CN102965288A - 一株生物合成3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，涉及一株高效转化去氢表雄酮的赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1及其应用，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4903。赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1能转化去氢表雄酮为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮，在底物投料量为5.0g/L的条件下，底物转化率高达90%左右，产物得率80%左右，对生物转化法生产甾体药物有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1及其转化去氢表雄酮为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法。
背景技术
优思明是一款由雌激素与孕激素复合而成的复方短效口服避孕药，含有的主要成分屈螺酮可以有效对抗口服避孕药中雌激素所引起的发胖的问题。3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮则是生产屈螺酮的重要医药中间体，其生产方式主要有传统的化学合成法、半合成法、生物转化法三类。生物转化法一般通过微生物转化羟化去氢表雄酮（DHEA）生成3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮，相比于化学方法减少了合成步骤、降低了能耗，并大幅削减了污染物的排放，属于先进的清洁生产工艺路线。
目前，据报道有刺盘胞属（Colletotrichum）、镰刀菌属（Fusarium）、支顶孢属（Acremonium）以及黑孢子菌属（Nigrospora）有7α和15α羟化能力，能将去氢表雄酮转化为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮，但是普遍转化率不高，只有40~70%，且底物投料浓度较低，一般为1~5g/L，工业成本较高。因此，自主筛选出一株能高效转化DHEA生成3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮有很高的工业价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高效转化DHEA的赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1，以及利用该菌株转化DHEA为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，可达到高底物投料浓度、高产物得率的要求，并且菌种生长周期也较短。
本发明的发明人从本实验室的菌种保藏库筛选获得一株赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1，该菌于2011年5月24日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4903。
应用上述微生物转化DHEA生产3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，其步骤如下：
（1）采用保藏号为CGMCC No.4903的赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液划线于PDA培养基上培养3~6天；
（2）制备CA3-1菌株的种子液：挑取步骤（1）的PDA固体培养基上的CA3-1菌株一环，接种于已灭菌的装有80~100mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，培养温度为25~35℃，置摇床上以150~250 r/min的转速培养12~20h至对数生长中后期，即得到CA3-1菌株的种子培养液；
（3）菌体培养：将步骤（2）中制备好的细胞液体培养物以4~8%（v/v）的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20~60 mL发酵培养基，培养温度为25~32℃，在150~220 r/min的转速下培养20~24 h，得菌体培养液。
（4）生物转化：精确称取适量DHEA，投入步骤（3）中的菌体液，使其终浓度为5-8 g/L，在转化温度26~30℃，200~220 r/min的转速下转化36~60h，即得转化液。
（5）产物检测：将步骤（4）的转化液等体积乙酸乙酯抽提3次，合并抽提液后于离心浓缩仪中离心至有白色晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22 μm的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析DHEA和3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的含量。HPLC条件为色谱仪：戴安 Ultimate 3000；色谱柱：C18柱；检测器：Ultimate 3000 variable wavelength detector；流动相： 乙腈：水=70:30；流速：0.5mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃。
其中步骤（1）中所述的PDA培养基的成分及配比为：土豆 200~500 g/L；葡萄糖30~50 g/L；酵母粉5~10 g/L；琼脂粉15~20 g/L；pH自然，在121℃高压蒸汽下灭菌20min；步骤（2）所述种子培养基的成分及配比为：葡萄糖20~50 g/L；NaCl 1~5 g/L；酵母粉10~30g/L；K2HPO4 0.1~5.0 g/L；FeSO47 H2O 0.01~0.1g/L；灭菌前调培养基的pH至 6.5-7.5，在121℃高压蒸汽下灭菌20min；步骤（3）所述转化培养基的成分及配比为：葡萄糖20~50 g/L；酵母粉10~30g/L；NaCl 0.2~2 g/L；K2HPO4 0.1~1.0 g/L；FeSO47 H2O 0.01~0.10 g/L；pH 6.5-7.5，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。
本发明所述的赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1菌株首次发现可转化DHEA生成3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮，并且能达到高底物投料量、高底物转化率、高产物得率的要求，是一株极具开发研究价值的生产菌株。
附图说明
图1 为去氢表雄酮在本发明赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1菌体培养液中转化的高效液相色谱图。
图2为本发明的赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1在发酵培养基中转化DHEA的过程研究。
具体实施方式
实施例1 菌种的活化以及筛选。
将实验室-80℃保存的菌种甘油管，加入到10mL的种子培养基进行活化培养。再转接到种子培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装30 mL培养2天得种子液。分别以4%接种量接种于发酵培养基中，装液量为250 mL锥形瓶中装30 mL，30℃，220 r/min培养24小时。准确称取3g/L的DHEA投入到菌体培养液中，相同条件下转化60小时。提取转化液，HPLC分析。结果表明只有赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1对DHEA有转化能力，且能生成产物3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮。
实施例2 赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1转化DHEA 。
（1）将接种菌种的PDA斜面置于30℃的恒温培养箱中，培养4天，得到成熟的孢子，用接种环挑一环菌丝接种于装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，在28℃，220rpm摇床上培养1天，得到适于接种的种子培养液；
（2）将种子培养液以4%的接种量接入装有30mL发酵培养基的250mL的摇瓶中，以相同条件继续培养20小时，得到菌体发酵液；
（3）将去氢表雄酮投入到菌体发酵液中，投料浓度为3.0g/L，相同条件下转化60小时放瓶。提取产物进行HPLC分析，得到转化率为90.08%。
实施例3：
(1) 斜面培养、种子培养以及发酵培养同实施例1。
（2）将去氢表雄酮投入到菌体发酵液中，投料浓度为5.0g/L，相同条件下转化60小时放瓶。提取产物进行HPLC分析，得到转化率为84.08%。
实施例4：
(1) 斜面培养、种子培养以及发酵培养同实施例1。
（2）将去氢表雄酮投入到菌体发酵液中，投料浓度为8.0g/L，相同条件下转化60小时放瓶。提取产物进行HPLC分析，得到转化率为68.23%。
Claims (2)
1.一株高效转化去氢表雄酮生成3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的菌株，该菌株为赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4903，保藏日期为2011年5月24日。
2.利用赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1转化去氢表雄酮为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，其特征为：
（1）将赤霉菌作为生产菌种从斜面上接入到种子培养基中，25~35℃，150~250 r/min培养12~20h，得到种子液；种子培养基组成是葡萄糖20~50 g/L；NaCl 1~5 g/L；酵母粉10~30g/L；K2HPO4 0.1~5.0 g/L；FeSO4·7 H2O 0.01~0.1g/L；灭菌前调培养基的pH至 6.5~7.5，在121℃高压蒸汽下灭菌20min；
（2）将种子以4~8%（v/v）的接种量接入转化培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20~60 mL发酵培养基，培养温度为25~32℃，在150~220 r/min的转速下培养20~24 h，得菌体培养液；发酵培养基组成为葡萄糖20~50 g/L；酵母粉10~30g/L；NaCl 0.2~2 g/L；K2HPO4 0.1~1.0 g/L；FeSO4·7 H2O 0.01~0.10 g/L；pH 6.5-7.5，121℃高压蒸汽下灭菌20 min；
（3）称取一定量的去氢表雄酮加入到菌体培养液中转化36~60h，得到转化液。
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