L，葡萄糖3-7g/L，氯化钠3-7g/L，琼脂15-25g/L，余量为水，pH=7.5；
液体蛋白胨培养基组分是：蛋白胨0.25-0.75g/L，牛肉膏0.125-0.175g/L，酵母膏0.125-0.175g/L，葡萄糖0.25-0.75g/L，氯化钠0.25-0.75g/L，余量为水，pH=7.5。
本发明还公开了偶发分枝杆菌突变株及其菌剂在发酵生产δ-内酯中的应用。
本发明还公开了生产δ-内酯的方法，该方法包括下列步骤：
①发酵培养：将液体菌剂接种到转化培养基中培养，接种量为19～21%，转化温度为28～32℃，发酵培养的转速为180-500rpm/min，空气流量为0.18～0.22Nm3/h，罐压0.045～0.055MPa；
②分离提取：用氢氧化钠溶液调节pH为8.9-9.1，搅拌，分层，取水层，加硫酸调节pH为1.9-2.1，用氯仿萃取，浓缩，得δ-内酯；
其中转化培养基组分为：硝酸钠6.3-6.4g/L，磷酸二氢钾0.9-1.1g/L，磷酸二氢钠1.9-2.1g/L，七水硫酸镁0.7-0.9g/L，氯化钾0.1-0.3g/L，葡萄糖5-7g/L，蛋白胨8-12g/L，大豆油12%，植物甾醇2%，营养液Ⅰ0.8-1.2ml，营养液Ⅱ0.8-1.2ml，余量为水；
在本发明中，植物甾醇是玉米甾醇、大豆甾醇、木甾醇或菜籽甾醇中的一种或多种；
在本发明中，营养液Ⅰ组份为：硫酸锌10-12g/L，硫酸镁11-13g/L，氯化钙0.2-0.4g/L，氯化镍0.1-0.3g/L，硫酸铜0.03-0.05g/L，硼酸0.02-0.04g/L，碘化钾0.005-0.015g/L，余量为水；
营养液Ⅱ组份为：氯化铁0.8-1.2g/L，EDTA3-7g/L，余量为水。
在本发明中，δ-内酯是合成雌酚酮和雌二醇及其衍生物的重要中间体，英文名sitolactone，CAS号：64053-02-7。CAS是ChemicalAbstracts Service，美国化学文摘服务社，美国化学会（AmericanChemical Society）下属组织。CAS号是美化学文摘社为每一种出现在文献中的物质分配一个的号码。在本发明中，δ-内酯就是sitolactone，sitolactone就是δ-内酯。
本发明中涉及的微生物菌种，偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103，（mycobacterium fortuitum NK-XHX-103）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M2013543，保藏日期是2013年11月04日。菌种处于专利保护状态，研究者可从保藏机构索取，中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctccwhu.edu.cn。
对比菌株M.fortuitum NRRL B-8128保藏于美国农业研究菌种保藏中心NRRL(Agricultural Research Service CultureCollection)，位于伊利诺伊州皮契里亚，菌种处于公开状态，研究者可从保藏机构索取。
本发明与现有技术相比，有下列优点：
1.本发明利用油水两相体系，使用偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103，CCTCC M2013543成功将植物甾醇转化为δ-内酯,有效的抑制了δ-内酯中甾核A环，B环开环，进而抑制了其降解，使产品得以积累，提高了收率，重量收率可达到32%～39%。
2.偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103与菌株M.fortuitum NRRLB-8128比不仅可将植物甾醇降解为δ-内酯,并排除细胞外，积累下来，转化过程中主要产物是δ-内酯,其他杂质种类少，量少，产品收率相对较高，相较M.fortuitum NRRL B-8128在制备sitolactone的重量收率提升8.56倍。
3.生产成本降低:偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103转化过程中主要产物是δ-内酯,生产成本为:460～560元/kg，与菌株M.fortuitumNRRL B-8128发酵相比，降低生产成本6.7倍。
附图说明
图1是生物发酵反应示意图
A表示植物植物甾醇，B表示δ-内酯
图2是发酵产物的高效液相色谱图
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1.偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103的筛选与获得
1.1菌种分离：在本工厂堆积植物甾醇场地附近的土壤中取样，活化后使用含固体蛋白胨培养基划线培养，观察菌落形态，选择菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，显微观察菌体尺寸一般较其他细菌小的菌落。将挑选合格菌落使用液体的蛋白胨培养基在30℃培养，转速每分钟是180rpm下培养。
固体蛋白胨培养基配方及配制方法：
蛋白胨3g/L，牛肉膏1.25g/L，酵母膏1.25g/L，葡萄糖7g/L，氯化钠3g/L，分别称量以上物质，加入蒸馏水中，搅拌溶解，pH值用10%氢氧化钠溶液调至7.5，加入2%琼脂粉，加热溶清，如制备斜面，溶清后分装到试管中，121℃灭菌30分钟，冷却到80℃，摆放斜面或倒平板，冷却到室温，30℃培养48小时，无菌落出现则可用。
液体蛋白胨培养基配方及配制方法：蛋白胨0.75g/L，牛肉膏0.175g/L，酵母膏0.125g/L，葡萄糖0.75g/L，氯化钠0.75g/L，pH值用10%氢氧化钠溶液调至7.5，用水定容至1升，121℃灭菌30分钟。
1.2菌体诱变：当菌体密度生长至5×108个/ml，离心，菌体用pH=5.6，0.1mol/L无菌柠檬酸钠溶液冲洗，并用柠檬钠溶液将菌体稀释到原来的体积，再加入亚硝基胍，亚硝基胍浓度是60μg/m，菌悬液在37℃水浴半小时。再次离心，菌体用等量的0.1mol/L，pH=7的磷酸缓冲液冲洗，菌体重新在0.1mol/L，pH=7的磷酸缓冲液中悬浮分散。
1.3菌株筛选:将诱变后的菌悬液进行稀释涂布，培养基采用初筛培养基，于30℃培养7天。挑取单菌落接种到复筛培养基中，凡是在复筛培养基中不能生长的菌体，用初筛培养基进行进一步的培养纯化，得到诱变后的菌株。
初筛培养基配方及配置方法是：葡萄糖1%,磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钾0.4%，七水硫酸镁0.03%，七水硫酸亚铁0.005%，琼脂2%，pH=7.5.培养基121℃灭30min。
复筛培养基配方及配置方法是:δ-内酯0.2%,磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钾0.4%，七水硫酸镁0.03%，七水硫酸亚铁0.005%，琼脂2%，pH=7.5。培养基121℃灭30min。
1.4菌种摇瓶转化测试:将诱变后的菌株接种到液体种子培养基上，30℃，180rpm/min培养72小时,再接种到转化培养基中，接种量20%，在30℃，220rpm/min,转化培养72小时，取样送液相检测，根据液相结果确定目标菌株优劣。
液体种子培养基配方及配置方法是：葡萄糖1%，酵母膏0.6%，磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钾0.4%，七水硫酸镁0.03%，七水硫酸亚铁0.005%，pH=7.5.培养基121℃灭30min。
转化培养基配方及配置方法：硝酸钠6.4g/L，磷酸二氢钾0.9g/L，磷酸二氢钠1.9g/L，七水硫酸镁0.9g/L，氯化钾0.3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨8g/L，大豆油12%，粉末状β-环糊精2%，植物甾醇0.5%，营养液Ⅰ0.8-1.2ml，营养液Ⅱ0.8-1.2ml，余量为水；
经过以上诱变筛选工作，得到一株优秀的变异菌株，将之命名为偶发分枝杆菌（mycobacterium fortuitum）突变株NK-XHX-103，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M2013543，保藏日期是2013年11月4日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctccwhu.edu.cn。
偶发分枝杆菌（mycobacterium fortuitum）突变株NK-XHX-103，CCTCC M2013543有如下特征：在不同生长环境下，菌体呈现不同形态，但基本上为杆状，菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，菌体尺寸一般较其他细菌小，通常为长0.7-1.0微米，宽0.3-0.4微米。可将植物甾醇降解为sitolactone,并将其排除细胞外，积累下来。
实施例2.偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103及菌剂制备方法
2.1斜面培养基的配制：
| 组分 | 用量 |
| 蛋白胨 | 5g/L |
| 牛肉膏 | 1.5g/L |
| 酵母膏 | 1.5g/L |
| 葡萄糖 | 5g/L |
| 氯化钠 | 5g/L |
| 琼脂 | 20g/L |
将以上物质按比例加入到蒸馏水中，调整pH=7.5，混匀分别加入试管中，加入量约为试管的20%，然后塞好棉塞，于121℃灭菌30min，灭菌后平放斜面，待培养基冷却凝固，再放置24小时。
2.2液体种子培养基的配制：
| 组分 | 用量 |
| 蛋白胨 | 0.5g/L |
| 牛肉膏 | 0.15g/L |
| 酵母膏 | 0.15g/L |
| 葡萄糖 | 0.5g/L |
| 氯化钠 | 0.5g/L |
将以上物质按比例加入到蒸馏水中，pH=7.5，121℃灭菌30min，冷却到室温。
2.3将偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103接种到斜面培养基，于30℃培养5～7天。从斜面刮取菌体接种，接种到液体种子培养基上，在30℃，180rpm/min培养2天，得液体菌剂。
2.4取样计数，按生物量测定方法测菌种含量，按重量计，该菌剂的含生物量约0.5％～1％，余量为培养过偶发分枝杆菌突变株的培养基。
生物量测定方法：取100毫升样品，抽滤，滤渣刮下，放置在滤纸上将培养基吸干，称重，结果如下。
| 实验序号 | 生物量 | 余量 |
| 20120806 | 0.50% | 培养基 |
| 20120807 | 0.70% | 培养基 |
| 20120808 | 1.0% | 培养基 |
实施例3.偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103菌株及液体菌剂的应用
3.1HPLC检测方法
（1）制样
取发酵液1毫升，用硫酸调pH至2.0，用二氯甲烷萃取三次，每次用2毫升二氯甲烷，合并有机层，40℃烘干。
（2）液相条件
将样品用10毫升甲醇超声溶解，过滤，进样20微升，波长：204nm，流动相：50%甲醇。
外标：准确称取0.01克标准品，用甲醇溶解，定容到50毫升，进样20微升，波长：205nm，流动相：20%乙腈水溶液，流速：1ml/min。
（3）收率=(标重量÷标面积÷标稀释倍数)×（样品稀释倍数×样品面积）×发酵液总体积÷底物重量。
3.2发酵底物采用菜籽甾醇
A发酵培养：将上述液体菌剂接种到灭菌后的转化培养基中培养，接种量为20%，转化温度为30℃，转化时间为72小时，转速为200rpm，转化培养基配方为硝酸钠6.37g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸二氢钠2g/L，七水硫酸镁0.8g/L，氯化钾0.2g/L，葡萄糖6g/L，蛋白胨10g/L，大豆油12%，外标含量92%的菜籽甾醇2%，营养液Ⅰ1ml，营养液Ⅱ1ml，余量为水。
其中营养液Ⅰ组份为：硫酸锌11g/L，硫酸镁12g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镍0.2g/L，硫酸铜0.04g/L，硼酸0.03g/L，碘化钾0.01g/L，余量为水。
其中营养液Ⅱ组份为：氯化铁1g/L，EDTA5g/L，余量为水。
B分离提取：取样，簿层色谱（TLC）点板检测，转化完全，用氢氧化钠溶液调pH=9，充分振荡混匀，分层，取水层，加硫酸酸化至pH=2，用氯仿萃取3次，每次用1体积的氯仿。将氯仿层浓缩干，送液相检测，HPLC数据：样品峰面积13972998,标样峰面积5421190，根据液相结果计算，sitolactone重量收率33.4%。
3.3发酵底物采用玉米甾醇
A发酵培养：将液体菌剂接种到灭菌后的转化培养基中培养，接种量为20%，于30℃，180rpm/min转化，转化48小时，体系乳化，转化72小时，取样。转化培养基配方为硝酸钠6.32g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸二氢钠2.1g/L，七水硫酸镁0.9g/L，氯化钾0.2g/L，葡萄糖6g/L，蛋白胨10g/L，大豆油12%，外标含量95%的玉米甾醇2%，营养液Ⅰ1.1ml，营养液Ⅱ1.1ml，余量为水。
其中营养液Ⅰ组份为：硫酸锌12g/L，硫酸镁11g/L，氯化钙0.4g/L，氯化镍0.3g/L，硫酸铜0.05g/L，硼酸0.03g/L，碘化钾0.01g/L,余量为水。
营养液Ⅱ组份为：氯化铁1.1g/L，EDTA6g/L,余量为水。
B分离提取：取样，簿层色谱（TLC）点板检测，转化完全，用氢氧化钠溶液调pH=9，充分振荡混匀，分层，取水层，加硫酸酸化至pH=2，用氯仿萃取3次，每次用1体积的氯仿。将氯仿层浓缩干，送液相检测，结果如图2所示，根据液相结果计算，sitolactone重量收率39.0%。
3.4发酵底物采用大豆甾醇
A发酵培养：将液体菌剂接种到灭菌后的转化培养基中培养，接种量为21%，于30℃，200rpm/min转化，转化72小时。转化培养基配方为硝酸钠6.39g/L，磷酸二氢钾0.9g/L，磷酸二氢钠2g/L，七水硫酸镁0.9g/L，氯化钾0.2g/L，葡萄糖6g/L，蛋白胨11g/L，大豆油12%，大豆甾醇2%（外标含量95%），营养液Ⅰ0.9ml，营养液Ⅱ0.9ml，余量为水。
其中营养液Ⅰ组份为：硫酸锌11g/L，硫酸镁12g/L，氯化钙0.4g/L，氯化镍0.3g/L，硫酸铜0.05g/L，硼酸0.03g/L，碘化钾0.01g/L，余量为水。
营养液Ⅱ组份为：氯化铁1g/L，EDTA6g/L，余量为水。
B分离提取：取样，簿层色谱（TLC）点板检测，转化完全，用氢氧化钠溶液调pH=9，充分振荡混匀，分层，取水层，加硫酸酸化至pH=2，用氯仿萃取3次，每次用1体积的氯仿。将氯仿层浓缩干，送液相检测，根据液相结果计算，sitolactone重量收率35.6%。
3.5发酵底物采用木甾醇
A发酵培养：将液体菌剂接种到灭菌后的转化培养基中培养，接种量为21%，于30℃，200rpm/min转化，转化72小时。转化培养基配方为硝酸钠6.35g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸二氢钠2g/L，七水硫酸镁0.9g/L，氯化钾0.2g/L，葡萄糖6g/L，蛋白胨11g/L，大豆油12%，木甾醇2%（外标含量93%），营养液Ⅰ1ml，营养液Ⅱ1ml，余量为水。
其中营养液Ⅰ组份为：硫酸锌11g/L，硫酸镁12g/L，氯化钙0.4g/L，氯化镍0.3g/L，硫酸铜0.05g/L，硼酸0.03g/L，碘化钾0.01g/L，余量为水。
营养液Ⅱ组份为：氯化铁1g/L，EDTA5g/L，余量为水。
B分离提取：取样，簿层色谱（TLC）点板检测，转化完全，用氢氧化钠溶液调pH=9，充分振荡混匀，分层，取水层，加硫酸酸化至pH=2，用氯仿萃取3次，每次用1体积的氯仿。将氯仿层浓缩干，送液相检测，根据液相结果计算，sitolactone重量收率32.0%。
3.610L罐转化
A发酵培养：将液体菌剂接种到灭菌后的转化培养基中，接种量为20%，转化温度为30℃，用无菌水定容至7升，空气流量0.2Nm3/h，罐压0.05MPa，搅拌转速400rpm/min，转化64小时。转化培养基配方为硝酸钠6.37g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸二氢钠2g/L，七水硫酸镁0.8g/L，氯化钾0.2g/L，葡萄糖6g/L，蛋白胨10g/L，大豆油12%，大豆甾醇2%（外标含量95%），营养液Ⅰ1ml，营养液Ⅱ1ml，余量为水。
其中营养液Ⅰ组份为：硫酸锌11g/L，硫酸镁12g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镍0.2g/L，硫酸铜0.04g/L，硼酸0.03g/L，碘化钾0.01g/L,余量为水。
营养液Ⅱ组份为：氯化铁1g/L，EDTA5g/L,余量为水。
B分离提取：取样，簿层色谱（TLC）点板检测，转化完全，用氢氧化钠溶液调pH=9，充分振荡混匀，分层，取水层，加硫酸酸化至pH=2，用氯仿萃取3次，每次用1体积的氯仿。将氯仿层浓缩干，送液相检测，根据液相结果计算，sitolactone重量收率34.1%。
实施例4偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103与NRRL-8128发酵效果比较
4.1斜面培养：将偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103与M.fortuitum NRRL B-8128分别接种到斜面培养基，于30℃培养6天。斜面培养基的配方及配置方法为：蛋白胨5g/L，牛肉膏1.5g/L，酵母膏1.5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，将以上物质按比例加入到蒸馏水中，调整pH=7.5，混匀加入试管中，加入量约为试管的20%，然后塞好棉塞，于121℃灭菌30min，灭菌后平放斜面，待培养基冷却凝固，再放置24小时。
4.2液体种子培养：从上述斜面分别刮取NK-XHX-103与M.fortuitum NRRL B-8128菌体接种，接种到液体种子培养基上，在30℃，180rpm/min培养2天。液体种子培养基的配方及配置方法为：蛋白胨0.5g/L，牛肉膏0.15g/L，酵母膏0.15g/L，葡萄糖0.5g/L，氯化钠0.5g/L，将以上物质按比例加入到蒸馏水中，pH=7.5，121℃灭菌30min，冷却到室温。
4.3发酵培养：从上述液体种子中接种20%入转化培养基，于180rpm/min，30℃培养3天。转化培养基的配方及配置方法为：硝酸钠6.37g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸二氢钠2g/L，七水硫酸镁0.8g/L，氯化钾0.2g/L，葡萄糖6g/L，蛋白胨10g/L，大豆油12%，玉米甾醇2%（外标含量95%），营养液Ⅰ1ml，营养液Ⅱ1ml，余量为水。其中营养液Ⅰ组份为：硫酸锌11g/L，硫酸镁12g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镍0.2g/L，硫酸铜0.04g/L，硼酸0.03g/L，碘化钾0.01g/L，余量为水。
营养液Ⅱ组份为：氯化铁1g/L，EDTA5g/L，余量为水。
将以上物质按比例加入到蒸馏水中，于121℃灭菌30分钟，冷却至室温，
4.4分离提取：取样，簿层色谱（TLC）点板检测，转化完全，用氢氧化钠溶液调pH=9，充分振荡混匀，分层，取水层，加硫酸酸化至pH=2，用氯仿萃取3次，每次用1体积的氯仿。将氯仿层浓缩干，得到偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103与M.fortuitum NRRLB-8128发酵产物。
4.5检测及对比分析：分别取样，用HPLC检测偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103与M.fortuitum NRRL B-8128发酵得到的产物及杂质比例，见表1。其中由M.fortuitum NRRL B-8128发酵获得的产物种类较多，sitolactone非主产物，产生的sitolactone归一含量10.9%，根据样品峰面积按照外标法计算，其重量收率为4.5%；而通过NK-XHX-103发酵获得的产物种类较少，主要产物为sitolactone，产生的sitolactone归一含量为75.2%，根据样品峰面积按照外标法计算，其重量收率为38.5%。由此可见，本发明的偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103与偶发分枝杆菌M.fortuitum NRRL B-8128相比，在制备sitolactone的重量收率提升8.56倍。
表1
4.6成本对比分析：
根据上表的数据，按照上述发酵工艺，植物甾醇投料量2%，偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103转化过程中主要产物是δ-内酯,其重量收率可达到32%～39%，成本在460～560元/kg。采用M.fortuitumNRRL B-8128不能形成产物的有效积累，即使假设其积累水平与NK-XHX-103一致，其主产物产量仅为前者的0.15倍，成本在3069～3740元/kg。偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103与菌株M.fortuitum NRRL B-8128制备δ-内酯，生产成本减少6.7倍。
Claims (5)
1.一株偶发分枝杆菌（mycobacterium fortuitum）突变株NK-XHX-103，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M2013543。
2.一种含有权利要求1所述突变株的液体菌剂，按重量计，该菌剂含生物量是0.5％～1％，余量为培养过保藏号为CCTCC M2013543的菌株的培养基。
3.一种制备权利要求2所述液体菌剂的方法，该方法包括下列步骤：
A 斜面种子培养：将保藏号为CCTCC M2013543的菌株接种到固体蛋白胨斜面培养基上，28-32℃培养；
B液体种子培养：从斜面刮取菌体，接种到蛋白胨液体培养基中，28-32℃培养；
C 计数：按重量计，含菌生物量是0.5％～1％，余量为培养过保藏号为CCTCC M2013543的菌株的培养基，得液体菌剂；
其中：斜面固体蛋白胨培养基组分是：蛋白胨3-7 g/L，牛肉膏1.25-1.75g/L，酵母膏1.25-1.75 g/L，葡萄糖3-7g/L，氯化钠3-7g/L，琼脂15-25g/L，余量为水，pH=7.5；
液体蛋白胨培养基组分是：蛋白胨0.25-0.75 g/L，牛肉膏0.125 -0.175g/L，酵母膏0.125 -0.175 g/L，葡萄糖0.25-0.75g/L，氯化钠0.25-0.75 g/L，余量为水，pH=7.5。
4.权利要求1所述的突变株在发酵生产δ-内酯中的应用。
5.权利要求2所述的菌剂在发酵生产δ-内酯中的应用。
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