CN101182565A - 7α,15α-二羟基雄烯醇酮的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种7α，15α－二羟基雄烯醇酮的提取纯化方法，所述7α，15α－二羟基雄烯醇酮由去氢表雄酮经亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini AS 3.4486)生物转化而得，转化结束后，离心发酵液，用非极性有机溶剂萃取上清液，其特征在于，该方法包括离心后所得的菌体先用亲水性有机溶剂提取，再用非极性有机溶剂萃取的步骤。采用本方法进行提取纯化，产物的收率可达到将近90％，由去氢表雄酮转化制备I的总收率可达到75％，从而有效地提高了去氢表雄酮转化合成I的总收率，降低I的生成成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种从发酵液中提取纯化生物转化产物的方法，具体地说，涉及从已将底物去氢表雄酮转化为产物7α，15α-二羟基雄烯醇酮的发酵液中有效提取并纯化产物的方法。
背景技术
甾体类中间体往往可用于生产临床上各种药物。7α，15α-二羟基雄烯醇酮及其类似物(其结构如下式I)
是一种重要的甾体中间体，可用于合成内酯类醛固酮受体拮抗剂、利尿剂和妇科药物等多种药物。例如，I是合成口服避孕药Yasmin活性成分屈螺酮的重要中间体。
微生物转化在甾体药物的合成中具有重要地位，几种重要的甾体微生物转化反应如羟化、脱氢和边链降解已成为工业上生产甾体激素及其类似物的重要方法。化合物I的制备很难用化学的方法合成，目前主要由微生物转化合成。
Michael(WO2004070048，2004-08-19)等报道了黄色镰孢(Fusariumculmorum UC16069)可将去氢表雄酮转化为I，转化后菌体用80％的丙酮水溶液进行提取两次，然后加热减压去除丙酮后，过滤得到粗品，粗品溶于甲醇后用活性炭脱色，然后加热减压除去甲醇后用乙酸丁酯结晶，最后的总收率低，只有46.7％。尚珂等(中国医学生物技术应用杂志.2，30～34，2004)报道亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini AS 3.4486)可将去氢表雄酮转化为I，转化完成后用乙酸乙酯萃取，加热减压浓缩得到粗品，然后粗品用4-甲基戊-2-酮溶解，溶解后加热减压浓缩结晶得到粗纯品，重结晶一次得到纯品，最后的总收率也比较低，大约为58.8％。由此可见现有的提取方法不能有效地将产物提取。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种从已将底物去氢表雄酮转化为产物7α，15α-二羟基雄烯醇酮的发酵液中有效提取并纯化产物的方法。
因此，本发明提供一种7α，15α-二羟基雄烯醇酮的提取纯化方法，所述7α，15α-二羟基雄烯醇酮由去氢表雄酮经亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini AS3.4486)(中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号AS 3.4486)生物转化而得，转化结束后，离心发酵液，用非极性有机溶剂萃取上清液，其特征在于，该方法包括转化结束后发酵液中的菌体先用亲水性有机溶剂提取，再用非极性有机溶剂萃取的步骤。
本发明方法的具体步骤如下：
a)转化结束后离心发酵液，上清液用非极性有机溶剂萃取，菌体则用亲水性有机溶剂提取；
b)菌体提取后得到的溶液加热减压蒸去溶液中的有机溶剂后，再用非极性有机溶剂萃取；
c)将所有的非极性有机溶剂萃取液合并，去水，蒸馏除去有机溶剂，结晶两次即可得到高纯度的产物。
所述的非极性有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲烷、乙酸丙酯、丙酸乙酯或丙酸甲酯，优选乙酸乙酯。
所述的亲水性有机溶剂为醇溶液或酮溶液，用量为发酵液体积的至少0.5倍，提取次数为至少2次；优选的醇溶液为甲醇或乙醇，甲醇的浓度为80％～100％，优选90％；乙醇的浓度为85％～100％，优选90％；优选的酮溶液为丙酮，丙酮的浓度为85％～100％，优选95％。
一般而言，高浓度的甲醇、乙醇或丙酮溶液都可以有效地提取产物，而浓度降到一定值以下时提取效率明显下降。以下是不同浓度甲醇、乙醇或丙酮溶液的提取效率实验。
将底物投料浓度为8g/L，转化率为86.1％的3L发酵液分成15等份分别离心，得到的菌体分别用80％、85％、90％、95％和100％的甲醇、乙醇和丙酮溶液进行提取两次。第一次用量200ml，第二次用量150ml，两次提取的溶液混合均匀后取少量进行HPLC含量分析。结果见图1，由图可见90％、95％和100％的丙酮都可以有效地将I从菌体中提取出来，而以95％为最佳；85％、90％、95％、100％的甲醇或乙醇溶液都可有效的将I从菌体中提取出来，而以90％为最佳，总体而言，以95％的丙酮溶液为最佳。
从以下的实验可以说明此方法的优越性。
底物投料浓度为8g/L，转化率为86.4％的2.5L发酵液分成5等份分别离心，然后分别采用不同的提取方法提取，具体方法如下，其中方法a和b为现有技术。
a发酵液离心，上清液用500ml的乙酸乙酯提取一次，菌体先后用1.5L和1L的乙酸乙酯提取，将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入10g的无水硫酸钠去除水。然后蒸馏除去绝大部分乙酸乙酯至200ml左右，冷却后过滤所得固体用10ml预冷的乙酸乙酯洗涤得到粗纯品，粗纯品用4-甲基-2-戊酮结晶两次得到纯品。
b发酵液离心，上清液用500ml的乙酸乙酯提取一次，然后加热减压除去乙酸乙酯，所得固体用丙酮溶解。菌体先后用500ml和300ml 80％的丙酮提取，然后将所有丙酮溶液合并，加热减压除去丙酮后得到的浆状物过滤得到粗品，粗品用甲醇溶解后用活性炭脱色，然后加热减压除去甲醇后用乙酸正丁酯结晶两次，但仍有较多杂质不能分离，因此纯度较低。
c发酵液离心，上清液用500ml的乙酸乙酯提取一次，菌体先后用500ml和300ml丙酮提取，然后将所有丙酮溶液合并，加热减压除去有机溶剂后得到的浆状物先后用1.5L和1L的乙酸乙酯萃取。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入10g的无水硫酸钠去除水。然后蒸馏除去绝大部分乙酸乙酯至150ml左右，冷却后过滤所得固体用10ml预冷的乙酸乙酯洗涤得到粗纯品，粗纯品用4-甲基-2-戊酮结晶两次得到纯品。
d菌体先后用500ml和300ml甲醇提取，其他同方法c。
e菌体先后用500ml和300ml乙醇提取，其他同方法c。
五种提取方法的结果见表1，有表可知c，d和e三种方法的提取效果明显的要好于a，b，两种现有提取方法。
表1 五种提取方法的比较
本发明的方法由于改进了提取方式，使微生物转化产物I的提取效率明显的提高，产物的收率可达到将近90％，由去氢表雄酮转化制备I的总收率可达到75％，从而有效地提高了去氢表雄酮转化合成I的总收率，降低I的生成成本。
附图说明
图1为不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮的提取效率。
具体实施方式
实施例：1
底物投料浓度为8g/L，转化率为85.1％的1L发酵液离心(转速4000rpm，时间15分钟)。上清液用1L的乙酸丙酯萃取；菌体0.24kg先加入1.2L的100％丙酮常温搅拌浸泡4小时后过滤，菌体再用0.8L的100％丙酮以同样方法再提取一次。两次提取得到的丙酮溶液混合，蒸馏除去溶液中的有机溶剂后，先后用3L和2L的乙酸丙酯萃取。将所有的萃取液合并，加入10g无水硫酸钠去除水。然后蒸馏除去绝大部分乙酸乙酯至200ml左右，冷却至室温放置2小时后过滤得到的固体用20ml预冷的乙酸丙酯洗涤，然后用30ml甲醇加热溶解，再加入200ml4-甲基-2-戊酮，加热到55℃蒸馏除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶体形成时停止蒸馏，放置冷却至室温结晶4小时，过滤得到晶体再用同样方法重结晶一次得到纯度为98.2％的产物6.02g。
实施例2
底物投料浓度为8g/L，转化率为85.1％的1L发酵液离心(转速4000rpm，时间15分钟)。上清液用1L的乙酸丙酯萃取；菌体0.24kg先加入1.2L的100％甲醇常温搅拌浸泡4小时后过滤，菌体再用0.8L的100％甲醇以同样方法再提取一次。两次提取得到的甲醇溶液混合，蒸馏除去溶液中的有机溶剂后，先后用3L和2L的乙酸丙酯萃取。将所有的萃取液合并，加入10g无水硫酸钠去除水。然后蒸馏除去绝大部分乙酸乙酯至200ml左右，冷却至室温放置2小时后过滤得到的固体用20ml预冷的乙酸丙酯洗涤，然后用30ml甲醇加热溶解，再加入200ml4-甲基-2-戊酮，加热到55℃蒸馏除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶体形成时停止蒸馏，放置冷却至室温结晶4小时，过滤得到晶体再用同样方法重结晶一次得到纯度为98.9％的产物5.96g。
实施例3
底物投料浓度为8g/L，转化率为85.1％的1L发酵液离心(转速4000rpm，时间15分钟)。上清液用1L的乙酸丙酯萃取；菌体0.24kg先加入1.2L的100％乙醇常温搅拌浸泡4小时后过滤，菌体再用0.8L的100％乙醇样方法再提取一次。两次提取得到的乙醇溶液混合，蒸馏除去溶液中的有机溶剂后，先后用3L和2L的乙酸丙酯萃取。将所有的萃取液合并，加入10g无水硫酸钠去除水。然后蒸馏除去绝大部分乙酸乙酯至200ml左右，冷却至室温放置2小时后过滤得到的固体用20ml预冷的乙酸丙酯洗涤，然后用30ml甲醇加热溶解，再加入200ml4-甲基-2-戊酮，加热到55℃蒸馏除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶体形成时停止蒸馏，放置冷却至室温结晶4小时，过滤得到晶体再用同样方法重结晶一次得到纯度为97.8％的产物5.89g。
实施例4
底物投料浓度为8g/L，转化率为85.1％的1L发酵液离心(转速4000rpm，时间15分钟)。上清液用1L的乙酸乙酯萃取；菌体先用2L 85％丙酮溶液提取，再用0.6L 85％丙酮溶液提取，其他同实施例1，最后得到98.5％纯度的产物5.89g。
实施例5
底物投料浓度为8g/L，转化率为85.1％的1L发酵液离心(转速4000rpm，时间15分钟)。上清液用1L的乙酸丙酯萃取；菌体0.24kg先用85％甲醇溶液提取三次，用量均为0.6L，三次提取得到的甲醇溶液混合，蒸馏除去溶液中的有机溶剂后，先后用3L和2L的乙酸丙酯萃取。后续步骤同实施例1，最后得到98.3％纯度的产物5.93g。
实施例6
底物投料浓度为8g/L，转化率为85.1％的1L发酵液离心(转速4000rpm，时间15分钟)。上清液用1L的乙酸丙酯萃取；菌体0.24kg先后用1.5L和1L 85％乙醇溶液提取两次，两次提取得到的乙醇溶液混合，蒸馏除去溶液中的有机溶剂后，先后用3L和2L的乙酸丙酯萃取。后续步骤同实施例1，最后得到97.9％纯度的产物5.76g。
实施例7
底物投料浓度为8g/L，转化率为85.7％的5L发酵液离心(转速4000rpm，时间15分钟)。上清液用5L的乙酸乙酯萃取；菌体1.18kg先加入6L 95％丙酮溶液常温搅拌浸泡4小时后过滤，菌体再用4L的95％丙酮溶液同样方法再提取一次。两次提取得到的溶液混合，蒸馏除去溶液中的丙酮后，先后用15L和10L的乙酸乙酯萃取。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入50g的无水硫酸钠去除水。然后蒸馏除去绝大部分乙酸乙酯至800ml左右，冷却至室温放置2小时后过滤得到的固体用100ml预冷的乙酸乙酯洗涤，然后用100ml甲醇加热溶解，再加入800ml4-甲基-2-戊酮，加热到55℃蒸馏除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶体形成时停止蒸馏，放置冷却至室温结晶4小时，过滤得到晶体再用同样方法重结晶一次得到纯度为98.7％的产物30.58g。
实施例8
底物投料浓度为8g/L，转化率为86.1％的5L发酵液离心(转速4000rpm，时间15分钟)。上清液用5L的乙酸丁酯萃取；菌体1.21kg先加入8L 90％甲醇溶液常温搅拌浸泡4小时后过滤，菌体再用3L 90％甲醇溶液以同样方法再提取一次。两次提取得到的溶液混合，蒸馏除去溶液中的甲醇后，先后用15L和10L的乙酸丁酯萃取。将所有的乙酸丁酯萃取液合并，加入50g的无水硫酸钠去除水。然后蒸馏除去绝大部分乙酸丁酯至800ml左右，冷却至室温放置2小时后过滤得到的固体用100ml预冷的乙酸丁酯洗涤，然后用100ml甲醇加热溶解，再加入800ml4-甲基-2-戊酮，加热到55℃蒸馏除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶体形成时停止蒸馏，放置冷却至室温结晶4小时，过滤得到晶体再用同样方法重结晶一次得到纯度为97.9％的产物29.88g。
实施例9
底物投料浓度为8g/L，转化率为85.1％的5L发酵液离心(转速4000rpm，时间15分钟)。上清液用5L的氯仿萃取；菌体1.10kg先加入4L 90％乙醇溶液常温搅拌浸泡4小时后过滤，菌体再用相同方法提取两次。三次提取得到的溶液混合，蒸馏除去溶液中的乙醇后，先后用15L和10L的氯仿萃取。将所有的氯仿萃取液合并，加入50g的无水硫酸钠去除水。然后蒸馏除去绝大部分氯仿至800ml左右，冷却至室温放置2小时后过滤得到的固体用100ml预冷的氯仿洗涤，然后用100ml甲醇加热溶解，再加入800ml4-甲基-2-戊酮，加热到55℃蒸馏除去甲醇和部分4-甲基-2-戊酮，待有晶体形成时停止蒸馏，放置冷却至室温结晶4小时，过滤得到晶体再用同样方法重结晶一次得到纯度为98.1％的产物29.18g。
Claims (10)
1.7α，15α-二羟基雄烯醇酮的提取纯化方法，所述7α，15α-二羟基雄烯醇酮由去氢表雄酮经亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini AS 3.4486)生物转化而得，转化结束后，离心发酵液，用非极性有机溶剂萃取上清液，其特征在于，该方法包括离心后所得的菌体先用亲水性有机溶剂提取，再用非极性有机溶剂萃取的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
a)转化结束后离心发酵液，上清液用非极性有机溶剂萃取，菌体则用亲水性有机溶剂提取；
b)菌体提取后得到的溶液加热减压蒸去溶液中的有机溶剂后，再用非极性有机溶剂萃取；
c)将所有的非极性有机溶剂萃取液合并，去水，蒸馏除去有机溶剂，结晶两次即可得到高纯度的产物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的亲水性有机溶剂的用量为发酵液体积的至少0.5倍。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的亲水性有机溶剂的提取次数为至少2次。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的亲水性有机溶剂为醇溶液或酮溶液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的醇溶液为甲醇或乙醇，所述的酮溶液为丙酮。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述甲醇的浓度为80％～100％，所述乙醇的浓度为85％～100％，所述丙酮的浓度为85％～100％。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述甲醇和乙醇的浓度为90％，所述丙酮的浓度为95％。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非极性有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲烷、乙酸丙酯、丙酸乙酯或丙酸甲酯。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的非极性有机溶剂为乙酸乙酯。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100811 Termination date: 20151114 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |